广西地方标准《水牛胚胎质量检测技术规程》（征求意见稿）

43 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 5/T 2017 水牛胚胎质量检测技术规程 in of 征求意见稿） 2017 - 布 施 广西壮族自治区质量技术监督局 发布 2017 I 目 次 前言 . 范围 . 1 2 规范性引用 文件 . 1 3 术语与定义 . 1 4 抽样和胚胎的保存 . 1 5 检测环境 . 2 6 检测方法 . 2 7 结果表述 . 3 附录 A（规范性附录） 试剂、耗材和设备 . 4 附录 B（规范性附录） 冷冻胚胎解冻方法 . 6 附录 C（规范性附录） 胚胎图片示例 . 7 2017 言 本标准按照 2009 给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位： 广西壮族自治区水牛研究所 。 本标准主要起草人： 郑海英、尚江华、杨春艳、张秀 芳、梁贤威、郑威、黄芬香、鄢胜飞、黄玥萌。 2017 1 水牛胚胎质量检测技术规程 1 范围 本标准规定了水牛胚胎形态评定和发育情况检测技术规程。 本标准适用于体内或体外来源的新鲜胚胎和冷冻胚胎的质量检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 18088 出入境动物检疫采样 5458 液氮生物容器 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 超低温保存 特殊方法处理的胚胎放置在 196 的超低温度中，使其新陈代谢暂时停止，从而将胚胎进行长期保存。 胚胎解冻 冷冻保存的胚胎按一定的程序和方法在空气和水浴中解冻，并脱除冷冻保护剂，使胚胎恢复正常的形态和新陈代谢的过程。 胚胎体外培养 in 模拟体内子宫环境和条件下，胚胎在体外继续发育的过程。 4 抽样和胚胎的保存 样 生产方或使用方抽取胚胎样品进行检测，对胚胎整体质量进行评判的方法，抽样 方法和数量参照 18088。 胎的保存 2017 2 胚胎应保存在 196 的液氮环境中，存放冷冻胚胎的低温容器应符合 5458的规定。 取放胚胎时，在空气中暴露时间不能超过 10 s。 胚胎保存期间，要定期检查容器中液氮消耗情况，适时补充液氮，确保保存胚胎的细管在液氮液面以下。 息的记录 抽样时，应详细记录保存胚胎细管上标记的完整信息。 5 检测环境 应在洁净无菌环境条件下进行检测。 6 检测方法 谱资料 待检胚胎应有完整的系谱资料 (适用于体内胚胎和体外胚胎 )。 识 保存胚胎的细管应有明确的标记，标记内容应包括品种、公母牛 编号、胚胎数量、胚胎发育阶段、胚胎质量级别、生产日期、生产单位等，标记上的字迹清晰、完整、准确，并做好存放记录。 剂、耗材和设备 胚胎质量检测所用试剂、耗材和设备见附录 A。 胎质量检测方法 胎的形态学检测 借助于体视显微镜对胚胎的发育阶段和状况进行形态学观察。 胎的体外发育能力评判 将胚胎置于 38 39 、 5二氧化碳和最大饱和湿度的环境下培养，并于开始培养后 24 8 冷冻胚胎应按照程序要求进行解冻后检测，胚胎解冻程序参见附录 B。 胎质量检测内容 胎 发育阶段 胚胎各个阶段主要特点如下： 1) 桑椹胚：受精后第 4 d 5 d 的胚胎，能观察到球状的细胞团，分裂球间隙不明显，占据透明带内腔的 50 60。 2) 致密桑椹胚：受精后第 5 d 6 d 的胚胎，细胞团变小，卵裂球之间界限难以分辨，细胞团与透明带之间空隙明显增大，占透明带内腔的 60 70。 2017 3 3) 早期囊胚：受精后第 6 d 7 d 的胚胎，内细胞团的一部分出现囊胚腔，但难以分清内细胞团和滋养层，细胞团占透明带内腔的 70 80。 4) 囊胚 : 受精后第 6 d 8 d 的胚胎，内细胞团和滋养层界限清晰，囊胚腔明显，细胞充满透明带内腔。 5) 扩张囊胚 : 受精后第 7 d 9 d 的胚胎，体积增至原来的 ，与透明带之间无空隙，囊胚腔明显扩大，透明带变薄。 