《乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的测定》 编制说明

1 乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的测定 （ 征求意见 稿） 编 制 说 明 国家农业深加工产品质量监督检验中心 (吉林省产品质量监督检验院 ) 二 一二 年 十二 月 2 目 录 一、 制定标准的必要性和意义 3 二、 工作简况 3 三、 研究路线，与现有标准的关系 4 四、 主要试验的研究论证报告和技术性能分析 4 1、标准的名称 4 2、标准的范围 4 3、方法原理 4 4、前处理条件 4 5、仪器分析条件 4 6、 气相色谱 6 7、 方法 检出限 7 8、 方法 回收率 7 9、 方法精密度 8 五 、方法验证 10 六 、 验证结论 11 七 、 实际样品验证 11 3 一 、 制定标准的必要性和意义 环己基 氨基磺酸 钠 俗称 甜蜜素， 分子式 分子量 另有资料称 工业上 是由 氨基磺酸 与 环 己 胺 及 氢氧化钠 反应而成 ， 其 甜 度 是 蔗 糖 的 30 40 倍 ；如果与蔗糖和有机酸配合使用，甜度可达 100 倍以上。 环己基 氨基磺 酸 钠 是 一种广泛应用于 食品 工业的 添加剂 。 但是，现代医学证据表明，长期 摄入过量的 环己基 氨基磺酸 钠 ， 可能 会 对人体的 肝脏 和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒的能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显。 1969 年美国国家科学院研究委员会收到有关甜蜜素：糖精 =10:1 混合物可致膀胱癌的动物实验证据，不久后美国食品与药物管理局即发出了全面禁止使用的命令 ， 英、日、加拿大等国随后也禁用。 这些禁用令沿用至今，使得 环己基 氨基磺酸 钠 的使用安全性问题日益突出。 牛乳是老百姓餐桌上常见食品，各类含乳制品更是种类繁多， 消费群体几乎囊获了从 新生儿到老年人的所有年龄段适宜人群。 我国现阶段允许部分含乳制品中使用 环己基 氨基磺酸 钠 作为添加剂，但严格规定使用限量；在乳粉及纯液体牛乳中不允许使用 环己基 氨基磺酸 钠 。但是，在市场上已经发现不法企业企图通过非法添加了 环己基 氨基磺酸 钠 的手段达到改善产品口感的目的，从而提高产品销量（纯液体牛乳产品）， 非法 获得 利益；某些生产者为降低成本，在含乳饮料 中超量使用 环己基 氨基磺酸 钠 。 以上事实表明，急需加强 乳制品及含乳饮料中 环己基 氨基磺酸 钠 的检测能力 。但目前国内尚未建立针对 乳制品及含乳饮料中的 环己基 氨基磺酸 钠 进行检测的方法。 为 对 乳制品及含乳饮料 制品 进行严格控制，维护消费者利益，特别是保障婴幼儿健康茁壮成长， 也为将 可能出现的食品安全 问题 在尚未产生严重危害前即被发现和处理，为国内食品安全提供技术保障，为有关部门的监督管理提供技术支撑 ，需建立 乳制品及含乳饮料中 环己基 氨基磺酸 钠 的检测方法 。 二 、 工作简况 任务来源： 吉林省卫生厅 任务编号： 28草单位：国家 农业 深加工 产品质量监督 检验中心 吉林省产品质量监督检验院 1、 前期工作 本标准 的 起草参 考 1948文献 ， 结合我国国情和国内实验室的特点， 确定使用 液相色谱 质谱仪和 气相色谱 仪 测定 乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠 含量，建立了一个 快速 灵敏、选择性好、 准确性高、 能为我国大多数检测机构所使用的方法， 为 乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠 含量的检测提供了重要的依据，也对其他同类产品中 环己基氨基磺酸钠 含量的检测提供了参考。 同时对确定的检测方法进行检出限、回收率、精密度等试验， 据此 向吉林省卫生厅标准审定委员会 提出 地方 标准制定的申请 。 2、 实 验室间验证工作 2012 年 7，我们邀请吉林省 出入境 检验检疫 局、吉林省疾病控制中心、吉林大学、 长春应化所 、 长春市产品质量监督检验院 等单位进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、最低检出限等。