中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定

项目一项目一从菠萝中提取菠萝蛋白酶微生物09301班第三实验小组成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙一、实验目的一、实验目的1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶；2、掌握对目的蛋白酶质量的检验；3、学习酶比活力的计算；二、实验基本原理二、实验基本原理 菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55。本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。三、实验材料和试剂三、实验材料和试剂1、实验材料、实验材料 新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白2、实验试剂、实验试剂柠檬酸钠柠檬酸钠 维生素维生素c 单宁单宁 0.1%EDTA溶液溶液1.5%氯化钠溶液氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化氢氧化钠溶液钠溶液0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至至7.0）激活剂（激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用现配现用）四、实验器材和仪器四、实验器材和仪器1、榨汁机；2、离心机；3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；4、恒温水浴锅（37）；5、试管、试管架；6、烧杯、容量瓶；7、移液管；五、实验操作方法法和步五、实验操作方法法和步骤（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎加柠檬酸钠，榨汁菠萝汁纱布过滤澄清液2000r/min，7min离心上清液沉淀物酶复合物酶复合物沉淀加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液4200r/min,5min离心加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心冻存备用（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量1、标准曲线的制作 按下表操作试管号试管号12345678 标准蛋白（0.1mg/ml)00.10.20.40.60.81.00待测酶蛋白(ml)00000001.0磷酸缓冲液(ml)1.00.90.80.60.40.200考马斯亮蓝(ml)44444444吸光度A00.1150.1480.2450.3950.5250.5820.140（稀释5倍）根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量（三）菠萝蛋白酶活力的测定1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；3、另取5支试管，分别对应标号、，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；4、将10支试管置于37水浴；5、然后按下表操作试管号试管号123451%酪蛋白（ml)0.20.40.60.70.86、按步骤5混匀，在37水浴下反应水浴下反应10 min;10 min;7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，于室温放置30min;8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度9、测定结果如下试管号试管号12345吸光度A0.6430.7330.8681.0191.232由于吸光度在0.20.8之间较准确，故上述数据中可以选择第三组数据进行处理计算（四）数据的处理1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528%（五）结果讨论从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。