细胞的复苏

一 实验名称：细胞的复苏二 实验目的：将冻存的细胞恢复活性三. 实验原理：在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料 悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一 温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过 程。而复苏就是将冻存在-196°C液氮中的细胞快速融化至37C,使细胞外 冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细 胞造成损害。四 实验步骤一. 实验前准备：1将水浴锅预热至37C, 将培养液预热后分装到培养皿中2. 离心管、吸管、培养瓶等等。二取出冻存管：1. 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2. 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。三迅速解冻：1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中 的液体迅速融化。2. 约 1-2min 后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再 拿入超净台内。四. 平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中 3000r/min 离心 3min五. 制备细胞悬液：1. 吸弃上清液。2向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。六细胞计数：细胞浓度以5x105/ml为宜。 七.培养细胞：将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37°C5% CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间 由细胞情况而定。初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37 C。2. 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。4. 一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。版本2一、细胞复苏的原则 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次 形成胞内结晶损伤细胞。二、细胞复苏的主要操作步骤（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。（2）迅速放入38C水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后 在无菌下取出细胞。（3）在1000r/min速度下离心510分钟，弃去上层液，加入适量培养液 后接种于培养瓶中，接种浓度1X109/L，置37C温箱静置培养，次日更换一次 培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心 直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养1224小时后，充去上清，换入 新鲜培养基继续培养。三、注意事项在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻 管，使之尽快通过最易受损的温度段（-50C）。这样复苏的冻存细胞存活率 高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会 有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻 倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。1.DMSO是细胞内防护液。DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持 细胞内外的水和离子平衡。将DMSO与右旋糖苷等细胞外防护液组合使用效果更佳。2在常温下，DMSO是有细胞毒性的。因此在往细胞悬液中加DMSO时，要在冰水混合物中进 行，一方面避免加入 DMSO 时放热，对细胞造成损伤；另一方面避免温度较高时，对细胞的毒 性。3细胞冷冻时，DMSO的浓度一般控制在515%，不能再高，否则也对细胞有毒性。一般用冷 冻管冻细胞时，体积一般再11.5ml，当把这些溶液加到20ml的培养液中时，此时DMSO的 浓度只有0.251 %,浓度已经很低，对细胞的毒性不大，培养转替换液最佳。