业务员测序常见问题解答

测序常见问题解答1. 为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？2. DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？3. 提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？4. 提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？5. PCR产物直接测序有什么要求？6. 为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？7. 如何进行PCR产物纯化？&对于测序用的质粒DNA的要求有哪些？9. 如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？10. 对测序引物的要求有哪些？11. 为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？12. 测序结果有很多套峰（出现很多N）,还照常收费，为什么？13. 为什么用 PCR 产物测序时，经常会出现套峰现象？14. 出现套峰的原因是什么？15. 测序结果不到800 Bases，还照常收费了，为什么？16. 为什么在测序报告上找不到引物序列？17. 在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么？18. 怎样使用擎科提供的测序报告？19. PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别？20. 测序结果和文献资料不一样，为什么？21. 我的基因序列与标准序列为什么有差别？22. DNA片段很长，一个反应读不到头，怎么办？23. 测序完成后，测序样品和引物将如何处理（或保存） ？24 怎样选择（设计）测序用引物？25. 觉得你给我的结果完全不是我需要的序列？26. 我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？27. 超过6KB的DNA片断如何进行测序？28. 全自动荧光测序的准确性如何？29. 用测序的方法检测点突变可靠吗？30. 我要求5'到3'正向测序，为什么你们给我的序列是反的？31. 我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？32. 我的样品你们已经测通了，但为什么在overlap区有这么多的错配，给出的全序列和单个报 告也存在差异，我该相信谁？33. 你们为什么在primer walking时总将引物设计的那么靠前？34. 我有一个4KB的PCR片段，希望你们帮我测通。35. 样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么测序结果是一个空质粒？36. 对于测序结果有疑问怎么办？Q-1. 为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？ 返回顶端A-1.首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。如果 您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄露；也可以将培养好的45m 1菌液沉淀下来，倒去上清液 以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。Q-2.DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？返回顶端 A-2.溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要 一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组 份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间 的稳定性，并且TE Buffer对DNA测序反应的影响也较小，但根据我们的经验，我们还是推荐使 用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。Q-3.提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？返回顶端A-3 我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果您可以提供DNA 样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。如果提供的DNA量不够，我们就需要对质 粒进行转化，此时需收取转化费。有些质粒提取法提取的DNA质量很好，象TaKaRa、Qiagen、 Promega的质粒制备试剂盒等。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收， 否则无法得到良好的测序效果。有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序样品的提供”部分的说明。Q-4. 提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好? 返回顶端A-4. 一般，菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄 送穿刺培养菌或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破 碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要 的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固 体)中，37°C培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4°C下可保存数个月，并且不容易污染， 便于运送。Q-5.PCR产物直接测序有什么要求？返回顶端A-5.(1) 扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般 难以得到好的测序结果。(2) 必须进行胶回收纯化。(3) DNA纯化在1.62.0之间，浓度50ng/M以上。Q-6.为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？返回顶端A-6. 如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非 特异性扩增产物或者原来的PCR产物去除不干净导致。大多数所谓的PCR “纯化试剂盒”实际上 只是回收产物而不能起到纯化的作用。对于非特异扩增产物产物肯定是无法去除，而且通常它 们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱 峰。Q-7.如何进行PCR产物纯化？返回顶端A-7.PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将目的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒 回收。产物用ddH20溶解。A-8.对于测序用的质粒DNA的要求有哪些？返回顶端A-8.对于测序用质粒DNA的一般要求：(1) DNA纯度高，1.62.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等。(2) 溶于ddH20中，溶液不能含杂质，如盐类或EDTA等螯合剂，否则将干扰测序反应的正常进行。Q-9.如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？返回顶端A-9 我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/m l的EB,加入一个已知浓度的标准样 品。电泳结束后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品 中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA的不同构型。质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合 环状的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(0C)分子，如果两条链发生断裂，就变成线状(L)。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋(SC)迁移速度最快，其次是线状(L)分子, 最慢为开环状(0C)分子。使用紫外分光光度计检测，或者用EB-标准浓度DNA比较法只能检测 抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰, 浓度检测的数值也是没有多少意义的。