食品中沙门氏菌检验

鸡肠中沙门氏菌检验摘要：为了学习和了解沙门氏菌属生化反应及其原理，掌握沙门氏菌属血清因 子使用方法和沙门氏菌属的国标检测步骤、方法和准备，对鸡肠中的沙门氏菌 进行检测研究，结果显示，在三塘铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试剂培养基中的反应 结果为可疑沙门氏菌属，但是沙门氏菌属生化反应初步鉴别的结果中，Ph72尿 素结果为阳性，氰化钾结果也为阳性，根据表 4 可知鸡肠中的菌属为非沙门氏 菌属。Abstract ：In order to learn and understand salmonella genera and principle, biochemical reactions of serum salmonella, use method and factors of salmonella detection methods and steps, gb, salmonella in chicken bowel to test research, the results showed that in the three pond iron gelatin and lysine decarboxylation enzyme reaction result for the reagent medium of salmonella suspicious of salmonella, but the results identified preliminarily biochemical reactions, Ph7.2 urea positive for KCN, positive, according to the results of that table 4 chicken bowel is for salmonella.关键词：沙门氏菌属 鸡肠 三塘铁 赖氨酸Keywords：Salmonella Chicken bowel TSI lysine前言：沙门氏菌是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的 革兰氏阴性菌。其种类繁多，少数能使人致病，其他可使动物致病，偶尔可传染 给人。主要引起人类伤寒、副伤寒以及食品中毒或败血病。在世界各地的食物中 毒中，沙门氏菌食品中毒常占首位或者第二位。沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙 门氏菌有2 500 个以上血型。因此，沙门氏菌的检测一直是沙门氏菌研究的核心 问题。沙门氏菌感染可引起人发热、胃痉挛性疼痛、腹泻，甚至形成菌血症而致死。 美国农业部2006年的资料显示， 鸡肉肠炎沙门氏菌污染越来越严重， 从2000 年到2005年的污染就提高了4倍； 巴西的鸡肉2和西班牙屠宰场鸡屠体3肠炎沙 门氏菌污染严重。无论是国际标准化组织的ISO6579:2OO2,还是我国的国家标 准GB/T4789.4-2008,都是通过细菌分离鉴定进行污染检测。食品中沙门氏菌 传统的检测方法有5个不同价段或步骤：前增菌；选择性增菌；选择性平 板分离；生化试验，鉴定到属；血清学分型鉴定。目前检测食品中的沙门 氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。目前,为了寻求快速、准确、简便、微量的检测技术和方法,国内外学者进 行了大量的研究，多聚酶链反应（PolymeraseChain Reaction, PCR）技术是由美 国科学家Kary Mullis等首创，具有敏感性高、特异性强和快速等优点，其试 剂已商品化， 现已用于动物性食品中多种病原性细菌的检测6，7 。本实验运用 传统的检测方法对沙门氏菌进行检测。1 材料与方法1.1 设备和材料1.1.1 冰箱：2T5°C。1.1.2 恒温培养箱：36C±1°C, 42C±1°C1.1.3 均质器。1.1.4 电子天平：感量 0.1g。1.1.5 无菌锥型瓶：容量 500ml,250ml。1.1.6 微量移液器及吸头。1.1.7 无菌培养皿：直径 90mm。1.1.8 振荡器。1.1.9 无菌试管：3mmX5mm、10mmX75mm。1.1.10 无菌毛细管。1.1.11 精密 pH 试纸。1.1.12 三角烧瓶。1.2 培养基和试剂1.2.1缓冲蛋白胨水（BWP）：称取20.1g,加蒸馏水1L,搅拌加热煮沸至完全 溶解，分装三瓶，121C，灭菌15min。1.2.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：称取93.6g,加蒸馏水1L,搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，121C，灭菌20min，此上配制的为基础液，冷却至30C，每10ml基础液加入碘液2ml，0.1%煌绿液1ml， 混匀备用。1.2.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：称取23.0g，加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，无需高压灭菌，冷却至常温立即使用。1.2.4亚硫酸铋（BS）琼脂：称取39.3g,加蒸馏水950ml,搅拌加热煮沸至完 全溶解，无需高压灭菌，为基础液；称取8g指示剂，加水50ml,水浴50°C 左右，搅拌溶解，将50ml指示剂加入950ml已冷却到50C的基础液，混 匀后立即倾注平板。1.2.5 HE （Hektoen Enteric）琼脂：称取90.8g，加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸 至完全溶解，无需高压灭菌，冷却到50C，立即倾注平板。1.2.6 三糖铁（TSI）琼脂：1.2.7 蛋白胨水、靛基质试剂：1.2.8 尿素琼脂（PH7.2）：1.2.9氰化钾（KCN）培养基及其对照氰化钾培养基：1.2.10 赖氨酸脱羧酶试验培养基及其对照培养基：1.2.11 甘露醇及山梨醇培养基：1.2.12邻硝基酚B -D半乳糖苷（ONPG）培养基：1.3 检验程序1.3.1 沙门氏菌检验程序见图 1.图 1 沙门氏菌检验程序1.4操作步骤1.4.1 培养基的配制按照1.2 的部分配制。1.4.2 前增菌称取25g样品放入盛有25mlBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打90S。