基因芯片对生物学的究进展的影响

生物芯片的应用简介生物芯片的应用简介雷安民雷安民西北农林科技大学西北农林科技大学 .干细胞研究中心干细胞研究中心西北农林科技大学西北农林科技大学 .动物医学院动物医学院对基础学科发展的影响对基础学科发展的影响芯片技术用于基因序列测定芯片技术用于基因序列测定 第一代的杂交测序；第一代的杂交测序；第二代的合成测序第二代的合成测序-单单/四核苷酸循环；四核苷酸循环；第三代的纳米芯片测序技术；第三代的纳米芯片测序技术；传统的基因测序方法 测序时分成四个单独的反应测序时分成四个单独的反应，每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸(称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后进行聚合反应。在聚合反应过程中，ddNTP 和dNTP会随机性的结合，一旦ddNTP加入了新合成的DNA链,由于其3位的羟基变成了氢,不能形成磷酸二酯键，所以不能继续延伸。由此产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA 序列。尿素变性的PAGE电泳胶杂交测序原理杂交测序原理杂交测序原理示意图杂交测序原理示意图新一代的测序原理新一代的测序原理第一步，基因组被打断为第一步，基因组被打断为100-200bps的片段的片段每个片段被接上接头序列每个片段被接上接头序列接头后的片段在片基上固定接头后的片段在片基上固定对应链的边合成边测序对应链的边合成边测序新型纳米孔测序法（新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达性，所以测序的准确度非常高。对于长达1,000个碱基的个碱基的单链单链DNA分子、分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如果对现测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现而帮助人们实现24小时内只花费小时内只花费1,000美元完成二倍体哺美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。乳动物基因组测序这一目标。2008年开始的第三代测序技术则是基于纳米孔年开始的第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。第望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。第三代测序技术的基本原理是在纳米孔中配置纳米三代测序技术的基本原理是在纳米孔中配置纳米电极，用电测方法测量一个电极，用电测方法测量一个DNA的核酸碱基排列。的核酸碱基排列。但是电测识别一个分子的技术开发极其困难，因但是电测识别一个分子的技术开发极其困难，因此尚未有验证该原理的实例。此尚未有验证该原理的实例。孔道蛋白：是金黄色葡萄球菌孔道蛋白：是金黄色葡萄球菌溶血素；溶血素；纳米孔道的电位测量；纳米孔道的电位测量；表达谱芯片的应用表达谱芯片的应用组织芯片组织芯片蛋白质芯片蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。子之间的相互作用关系。研究蛋白质芯片的意义研究蛋白质芯片的意义蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备蛋白质芯片检测蛋白质芯片检测 探针标记检测法探针标记检测法 无探针标记检测法无探针标记检测法p表面增强激光解吸离子化技术表面增强激光解吸离子化技术(Surface enhanced laser desorption/ionization,SELDI)p表面等离子体共振检测技术表面等离子体共振检测技术（surface plasmon resonance,SPR）p原子力显微镜检测技术原子力显微镜检测技术（atomic force microscope,AFM）p同位素标记检测同位素标记检测p荧光标记检测荧光标记检测p化学发光检测化学发光检测p酶免疫标记检测酶免疫标记检测p胶体金标记检测胶体金标记检测蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用u疾病诊断和预警疾病诊断和预警u药物开发药物开发u蛋白质组学蛋白质组学 定量检测组织提取液中的肿瘤标记物定量检测组织提取液中的肿瘤标记物孵育后的微阵列荧光图孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原含抗原 B 