最小抑菌浓度的测定

几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法1.1. 常量肉汤稀释法1.1.1. 抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000M g/ml（如 1280卩g/ml）或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。 抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计 算。例如：需配制100 ml浓度为1280g/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉 剂，其药物的有效力为750g/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mgX750g/ml）/1280p g/ml=107.0ml,然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。 制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮 存于-60°C以下环境，保存期不超过6个月。1.1.2. 药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准, 药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。1.1.3. 培养基 NCCLS 推荐使用 Mueller-Hinton （MH）肉汤，pH7.27.4。需氧 菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时, 应在肉汤中加入2% （W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。 嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%5%溶解马血的 MH肉汤。1.1.4. 接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑 取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35°C孵 育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比 浊标准，约含1 2X108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如 流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直 接取培养1824h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌 悬液进行1：100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取 一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。1.1.5稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13X100mm） 13支，排成 一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加 入抗菌药物原液（如1280g/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml 弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、 32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种 物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5X105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度 分别为 128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125g/ml。1.1.6. 孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35C普通空气孵箱中孵育1620h； 嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球 菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。1.1.7. 结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管 的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污 染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌 生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断， 与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感（susceptible, S）或中介（intermediate, I）。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药 物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组 织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如0 -内酰胺 酶），所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效 低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如0 -内酰胺类药物）被抑制， 或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”， 以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。1.2. 微量肉汤稀释法1.2.1. 抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。1.2.2. MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到 灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10p 1,第12孔不加 药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20°C以下保存备用。1.2.3. 接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊 标准的菌悬液，经MH肉汤1 ：1000稀释后，向每孔中加1001，密封后置35C 普通空气孵箱中，孵育1620h判断结果。当试验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵 育时间为2024h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时 孵育时间必须满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.125 g/m1。1.2.4结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性 对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出 现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不 应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的 MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。2琼脂稀释法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50C左右 的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后 观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法 优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点 是制备含药琼脂平板费时费力。2.1. 培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟 菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5% （V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。2.2. 含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分 别加入已加热溶解，并在4550°C水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌 平皿，琼脂厚度34mm。通常按1：9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择 药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置28C冰箱可贮 存5天。2.3. 接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1：10 稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约 12 1）接种于琼脂平板表面，每点 菌数约为104CFU，形成直径为58mm的菌斑。接种好后置35C孵育1620h （甲 氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈 瑟菌属、链球菌属细菌置 5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。2.4. 结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌 生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌 生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度 药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或 重复试验。3.E试验（E-test） E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法， 即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度 范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩 散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量 测出抗菌药物对受试菌的 MIC。3.1. 培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。3.2. 贴E试验条同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触 琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般 只能放置 1 根。3.3. 孵育时间和温度 同纸片扩散法。3.4. 结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的 横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意 的问题见供应商的产品说明书