Q-10. 对测序引物的要求有哪些？ 返回顶端A-10. 对测序引物的一般要求：(1) 特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象(2) 不能含有混合碱基(3) 长度1725碱基(4) 纯度高，最好PAGE纯化(5) 用ddH20溶解，不要用TE缓冲液溶解。Q-11.为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？返回顶端A-11.测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的关键。如果测序引物在DNA 模板分子上有不只一个的结合位点，将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时扩增， 反映在测序峰图上将出现双峰或乱峰，无法读取序列。Q-12.测序结果有很多套峰(出现很多N),还照常收费，为什么？返回顶端A-12.DNA模板上出现二处以上的引物结合位点，或者DNA模板上有严重的重复序列，以及测序引 物不纯时，测序结果便会出现套峰现象(见图4)。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物 本身所造成，对这些结果(公司保证进行2次以上的测序工作) ，公司会根据具体情况进行收费 (详细见测序结果说明) 。Q-13.为什么用PCR产物测序时，经常会出现套峰现象？返回顶端A-13.PCR产物测序出现套峰现象，一般有以下几种原因：(1) PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目的片 段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的PCR产物测序结果是套峰。(2) 结构上的原因，造成了PCR产物测序出现套峰的现象。PolyA/G/C/T以及原因不明的复杂 结构的存在，都会出现测序结果套峰的情况。Q-14. 出现套峰的原因是什么？ 返回顶端A-14. 在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结其形成原因有以下几点(1) 测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰(2) 模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR,原因为非特异性条带(3) 模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等(4) 引物降解，引物不纯，或引物的特异性不好Q-15.测序结果不到800 Bases，还照常收费了，为什么？返回顶端 A-15.如在DNA样品中的DNA序列分布匀称，没有复杂结构时，正常的测序反应能保证达到800 Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂，造成聚合酶延伸反应终止，测序信号突然减弱或 消失，或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成（公司保证进行 2次以上的测序工作）。 对这些结果，公司会根据具体测序情况，进行收费（详细见测序结果说 明）。出现这些情况的原因分析如下：（1）G/C rich、G/C Cluster：这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失（见图1）；（2）A、T的连续结构：这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰（见图2）。 根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别完整的每 个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应（打滑现象），造成测 序结果紊乱，出现套峰。出现这样的情况，建议反向测序。一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢？现在还没有这方面的报道。根据我们的经验， 这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的 连续结构后面便出现套峰，但有时6070个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出 来。具体情况还有待考证。一般来说，PCR片段直接测序时，A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在 于测序时经历了 PCR反应及测序反应（测序反应本身也是PCR反应）二次聚合酶的打滑现象。（3）原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并 无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行（见 图3）。查看大图Q-16.为什么在测序报告上找不到引物序列？返回顶端A-16.这里分四种情况：（1）的确找不到测序使用的引物序列。目前使用的测序方法是在ddNTP上做荧光标记，测序仪 通过检测ddNTP上的荧光来读取序列，因为引物本身是不做荧光标记的，所测序列是从引物3'末 端后第一个碱基开始的，所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是PCR产物，要想得到 PCR引物的序列，可以将PCR产物进行双链测通或者将PCR产物克隆到载体上，用载体上的引物（注 意此引物也不能离插入片段太近）测序（2）找不到克隆片段的扩增引物。原因可能是您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离 您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分不会十分准确（3）还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的互补序列（4）存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点导致只有一条引物参与扩Q-17在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么？返回顶端A-17.由于测序仪自身缺陷，紧接引物之后的测序结果信号较弱，一般在测序用引物后面几个至 数十个（严重时4050个）碱基会读不出来（或者读错），请引起注意。Q-18.怎样使用擎科提供的测序报告？返回顶端A-18在我们提供的测序报告中，有一份打印的（并用E-mail提供）DNA碱基排列顺序的测序结 果。这个结果是我们根据测序仪的自动分析结果，并经严格确认后打印（并用E-mail提供）的 测序结果。但测序仪有时会发生误读或漏读现象，而我们的工作人员在检查时也没有发现，这 时的打印结果（并用E-mail提供）会出现错误。只有原始的测序彩色波形图才是最正确的，请 客户拿到结果后，进行详细确认。如有不明白的地方，请立即和我们联系，我们会及时确认并 进行解决。Q-19.PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别？返回顶端A-19众所周知，PCR扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。 PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几 十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时， 错配现象也就反映不出来了。因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。 而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难 保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在着一些 错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于 PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请 选用保真性能高的DNA聚合酶。Q-20. 测序结果和文献资料不一样，为什么? 返回顶端A-20. 原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一 定完全一样。如果是PCR产物克隆测序，那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结 果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致，请理解。Q-21. 我的基因序列与标准序列为什么有差别？ 返回顶端A-21. 一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。 