无抗原无抗原微阵列方法与微阵列方法与ELISA方法检出结果比较方法检出结果比较疾病诊断疾病诊断uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子尿激酶型纤溶酶原激活因子PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子血浆纤溶酶原激活因子抑制因子VEGF 血管内皮生长因子血管内皮生长因子高通量筛选蛋白高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂蛋白作用抑制剂药物开发药物开发A 1500 个点阵的微阵列个点阵的微阵列B 局部点阵放大图及局部点阵放大图及SPR信号信号His6-RB/GST-E7相互作用抑相互作用抑制剂筛选微阵列图制剂筛选微阵列图加入加入His6-RB加入含加入含 PepC抑制剂的抑制剂的His6-RB（1 1）疾病的蛋白质组研究）疾病的蛋白质组研究 通过比较正常与病理条件下细胞或组织中蛋白质在表达量上通过比较正常与病理条件下细胞或组织中蛋白质在表达量上的差异，可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋的差异，可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白。作为疾病诊断的生物标志物，认识发病机制，为早期诊白。作为疾病诊断的生物标志物，认识发病机制，为早期诊断治疗和预防提供线索，对疾病进程进行监测与控制。断治疗和预防提供线索，对疾病进程进行监测与控制。q 对肿瘤特异性生物标志物的检测；对肿瘤特异性生物标志物的检测；q 在糖尿病及心血管疾病方面的应用；在糖尿病及心血管疾病方面的应用；q 对类风湿性关节炎生物标志分子的检测；对类风湿性关节炎生物标志分子的检测；q 对人类细胞因子和趋化因子的测定和定量分析。对人类细胞因子和趋化因子的测定和定量分析。蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用（2 2）病原微生物的蛋白质组研究）病原微生物的蛋白质组研究 病原微生物蛋白质病原微生物蛋白质组研究对于阐明感染性疾病的发病机制，实现有效的组研究对于阐明感染性疾病的发病机制，实现有效的预防，早期诊断和治疗，制备新的药物等方面有着重预防，早期诊断和治疗，制备新的药物等方面有着重要意义。要意义。（3 3）在药物开发中的应用）在药物开发中的应用 在病理状态下表达异常或特在病理状态下表达异常或特异性表达的蛋白质，以及细胞信号传递通路中的关键异性表达的蛋白质，以及细胞信号传递通路中的关键性蛋白质，都可能成为药物设计的靶分子。性蛋白质，都可能成为药物设计的靶分子。（4 4）毒理学分析）毒理学分析 通过发生损伤的组织器官与正常组织器通过发生损伤的组织器官与正常组织器官之间的蛋白质组比较，有助于阐明药物毒副作用的官之间的蛋白质组比较，有助于阐明药物毒副作用的发生机制。发生机制。蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用 人动脉平滑肌细胞蛋白谱人动脉平滑肌细胞蛋白谱蛋白质组学蛋白质组学揭示了揭示了oxidized low density lipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式细胞经细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱作用后的蛋白谱检出检出298个蛋白个蛋白54个蛋白表达量发生变化个蛋白表达量发生变化4.7%抗原（一组细胞抗原（一组细胞-细胞间相细胞间相互作用分子）表达上调；互作用分子）表达上调；13.4%抗原抗原（结构蛋白，体液响结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降应蛋白）表达下降存在的问题存在的问题 成本过高，需一系列昂贵的尖端仪器成本过高，需一系列昂贵的尖端仪器 芯片的标准化问题芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等芯片背景对于结果分析的影响等等染色质免疫沉淀芯片染色质免疫沉淀芯片（Chip-Chip）ChiP-on-chip是染色体免疫共沉淀与芯片技术的结合，用于分析在活是染色体免疫共沉淀与芯片技术的结合，用于分析在活体细胞中调节蛋白与基因组体细胞中调节蛋白与基因组DNA之间的相互作用。该技术能够快速之间的相互作用。该技术能够快速在目标基因组的染色体中确定特异在目标基因组的染色体中确定特异DNA结合蛋白的准确结合位点，结合蛋白的准确结合位点，ChIP芯片也可以在一个基因组的任何感兴趣的区域内寻找染色体的芯片也可以在一个基因组的任何感兴趣的区域内寻找染色体的结构改变。