ly1.1DNA重组技术的基本工具.ppt

乳汁中含有人生长激素 的转基因牛 (阿根廷 ) 转鱼抗寒基因 的番茄 基因工程： 基因工程 是指按照人们的愿望 ,进行严 格的设计 ,并通过 体外 DNA重组 和 转基因等 技术 ,赋予生物以新的 遗传特性 ,从而创造 出更符合人们需要的新的 生物类型 和 生物 产品 。由于基因工程是在 DNA分子水平上 进 行设计 施工，因此叫做 DNA的重组技术 。 注：基因工程能定向改造生物的遗传性状 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 实质（原理） 结果 基因拼接技术或 DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 人类需要的基因产物 剪切 拼接 导入 表达 (人工）基因重组 转基因抗虫棉 抗虫棉 普通棉 基因工程培育抗虫棉的简要过程： 普通棉花 (无抗虫特性 ) 苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 与运载体 DNA拼接 导入 棉花细胞 (含 抗虫基因 ) 棉花植株 (有 抗虫特性 ) 上述培育抗虫棉的 关键步骤 是什么？ 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内 提取出来 关键步骤二： 抗虫基因 与运载体 DNA连接 关键步骤三： 抗虫基因 导入受体 (棉花 )细胞 1.1 DNA重组技术的基本工具： 1、限制性核酸内切酶 “分子手术刀” 2、 DNA连接酶 “分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车” 1、限制性核酸内切酶 2 特点： 识别 双链 DNA分子中 特定 核苷酸序 列，在 特定 的位点切割（特异性）。 1 分布： 主要在原核生物中 限制酶所识别的序列有 什么特点 ？ 限制酶所识别的序列，无论是 6个碱基还是 4个 碱基，都可以找到一条中心轴线 ,中轴线两侧 的双链 DNA上的碱基是 反向对称重复排列 的。 限制酶识别序列的中轴线 3 结果： 打开磷酸二酯键，产生黏性末端或平末端。 磷 酸 二 酯 键 G 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A 什么叫黏性末端？ 当限制酶 从识别序列的中心轴线两侧切 开时， 被限制酶切开的 DNA两条单链的切 口，带有几个 伸出的核苷酸 ，他们之间正 好 互补配对 ，这样的切口叫 黏性末端 。 EcoR 什么叫平末端？ 当限制酶 从识别序列的中心轴线处切 开时， 切开的 DNA两条单链的切口，是平 整的，这样的切口叫 平末端 。 1.黏性末端和平末端都由限制酶进行切割产生，下 列说法正确的是（ ） A.切割这两种末端可以用同一种限制酶 B.切割这两种末端需不同的限制酶 C.这两种末端可以相互拼接 D.拼接时，限制酶参与拼接过程 B 如果把两种不同来源的 DNA的用 同一种 限制 酶（如 EcoR ）来切割，会怎样呢？ 会产生互补的黏性末端，然后让两者 的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重 组的 DNA分子了。 二、 “ 分子缝合针 ” DNA连接酶 1、种类： 2、作用部位： Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA连接酶 可把黏性末端 之间的缝隙 “缝合” 起来，即把梯子两边扶手的断口连 接起来，这样一个重组的 DNA分子就形成了。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoR GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 不同来源的 DNA片段混合 将不同种来源的 DNA片段连接起来 生物 A基因片段 生物 B基因片段 G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G 酶切 P6 寻根问底： DNA连接酶与 DNA聚合酶是一回事吗？为 什么？ DNA连接酶与 DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 连接 DNA链 连接部位 模板 结果 双链 单链 DNA片段间形 成磷酸二酯键 单个核苷酸与 DNA片段间形 成磷酸二酯键 不需要模板 需要模板 将 DNA片段连接 成重组 DNA分子 合成新的 DNA分子 2.关于 DNA连接酶的叙述正确的是（ ） A.DNA连接酶将单个核苷酸连接到 DNA片段上 B.DNA连接酶将两条单链 DNA连接起来 C.DNA连接酶可形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶与 DNA聚合酶作用相同 C 要让一个从甲生物细胞内取出来 的基因在乙生物体内进行表达，首先 得将这个基因送到乙生物的细胞内去！ 能将外源基因送入细胞的工具就是运 载体。 