参加验证的实验室一致认为：该 方法适用于测定 乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠 的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点 。 4 三 、 研究路线，与现有标准的关系 本标准编制遵循 “先进性、实用性、统一性、规范性 ”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操 作性，严格 按 照 准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写规则和 准编写规则 第 4部分：化学分析方法的要求编写的。 课题组 针对现行标准中 对样品 复杂性 考虑 的不足， 在使用 液相色谱 质谱仪 检测 时 选择“提取净化 直接进样分析”的 技术路线 ； 在使用 气相色谱仪检测时 选择“提取 净化 衍生 进样分析”的技术路线，即丰富了检测手段，又有效利用了设备的优势，形成优势互补 ，极大提高了 试验效率 和数据可信性 。 本标准可作为广大生产企业、质检机构、第三方检验机 构及其他相关单位对 乳制品及含乳饮料中 环己基氨基磺酸钠 检测时的参考标准使用。 四 、 主要试验的研究论证报告和技术性能分析 1、 标准 的名称 本标准利用 液相色谱 质谱仪和 气相 色谱仪解决 乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠 测定的技术问题， 因同时采用两种不同类型检测手段， 所以将本标准的名称定为： 乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的测定 。 2 标准的范围 纯牛乳产品、 以牛乳为主 要原料 的 液体 乳制品 产品 及含 牛乳 的 乳饮料 产品。 3 方法原理 样经提取 、除蛋白、 净化 后，用液相色谱 质谱仪 检测， 外标法定量； 样经提取 、除蛋白、衍生、 净化 后，用 气相色谱仪检测， 外标法定量 。 4 前处理 条件 牛乳 成分复杂， 其 中 的蛋白质、脂肪等大分子成分对 环己基氨基磺酸钠 的提取和测定会产生不利影响。课题 组选择了先沉淀后提取的方法，最大限度的减少杂质对检测结果的干扰，再针对不同检测仪器的需要，分类处理提取液。 5 仪器分析 条件 谱的选择 甜蜜素 分子量较小， 易 溶于 水 ， 极性较 强 。 课题组考虑到 液相色谱 质谱仪的快速性和 气相色谱仪 的 普遍性，确定 分 别使用两种设备 进行方法学的研究 。 谱 条件 的 优化 实验过程中通过对色谱条件规定的参数要求进行了多次调整，以使仪器的灵敏度、稳定性和分离效率均处于最佳状态，获得满意的分离效果，达到回收率的要求。经过多次的试验摸索，确定试验参数。 谱柱的选择 课题组 在进行 液相色谱 质谱仪的方法研究过程中，分别 使用 离子交换柱、阳离子交换柱 进行分析测定 ； 在进行 气相色谱仪的方法研究过程中， 选择使用 验表明， 经 0m×离得到的色谱图分离度 、响应值均 较理想 ，能满足检测要求且能有效的与干扰物质进行分离。 谱条件的选择 因为实际样品中含有大量 干扰物 ，对检测目标影响较大。 在 实际摸索并 参阅相关文献的基础上，我 5 们对 温度程序 进行选择比较， 在保证分离度、峰形和对仪器的保护等多方面考虑，选择 ： 液相色谱 质谱条件： 色谱柱：强阳离子交换柱（ 150 m）； 流动相： 甲酸溶液 (乙腈 (95+5； 流速 ： 0.4 mL/ 进样量 ： 2 L； 柱温： 30 ； 离子源（ 度： 230 ； 离子源（ 子轰击能量： 70 多反应监测方式（ 监测离子（ m/z） 178、 80， 其中 178为定量离子。 气相色谱条件： 80 恒温至目标物流出 。 以上条件下 得到的 质谱峰、 色谱峰 峰 形 较好，柱效较高，且与干扰 物 完全分离。 图 1 环己基氨基磺酸钠 标准品 液相色谱 质谱 总离子流图 图 2 环己基氨基磺酸钠 的 液相色谱 质谱 图 6 图 3 环己基氨基磺酸钠 的 气相色谱 图 取溶剂 的 选择 课 题组 针对气相色谱法 挑选了乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇 、乙醚等溶剂作 萃取 效果比对实验。