6) 孵化囊胚 : 囊胚腔继续扩大，透明带破裂，胚泡从透明带中脱出。 胎发育状况 正常发育胚胎透明带完整，形态规则，色调均匀一致，透明度适中。根据形态学及发育程度划分胚胎质量，分为 A、 B、 C、 D 四个等级，参考图片参见附录 C。 级 胚胎的发育阶段与预期的发育阶段一致。胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，胚胎细胞团呈均匀对称的球形，透明带 光滑完整，厚度适中，不规则的细胞相对较少，变性细胞比例少于 10。 级 胚胎的发育阶段与预期的发育阶段基本一致。胚胎形态较完整，轮廓清晰，色调及细胞密度良好，透明带光滑完整，厚度适中，存在一定数量大小和形状不规则的细胞或细胞团，有一定数量细胞的颜色明暗不一、密度不均匀，变性细胞比例为 10 20。 级 胚胎的发育阶段与预期的发育阶段不一致。胚胎形态不完整，轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞较多，变性细胞比例为 30 40。 级 胚胎的发育阶段与预期的发育阶段不一致，包括退化的胚胎、未受精卵或 16细胞团有较多碎片、轮廓不清晰、结构松散，变性细胞比例高于 50，为不可用胚胎。 关要求 每次至少 2人参加检测，独立评定，得出综合评定结果。如果二者差异较大，另外安排 2人重新进行评定。 鉴定结果应做鉴定记录，资料存档备查。 7 结果表述 别为 38 39 、 5% 二氧化碳和最大饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养 24 h(或 48 h)，胚胎由 2017 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂、耗材和设备 要试剂及要求 剂名称 碳酸氢钠（ 乙二醇（ (,蔗糖、甘油、 素、 99、胎牛血清（ 、 牛血清白蛋白（ 剂要求 所用的试剂除特殊规定外，均为分析纯及其以上纯度的化学试剂，符合组织细胞培养要求。 99、胎牛血清等为推荐选用胚胎培养测试的产品。 胎体外培养液 推荐使用 25 +10% 清的灭活处理 新购的胎牛血清， 有些产品是已经经过灭活处理的，因此可以直接使用。但是一般没有特别注明的，可在水浴锅中 56 灭活 30 后分装成小瓶，于 或 超低温冰箱中长期保存备用。 要耗材 玻璃培养皿 ： 20 料培养皿（ ： 35 60 器 ： m、 m 加样器枪头（ 2 l， 20 l， 200 l， 1000 l） 加样器枪头盒（ 2 l， 20 l， 200 l， 1000 l） 料胚胎麦管 胚胎吸管 玻璃细管 ： 5 明硅胶软管 脱脂棉 纱布 封口膜 标签纸 记号笔 2017 5 一次性乳胶或 套 要设备 体视显微镜 二氧化碳培养箱 冰箱或冰柜 高压灭菌器 超净工作台 恒温热台 低温冰箱 电子分析天平（至少精确到 加样器（ 2 l， 20 l， 200 l， 1000 l） 超声波清洗仪 电热鼓风干燥箱 双重蒸馏器 超纯水仪 液氮生物容器 酒精灯 2017 6 B B 附 录 B （规范性附录） 冷冻胚胎解冻方法 油冷冻胚胎的解冻程序 冻液的配制 分别配制含 6、 3和 0甘油的 0.1 胎解冻 从液氮罐中取出装有胚胎的细管，室温下空气浴 10 s 后置于 35 37 水浴中，浸浴至胚胎冷冻细管内液体彻底融化。 除甘油 用消毒卫生纸擦干细管，剪去封口端，将胚胎推入培养皿中；将胚胎依次移入含 6、 3和 0甘油的 0.1 蔗糖胚胎 停留 5 最后用 次，即可进行镜检。 二醇冷冻胚胎解冻 将胚胎细管空气浴 10 5 37 水浴中，浸浴至胚胎冷冻细管内液体彻底融化， 用消毒卫生纸擦干细管，剪去封口端，将胚胎推入培养皿，用 次，镜检。 2017 7 C C 附 录 C （规范性附录） 胚胎图片示例 椹胚胚胎质量示例 图 胎质量 A 胚胎质量 B 胚胎质量 C 胚胎质量 C 胚胚胎质量示例 图 胎 质量 A 胚胎质量 A 胚胎质量 B 胚胎质量 C 级胚胎质量示例 受精卵 异胚 胎 2017 8 _