Taq酶提取protocal

RapidPurificationofHigh-activityTaqDNAPolymerase本次试验历时六天，分为准备工作（两天），酶的诱导表达（一天），酶的提取（一天），酶的透析以及酶的保存（两天）。下面按时间顺序叙述。第一天准备工作（1）清洗器皿。100ml量筒：34个1000ml量筒：12个500ml量筒：23个250ml量筒：1个（没有亦可）1000ml烧杯：2个小烧杯：2个500ml三角瓶：1个150ml三角瓶：23个500ml离心管：4个250ml离心管：2or4个50ml离心管：12or6个10ml移液管：56个药勺：34个透析袋+超纯水（灭菌）透析夹+超纯水（灭菌）细菌滤+滤膜（灭菌，切勿烤干！）枪头（1ml12盒，0.2ml2盒）小管（1.5ml1瓶，灭菌）定性滤纸：两包新的10ml离心管：灭菌，保存酶用。磁转子：蒸馏水洗，不必灭菌。同时准备一大瓶超纯水备用。Note：（一）整个清洗过程都要戴手套（干燥后操作要戴PE手套）。（二）器皿最后都要用超纯水润洗，倒放在滤纸上干燥。包上牛皮纸灭菌。（三）离心管干燥后封口灭菌。（四）药勺用盐酸处理除去污渍锈斑，灭菌。（2）配LB培养基。（按照分子克隆实验指南配方）2L灭菌。预备明晚摇菌。（3）菌种活化，划单斑。取98.11的DJP菌种划单斑，37°C培养，预备明晚摇菌。Note：提取Taq酶每次只用上次保存的菌种，每次摇菌后都要保存菌种！PROCEDURALEXPLANATION：作蛋白表达的细菌和感受态细菌都要经过转瓶活化过程。第二天准备工作（1）将昨晚划的平板放在4C预备晚上摇菌。（2）配溶液BufferA，LysisBuffer，StorageBuffer并灭菌。BufferA：50mMTrisHClpH7.950mMDextrose1mMEDTAK+配法1M0.5MFOR400mlinducePreLysisBuffer)TrisHCl(pH7.9)20mlEDTAK+(pH7.9)0.8mlDextrose3.6g加超纯水至390ml，pH计调至7.9，定容至400ml。Note：（一）pH值要在7.9以上，7.910以下。（用KOH和HC1调）水。（二）最后酶要悬浮在BufferA中，因此要用超纯水。其他缓冲液用蒸馏水即可，也可用超纯LysisBuffer：10mMTrisHCl(pH7.9)50mMKCl1mMEDTAK+(pH7.9)0.5%(v/v)Tween-200.5%(v/v)NP401mMPMSF(用前再加)配法：(FOR200ml)1MTrisHCl(pH7.9)2ml0.5MEDTAK+(pH7.9)0.4ml1MKCl10ml10%Tween2010ml10%NP4010ml灭菌后加入PMSF0.03484g。(以约300500卩1异丙醇溶解，缓慢加入)Note：PMSF可用异丙醇溶解后缓慢加入，也可直接将粉末倒进去剧烈振荡。(PMSF剧毒,注意防护）PreLysisBuffer：即BufferA中加Lysozyme至4mg/ml。（现配现用）lxStorageBuffer：（200ml，溶解酶用，-20°C保存）50mMTrisHCl（pH7.9）0.1mMEDTAK+50mMKCl0.5mMPMSF1mMDTT配法：1MTrisHCl（pH7.9）10ml0.5MEDTAK+（pH7.9）0.04ml1MKCl10mlPMSF0.01743g定容至100ml，再加甘油100ml。灭菌后加入过滤除菌的DTT。1MDTT过滤除菌后加入0.2ml,即终浓度为1mM（配法：1.543g10m1超纯水或0.7715g5m1超纯水，过滤除菌后小管分装。-20C保存）Note：（一）PMSF可用异丙醇溶解后缓慢加入，否则易析出。（二）DTT易降解，因此要在Buffer灭菌后加入，并且在低温保存。1xStorageBuffer：（2L透析用）50mMTrisHCl(pH7.9)0.1mMEDTAK+50mMKCl0.5mMPMSF1mMDTT配法：1MTrisHCl(pH7.9)100ml0.5MEDTAK+(pH7.9)0.4ml1MKCl100mlPMSF0.1743g定容至1000ml，再加甘油1000ml。