其中甲醇和乙腈与水互溶， 萃取效果 不 佳 ； 乙酸乙酯共萃物多，干扰严重； 乙醚 挥发性强 ， 提取效率相对较低； 正己烷 的提取效率较高， 提取液 对 仪器响应值较理想， 且与水分层效果较好，后续处理简便 。综上，课题组选择乙酸乙酯作为 萃取 溶剂。 在进行 液相色谱 质谱 法 研究的过程中，由于 环己基氨基磺酸钠 易溶于水，故不用特意选择萃取溶剂。 6 线性范围 相色谱 质谱 法线性范围 50 甜蜜素 系列标准溶液用 液相色谱 质谱 仪检测得出的一系列峰面积与浓度的对应点，连点成线，得到拟合标准曲线。可见在 50 浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围，可以对其进行稀释。标准曲线 及曲线方程见 图 4。 相色谱 法线性范围 10 1000 甜蜜素 系列标准溶液用 气 相色谱 仪检测得出的一系列峰面积与浓度的对应点，连点成线，得到拟合标准曲线。可见在 10 1000 浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围，可以对其进行稀释。标准曲线 及曲线方程见 图 5。 图 4 环己基氨基磺酸钠 在 液相色谱 质谱上的 标准曲线图 7 y = = 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0系列 1线性 ( 系列 1)图 5 环己基氨基磺酸钠 在 气相色谱上的 标准曲线图 7 方法检出限 根据 A 谱法中的计算方法 。 检出限 =S/b b 标准曲线回归方程中的斜率。 S 仪器噪声的 3 倍 。 确认 液相色谱 质谱 法 试样检出限为 气相色谱法 试样检出限为 10mg/ 8 方法 的回收率 根据 们选用 3个 样品， 每种样品 加入三个水平的 环己基氨基磺酸钠 标准溶液，按照送审稿的样品处理方法 和 色谱条件 ， 进行回收率的测定， 计算出每个添加水平的回收率 。方法回收率 结果见表 1。 表 1 样品回收率 编号 样品名称 拟采用方法 添加量（ mg/ 平均实测值 （ mg/ 平均回收率 % 1 纯液体乳 S 02 25 0 C 10 00 000 含乳饮料 S 8 25 8 50 C 10 00 000 发酵乳 S 7 25 0 C 10 00 000 方法的精密度 表 2 国家农业深加工产品质量监督检验中心实验室内精密度 拟采用方法 液相色谱 质谱 法 气相色谱法 重复次数 环己基氨基磺酸钠 添加水平 mg/ 均值 准偏差 对标准偏差 % 方法验证 由我中心统一制备样品，同时发送到 5 个参加方法验证的实验室进行验证，每个实验 室取 6 次 测定结果 ，详 见表 3 表 3 机构 1对 环己基氨基磺酸钠 检测 的 精密度 (mg/拟采用方法 液相色谱 质谱 法 气相色谱法 重复次数 环己基氨基磺酸钠 添加水平 mg/ 9 6 均值 准偏差 对标准偏差 % 4 机构 2对 环己基氨基磺酸钠 检测 的精密度 (mg/拟采用方法 液相色谱 质谱 法 气相色谱法 重复次数 环己基氨基磺酸钠 添加水平 mg/ 均值 准偏差 % 对标准偏差 % 5 机构 3对 环己基氨基磺酸钠 检测 的精密度 (mg/拟采用方法 液相色谱 质谱 法 气相色谱法 重复次数 环己基氨基磺酸钠 添加水平 mg/ 均值 准偏差 对标准偏差 % 6 机构 4对 环己基氨基磺酸钠 检测 的精密度 (mg/拟采用方法 液相色谱 质谱 法 气相色谱法 重复次数 环己 基氨基磺酸钠 添加水平 mg/ 均值 10 标准偏差 对标准偏差 % 7 机构 5对 环己基氨基磺酸钠 检测 的精密度 (mg/拟采用方法 液相色谱 质谱 法 气相色谱法 重复次数 环己基氨基磺酸钠 添加水平 mg/ 均值 准偏差 对标准偏差 % 验证结论 经实验验证：修订后的新方法在精密度、重现性、再现性、检出限等方面完全达到了测定 牛乳 中 雄激素 的要求，其方法方便、快捷，应广泛应用、列为国家标准。 七 实际样品测定 拟采用方法 液相色谱 质谱 法 气相色谱法 样品编号 环己基氨基磺酸钠 mg/ 2 3 4 5 6 352 401 7 770 792 8 1145 1128 9 552 535 10 496 518 11 222 200 12 613 622 13 181 124 14 15