三、 “ 分子运输车 ” 基因进入受体细胞的载 体 载体需要的条件： 有一个至多个限制酶切点（每种酶的切点最好只 有一个），以连接外源基因 对受体细胞无害 具有自我复制能力或整合到染色体的 DNA 上，随染色体 DNA进行同步复制 有某些标记基因，便于筛选 运载体的种类： 细菌的质粒 (plasmid) 噬菌体衍生物或某些动植物病毒 假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转 录，转基因生物能有预想的效果吗？ 作为分子运输车 载体，如果没有切割位点将 会怎样？ 霍乱菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它来做 分子运输车吗？ 目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 质粒是最常用的运载体之一，真正用于基因工程的质粒都是 在天然质粒基础上 人工改造 而成的。 能复制并带着插 入的目的基因一 起复制 有切割位点 有标记基因的存 在，将来可用含 青霉素的培养基 鉴别。 3.下列有关基因工程的叙述，正确的是（ ） A. 重组 DNA技术所用的工具酶是限制性核 酸内切酶、 DNA连接酶和载体 B. 所有限制性核酸内切酶都只能识别同一 种特定的核苷酸序列 C. 一般选用细菌的质粒作为基因进入受体 细胞的载体 D. 细菌体内的质粒可以直接作为基因工程 中的载体 C 4.下列关于质粒的叙述，正确的是（ ） A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒 状细胞器 B.质粒是细菌细胞质中能够自我复制的小型 环状 DNA分子 C.质粒只有在导入宿主细胞后才能在宿主细 胞内复制 D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外 独立进行的 B 限制酶在原核生物中作用： 切割外源 DNA，使之失效，从而达到保护身 的目的。 为什么限制酶不剪切自身的 DNA？ 1、其 DNA分子中或者不具备这种限制酶的 识别切割序列 2、或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别 序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 模拟制作： 用 EcoR 在特定部位对某载体 DNA进行模 拟切割，并将模拟毒蛋白基因取出，再用 胶纸模拟基因种间连接。 TCCTAG AGGATCTTAA AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA AATTCCATAC GGTATG ATAGCATGCTATCCATG TATCGTACGATAGGTACTTAA AATTCGGCATAC GCCGTATG 重组 DNA分子的模拟操作 基因表达载体的构建过程 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组 DNA分子（重组质粒） 同一种 一个切口 两个黏性末端 1下列四个 DNA分子片段，彼此间具有互 补黏性末端的一组是 （ ） A B C D 练习 B 2、 （双选）下列关于限制酶的说法不正确 的是（ ） A. 限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中 很少分布 B. 自然界中限制酶的天然作用是用来提取目 的基因 C. 不同的限制酶切割的切点不同 D一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸 序列 AB 3、图为 DNA分子在不同酶的作用下所发生的 变化，图中依次表示限制性内切酶、 DNA 聚合酶、 DNA连接酶、解旋酶作用的正确 顺序是（ ） A. B. C. D. C 4、 限制酶是一种核酸切割酶 ， 可辨识并切割 DNA分子上特定的 核苷酸碱基序列 。 下图为四种限制酶 BamH I， EcoR I， Hind 以及 Bgl 的辨识序列 。 箭头表示每一种限制酶的特 定切割部位 ， 其中哪两种限制酶所切割出来的 DNA片段末端 可以互补黏合 ？ 其正确的末端互补序列为何 ？ （ ） A. BamHI和 EcoRI；末端互补序列 AATT B. BamHI和 Hind ；末端互补序列 GATC C. EcoRI和 Hind ；末端互补序列 AATT D. BamHI和 BglII；末端互补序列 GATC D DNA 重组技术的基本工具 “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 限制酶 DNA连接酶 基因进入受体细胞的 载体 课本知识回顾 限制性核酸内切酶 主要是从 的一种酶。 识别双链 DNA 分子的某种 ， 并且使每一条链中 特定部位 的两个核苷酸之间 的 断开。 形成两种末端 原核生物中分离纯化出来 特定的核苷酸序列 磷酸二酯键 黏 性末端 平末端 二、 “分子缝合针” DNA连接酶 1、种类： 2、作用部位： 两类 Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 基因进入受体细胞的 载体 通常有三种 : 在进行基因工程操作中 ,真正被用作载体的质 粒都是在 基础上进行过 的 质粒 噬菌体衍生物 动植物病毒 天然质粒 人工改造