灭菌后加入过滤除菌的DTT。1MDTT过滤除菌后加入2ml。(3) 挑斑摇菌5mlLB加Amp至80yg/ml。2管(用同一个斑，并标记该斑)，37°C过夜。(本次试验中由20：309：30)第三天酶的诱导表达(1) 转瓶：LB加Amp至80yg/ml(即浓度为100mg/ml的Amp在1L的培养基中加800卩1),加菌液500pl/L,37C摇菌。预计21：00可加IPTG诱导。Note：本次试验中由10：3020：00,OD550值达到1.663,应在0.8左右最好。达到1.8亦可。(2) 保存菌种：400卩1菌液加400pl菌种保存液，-70C保存。(3) 清理器皿：检查是否有未灭菌的器皿,将用过的器皿清洗灭菌。(4) 测OD值，力口IPTG(250mg/ml)至125mg/L(=0.5mM。500pllL)37C摇菌，12hr。Note:(一) 诱导IPTG一般加到1mM,诱导时间相对较短，2mM为饱和值。本次试验将浓度降低,时间相应延长，以便过夜摇菌。(二) 加IPTG前取样(500卩42)以备做蛋白胶对照。明早离心前再取样预备跑蛋白胶。菌液离心后收集菌体4C保存。(三) IPTG诱导12hr,明早8:00前要调水浴锅至75C(精确！)同时离心转子预冷至4C。第四天提Taq酶为避免污染，所有操作都要戴手套，常换手套和枪头。(1) 收集菌体：8:30离心，5000rpm,4C,15min,500ml离心管x2,收集两次，共2L。Note：以下操作在冰上进行，与制感受态类似。(2) 洗涤：Add100mlBufferAperliteroriginculturevolume,转至250ml离心瓶x2；6000rpm,4C，12min，冰上。(3)PreLysis：Add50mlPreLysisBufferperliteroriginculturevolume(先加50mlBufferAperliter,充分悬浮，再加Lysozyme至4mg/ml,摇匀)，室温放置15min,合并至一个250ml离心瓶中。(4) 热变性沉淀杂蛋白：在LysisBuffer中加入PMSF,待用。加入等体积的LysisBuffer,转入250ml三角瓶中，75C,1hr。(5) 除去沉淀：15000rpm或17000rpm(Beckman)4C,15-20min。取上清，转入干净的三角瓶中，用灭菌的100ml量筒量取体积。(6) (NH4)2SO4沉淀Taq酶：用小烧杯称取硫酸铵(按30g/100ml上清)在室温慢加慢摇。边加边摇。本次试验摇了两个小时。Note：（一）避免局部盐浓度过高导致Taq酶析出，要加一点摇一会。（二）摇烧杯时要注意不要产生泡沫，泡沫会使酶活性降低。（三）大约加入一半硫酸铵时溶液会浑浊，若沉淀出现太早表明杂蛋白未除尽，可在透析之后离心除去。（7）离心沉淀Taq酶：转入50ml离心管，15000rpm或18500rpm（Beckman）室温，25min。弃上清，沉淀重悬在5mlBufferAper100ml上清。Note：（一）若在4°C离心则沉淀很少。（二）上清可倒在三角瓶中多离心几次便可以将沉淀完全离心下来。（8）透析：将透析袋用透析夹夹紧，透析袋中避免有气泡，可用手将气泡挤出（戴手套！）每个透析袋约10ml在StorageBuffer中加入DTT（切记！）在1000ml烧杯中倒入约400500ml,放入磁转子，4C缓慢搅拌，每隔12hr换一次透析液。Note：（一）透析袋可多折几次以免夹得不紧。（二）透析时烧杯要封口（可用PE手套）第五天透析早晚各换一次透析液，原透析液倒掉，切勿造成酶的污染！Note：StorageBuffer平时放在4C可防止DTT降解，也可保证换透析液时酶保持低温。第六天透析回收早上8：009：00换一次透析液，下午4：005：00可收酶。（1）剪掉多余的透析袋，用枪将酶吸出，放入10ml离心管，用StorageBuffer1:1稀释，一20C保存。Note：（一）酶液的颜色为淡黄色澄清液体。（二）若出现白色沉淀，可在4C，13000rpm离心5min，取上清。