首先，在PCR扩增过程中就可能产生错误，将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序 的准确率问题。ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准 确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下， 通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序 是很有必要的。只进行简单的单向测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的 精度决定的。Q-22.DNA片段很长，一个反应读不到头，怎么办？返回顶端A-22 如果DNA片段在载体上，可以用载体上两端的引物同时测序，让其中间交叉互补，便可完 全测通。如果这样还读不通，可根据已经测出的序列设计测序引物作进一步测序（此称为Primer Walking法），便可完全测通。Q-23. 测序完成后，测序样品和引物将如何处理（或保存）? 返回顶端A-23. 客户需要将测序样品或引物（客户自带的）返还时，我们在发送测序报告的同时，按客户 要求寄回样品或引物（客户自带的） 。2）对于没返回的测序样品和引物，公司负责保存二个月（从样品收到之日算起） ，超过二个 月还需测序的样品，请客户另行提供。Q-24. 怎样选择（设计）测序用引物? 返回顶端A-24.测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3'端 的几个碱基能完全配对，即使引物长达80100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行 PCR反应。而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件 Olig。设计。在本公司测序时，我们可免费帮助设计测序用引物。长度在1525个碱基左右，一般选择20个碱基（根据GC含量作适当调整），3'端尽量选择G 或C碱基（但不绝对），以增加与模板的结合能力。 Tm温度应选择50°C70°C左右。 GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。 避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。保证引物和模板100%匹配，特别是3'端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引 物和模板之间只能有一个结合位点。Q-25.觉得你给我的结果完全不是我需要的序列？返回顶端A-25. 出现这样的情况只有两种可能：(1) 我们给您的测序结果对应的不是您的样品(2) 您的样品插入部分与您预期的不一致。作为提供测序服务的一方，我们无法判断测得的 序列是否与您预期的结果一致，我们可以为您做的是，检查发送给您的测序结果与您提供来的 样品是否一致。出现您这样的问题，我们常规的做法是进行验证实验。验证实验的方法是取您 的原始菌液重新抽提质粒进行测序。验证实验如在可靠范围内结果与前次不同则说明我们前次 的测序结果是有问题的，前次测序的费用免除；如结果仍然相同，那么说明前次测序的结果准 确，则您还需要支付这一次测序的费用。Q-26. 我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？ 返回顶端A-26. 在检查报告时，设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号，所以在出现杂 合的位置上给出的信号往往是比较强的一个信号。所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点的， 请在测序订单上注明，我们在修改报告时会加以注意。但如果在您预期出现杂合信号的位置上 只有单一的信号，那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出现这样的情况可能是在您的 样品中杂合成份太少的信号强度不足以被检查到，也许有其他更加灵敏的检测手段可以满足您 的要求。Q-27.超过6Kb的DNA片断如何进行测序？返回顶端A-27.超过6Kb的DNA片断用Shot Gun进行测序准确并且节省时间，Shot Gun方法如下：(1) 用物理方法打碎DNA(2) 回收11.5K的片断(3) 用核酸酶切平端，连接入载体(4) 按照一定比例进行测序，保证每一个区段有3倍以上的数据(5) 编辑所有测序数据(6) 如果有缺少数据的区域，还需要补充测序，拼接成完整序列Q-28. 全自动荧光测序的准确性如何？ 返回顶端A-28.我们有两种不同型号的测序仪：ABI377和ABI3730。ABI3730测序仪也是采用AB公司配套的 Big DYE Terminator cycle sequencing Kit其准确性达到800碱基只有1个以下的错误，并且 该测序仪对碱基的判读有一个自身的评判值(Quality Value)，根据QV值的大小，也可以帮助 我们来判断每一个碱基的准确程度Q-29. 用测序的方法检测点突变可靠吗？ 返回顶端A-29. 有的客户想用测序的方法检测点突变体，我认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。 首先，我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板 的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当 测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次， 在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时， 也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量 提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪 一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样不利于突变体 的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。Q-30.我要求5'到3'正向测序，为什么你们给我的序列是反的？返回顶端A-30. 您指的可能是插入片段的方向，而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质 粒上的序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用3' 引物和5' 引物这样的字 样，因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反，请以T7, T3, SP6, M13f,M13r这样的形式来填写，或注明酶切位点方向比如“测序方向EcoRI到Hindlll”我们手中等质 粒资料有限，有时还需要您提供质粒的相关资料。Q-31.我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？返回顶端A-31.我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置，如果从测序报告上的确无法作出准确判 读，我们会重新进行实验。如果您指出的位点信号清晰准确，您仍然要求再进行一次实验，那 么实验结果和验证实验是相同的。Q-32 我的样品你们已经测通了，但为什么在overlap区有这么多的错配，给出的全序列和单个 报告也存在差异，我该相信谁？ 返回顶端A-32. 给出的全序列是一个拼接的结果，当互相拼接的两个序列存在差异时，应该以序列质量更 好的应该为主，这也就是为什么会出现错配和全序列与单个测序结果的差异。Q-33 .你们为什么在primer walking时总将引物设计的那么靠前？返回顶端A-33. 我们在设计引物时有两个准则。一是设计引物区域的序列必须准确，二是在引物区后必须 还有足够的准确序列以便拼接。这样我们设计引物的位置就必然比较靠前，在满足软件设定的 条件下，我们总会选取最靠近3'端的引物来作为最终的测序引物。Q-34.我有一个4KB的PCR片段，希望你们帮我测通。返回顶端A-34.大于2KB的PCR片段要测通最好是构建好克隆后再进行测序。这样模板更加稳定，测序效果 也更加好一些。Q-35. 样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么测序结果是一个空质粒？ 返回顶端A-35. 测序是对样品的最好验证。结果为空载，可能如下：(1) 可能在培养过程中发生插入片段的丢失，这种情况的发生无法事先预期(2) 提供的克隆是假阳性克隆Q-36. 对于测序结果有疑问怎么办? 返回顶端A-36. 请客户仔细阅读“测序结果说明”和“问答”的内容，如果还有疑问，请您在收到测序结 果一个月之内与我们联系， 我们会及时、认真给您检查测序结果， 分析原因。 制作人：张少少 2012.11.9