大肠杆菌感受态细胞制备

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、实验目的1了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点。2了解和掌握质粒转化大肠杆菌细胞的原理和方法。二、实验原理在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术，外源DN只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源的一种特殊生理状态。大肠杆菌的感受态可用处理而诱导产生。将正在生长的大肠杆菌细胞在°C下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的大肠杆菌感受细胞迅速冷冻于C可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。在C下外源（质粒）可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（°C,秒）,诱导细胞吸收。转化了质粒的大肠杆菌随后在培养基中C培养小时，可使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上涂布生长。而没有转化的细胞则无法生长。三、实验仪器、材料和试剂1仪器：超净工作台、冷冻高速离心机、灭菌锅、恒温摇床、冰箱、超低温冰箱（-C）离心管、离心管、试管、培养皿、冰浴、加样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管须在用前灭菌，灭菌条件：C,分钟。2材料：大肠杆菌a或其他菌株。3试剂：（）液体培养基：（见质粒提取）（）固体培养基：（琼脂粉液体培养基）（）（）C/甘油以上溶液均需灭菌后使用，灭菌条件同上。（）固体培养基平板（）：培养基熔化后待其温度低于C时加入氨苄青霉素至终浓度为u，混匀后立即倒入培养皿（直径），待凝固后，于C倒置保存。四、实验步骤1感受态细胞的制备：（）接种大肠杆菌细胞单菌落于液体培养基中，7振荡培养过夜；（）按的比例将过夜培养物转接入液体培养基中，7振荡培养至（）每人取菌液迅速将培养物置于冰上，然后于C，离心i收集细胞沉淀；（）将细胞沉淀悬浮于冰冷的溶液，冰浴，于C,离心;（）用m冰冷的甘油悬浮沉淀，置冰上或c保存。2大肠杆菌的转化（）取一管的感受态细胞（u管），加入质粒混匀另一管加无菌重蒸水为对照；（）冰浴4（）2水浴热击；（）迅速冰浴；（）离心管加入°C预热的液体培养基（不含抗生素）m，于°c空气浴缓慢（）振荡6（）从离心管中取m菌液，涂布于含抗生素的固体培养基上，c温箱倒置培养以上，记录长出的菌落数。五、结果分析质粒的转化率：是指每m质粒所转化出的菌落数，即：转化率转化所得菌落数m附：提高转化率的关键i严格保持低温（C）,操作迅速、轻柔。；选用处于对数期生长的细胞，不超过.3冰浴过夜或c几小时后，细胞感受性较高。