样品为液态，直接进行培养，于36°C±1°C培养8h18h。1.4.3 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取5ml,转种于lOmlTTB内；于42°C土 l°C,18h24h 培养。同时，另取 5ml,转种于 lOmlSC 内，于 36°C± l°C,18h24h 培养。1.4.4 分离分别用接种环取经TTB增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE 琼脂平板。同时，另取SC增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE 琼脂平板。于36°C±1°C分别培养18h24h （HE琼脂平板）或40h48h（BS琼脂 平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表 1。表1沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌菌落为黑色有金色光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈 BS 琼脂黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为HE 琼脂黄色，中心黑色或几乎全黑色1.4.5 生化试验1.4.5.1 接种生化培养基 自选择性琼脂平板上，分别挑取两个以上典型或可以菌落，接种到三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种环不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试 验培养基和对照管，并加入已灭菌液体石蜡3-4滴覆盖培养基表面。于36C±1C 培养18h24h,必要时可延长至48h。接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基、甘露醇和山梨 醇试验。所有试管于36°C±1°C分别培养18h24h，必要时可延长至48h,按表3判 定结果。讲已挑菌落的平板储存于2°C5°C或温室至少保留24h，以备必要时复 查。1.4.5.2 生化结果观察与判断1.4.5.2.1 在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌的反应结果 见表 2。表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢- + (-)+ (-)+可疑沙门氏菌属+(-)+(-)-可疑沙门氏菌属+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属+ / -+ / -非沙门氏菌属注：+阳性，阴性；+ ()多数阳性，少数阴性；+/阳性或阴性。表2 说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴 性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙 门氏菌属的可能。1.4.5.2.2通过TSI反应中的H2S、靛基质试验、尿素琼脂(pH7.2)、KCN实验 结果，查表3 讲可疑反应分为 A1、 A2、 A3。表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴定表反应序号硫化氢(H2S)靛基质氰化钾pH7.2 尿素(KCN)赖氨酸脱羧酶A1+-+A2+-+A3-+/-注：阳性, 阴性；/阳性或阴性。1.4.5.2.3反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨 酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门 氏菌。表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表PH7.2尿素 氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）+沙门氏菌W和V （要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴 定结果）注：+阳性，一阴性。1.4.5.2.4反映序号A2：做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。1.4.5.2.5反应序号A3：做ONPG, ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。ONPG 试验结果为深黄色是阳性，淡黄色为阴性。必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别项目IIIIII山梨醇+ONPG+氰化钾+( KCN)卫矛醇+水杨苷 +丙二酸盐+注：+阳性，一阴性。2 实验结果与分析2.1 沙门氏菌检测结果如表 6斜面一pH72尿素一底层+KCN+三糖铁琼脂产气+ (-)靛基质-硫化氢+ (-)甘露醇-赖氨酸脱羧酶试验培养基一山梨醇-注：阳性, 阴性；（）多数阳性，少数阴性；/阳性或阴性。 2.2实验分析从三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果，查看表 2可知菌属 为可疑型沙门氏菌属，查表 3 发现氰化钾和赖氨酸脱羧酶两项结果为异常，所以 检测结果为非沙门氏菌属。3 实验结论和讨论综合以上生化试验的结果，25g样品中样品未检出沙门氏菌属。讨论：鸡肠中存在沙门氏菌属的机率很大，但是实验结果显示为非沙门氏菌 属，可见实验结果的正确性可信性不高，实验过程中可能存在操作失误或者其他 原因导致实验偏差，应该重新做实验，严格按照国标再次进行试验，提高实验的 准确性和可信度。参考文献1 王高产,孙振钧. 沙门氏菌的检测方法 .SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科 学,2009年, 第12期:30-312 HERNANDEZ T, SIERRA A, RODRIGUEZ-ALVAREZ C,et al. 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