结构改变。一、一、ChIP-Chip的用途的用途（1）在基因组范围内确定基因转录因子的）在基因组范围内确定基因转录因子的DNA结合位点和其他结合位点和其他DNA结结合蛋白或蛋白复合体的合蛋白或蛋白复合体的DNA结合位点。结合位点。（2）染色体活性状态的定量分析。）染色体活性状态的定量分析。（3）组蛋白修饰的功能研究。通过用酰基化或甲基化的组蛋白的特异）组蛋白修饰的功能研究。通过用酰基化或甲基化的组蛋白的特异抗体和没有进行修饰的组蛋白的特异抗体，可以确定与组蛋白修饰抗体和没有进行修饰的组蛋白的特异抗体，可以确定与组蛋白修饰有关的结合模式的变化。有关的结合模式的变化。（4）聚合酶活性的定量分析。）聚合酶活性的定量分析。（5）精炼生物信息方法，用功能数据来确定启动子的位置。）精炼生物信息方法，用功能数据来确定启动子的位置。交联与裂解细胞交联与裂解细胞超声破碎免疫共沉淀测序得到序列信息与基因组信息比对 ChIP-on-chip技术能为一些重要机制的研究提供线索，技术能为一些重要机制的研究提供线索，包括包括DNA复制、修饰、修复，更重要的还有甲基化以及复制、修饰、修复，更重要的还有甲基化以及组蛋白修饰等等；还能帮助我们更好的组蛋白修饰等等；还能帮助我们更好的 理解一些疾病的理解一些疾病的发生机理比如糖尿病、白血病、乳腺癌等。除此之外，发生机理比如糖尿病、白血病、乳腺癌等。除此之外，ChIP-on-chip技术也已在一些至关重要的生命过程中为技术也已在一些至关重要的生命过程中为我们提供了重要的线索，我们提供了重要的线索，包括细胞增殖、细胞分化、癌包括细胞增殖、细胞分化、癌症发生、细胞周期、细胞凋亡以及神经生成等过程。症发生、细胞周期、细胞凋亡以及神经生成等过程。研究基因启动子部位组蛋白的甲基化乙酰化或磷酸化水研究基因启动子部位组蛋白的甲基化乙酰化或磷酸化水平改变；平改变；研究基因启动子部位研究基因启动子部位DNA甲基化水平改变甲基化水平改变 研究转录因子与其结合的所有基因启动子研究转录因子与其结合的所有基因启动子DNAGeneChip-TilingArray技术简介技术简介Affymetrix公司于公司于2006年年1月月24日宣布推出日宣布推出GeneChip（R）人类和鼠源嵌合芯片（人类和鼠源嵌合芯片（TilingA，ray）系列产品。该系列芯）系列产品。该系列芯 片研究范围大大超出已知编码蛋白序列，可以对整个人类和片研究范围大大超出已知编码蛋白序列，可以对整个人类和小鼠基因组进行系统的研究小鼠基因组进行系统的研究嵌合芯片嵌合芯片（TilingArray）是迄今为止分辨率最高的基因芯）是迄今为止分辨率最高的基因芯片类型，其探针设计几乎涵盖了目标片类型，其探针设计几乎涵盖了目标DNA的全部序列。迄今的全部序列。迄今为止，为止，Affymetrix公司已经开公司已经开 发出了人、小鼠、酵母、线虫、发出了人、小鼠、酵母、线虫、拟南芥等模式生物的全基因组拟南芥等模式生物的全基因组Tiling芯片，为全基因组规模芯片，为全基因组规模上研究目的蛋白与核酸的相互作用提供了强有力的分析工具。上研究目的蛋白与核酸的相互作用提供了强有力的分析工具。GeneChip-TilingArray除了全基因组芯片外，还包括了专门除了全基因组芯片外，还包括了专门应用于应用于ChIPChip技术中的人启动子和小鼠启动子两款芯技术中的人启动子和小鼠启动子两款芯片，探针设计覆片，探针设计覆 盖了转录起始位点附近盖了转录起始位点附近10kb的范围，可针的范围，可针对肿瘤相关的对肿瘤相关的1 300个基因，覆盖范围更是增加到了个基因，覆盖范围更是增加到了12.5kb。液态芯片原理液态芯片原理 编码微球：分别用不同配比的两种荧光染料将直径编码微球：分别用不同配比的两种荧光染料将直径5.6m的聚苯乙烯微球（的聚苯乙烯微球（Beads）染成不同的荧光色，）染成不同的荧光色，从而获得多达从而获得多达100种经荧光编码的微球。种经荧光编码的微球。交联探针、抗体或抗原：把针对不同检测物的核酸探针、交联探针、抗体或抗原：把针对不同检测物的核酸探针、抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的微球上。抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的微球上。检测反应：先把针对不同检测物的、用不同荧光色编码检测反应：先把针对不同检测物的、用不同荧光色编码的微球混合，再加入被检测物（可以是血清中的抗原、的微球混合，再加入被检测物（可以是血清中的抗原、抗体或酶等，也可以是抗体或酶等，也可以是PCR产物）。产物）。悬液中的微球与悬液中的微球与被检测物特异性结合，结合物被标记上荧光物质。被检测物特异性结合，结合物被标记上荧光物质。