医学微生物学：病毒感染的检测方法与防治原则

16/19/2022 012345678910111213WeekResponseClinical illnessALTIgMIgGHAV in stoolInfectionViremiaEVENTS IN HEPATITIS A VIRUS INFECTION病毒感染检测：病毒感染检测：病毒感染的检测方法: （针对病原体，针对特异性免疫反应）1.细胞培养鉴定2.病毒直接观察3.检测病毒抗原4.检测病毒核酸5.中和检测6.IgM检测7.IgG 4倍以上升高8.细胞因子检测6/19/20223特异性检测病毒特异性检测病毒特异性检测抗病毒免疫特异性检测抗病毒免疫标本采集与运送 标本的采集1.采样时间 尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。 6/19/20224标本的采集2.标本种类的选择 根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。 6/19/20225常见分离病毒标本的选择 6/19/20226病毒病毒咽拭子咽拭子粪便粪便血液血液脑脊液脑脊液 唾液唾液 组织组织 柯萨奇柯萨奇A和和B组组 +心心 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 +脑膜脑膜 腮腺炎病毒腮腺炎病毒 +流感病毒流感病毒 +轮状病毒轮状病毒 +HAV+HIV+ 精液精液3.常见标本的采集方法a)血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100nml肝素钠。用于分离CMV、HSV、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠 道病毒。b)脑脊液：以无菌取脑脊液12ml，冰浴立即送检。在4可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。c)宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离 HSV、CMV。d)粪便标本：取24粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。6/19/202273.常见标本的采集方法e)含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。f)喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。g)尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸入尿道4cm转动3次，以获得较多的上皮细胞，用于分离CMV和HSV。h)尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分别使用器械和容器。6/19/20228标本的运送和保存l病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，4下数或-70。l冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作保护。l病毒传送培养基以Hanks液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素100Uml和链霉素100gml，为了抑制真菌的生长加入25gml二性霉素B或40gml制霉菌素。 6/19/20229病毒感染检测（标本采集）：病毒感染检测（标本采集）：病毒感染的检测方法: （针对病原体，针对特异性免疫反应）1.细胞培养鉴定2.病毒直接观察3.检测病毒抗原4.检测病毒核酸5.中和检测6.IgM检测7.IgG 4倍以上升高8.细胞因子检测6/19/202210特异性检测病毒特异性检测病毒（感染位点（感染位点/血液）血液）特异性检测抗病毒免疫特异性检测抗病毒免疫（血液）（血液）病毒培养细胞分离培养原代细胞培养：由供体组织直接分离培养的细胞，称之为原代细胞。 二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为4050代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。6/19/202211（常作为确证检测的第一步）（常作为确证检测的第一步）常用于病毒分离的细胞 6/19/202212鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化914天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。动物接种 动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。6/19/202213细胞培养的结果观察 细胞病变效应(CPE) ：细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；不出现细胞病变现象。（红细胞吸附）细胞培养液pH的变化。 6/19/202214基于细胞培养的检测手段Transformationloss of contact inhibition6/19/202215CPE: Measles (风疹病毒风疹病毒) on human lung carcinoma (A549)Fields Vriology (2007) 5th edition, Knipe, DM & Howley, PM, eds, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia Fig. 2.56/19/202216CPE: vaccinia(痘病毒)UninfectedInfectedFields Vriology (2007) 5th edition, Knipe, DM & Howley, PM, eds, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia Fig. 2.56/19/202217RSV (呼吸道合胞病毒)- syncytia6/19/202218CPE: inclusion bodiesNegribodiesNegribodiesneuronImmunohistochemical staining of intra-cytoplasmic viral inclusions in the neuron of a human rabies patient. (Fields Vriology (2007) 5th edition, Knipe, DM & Howley, PM, eds, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia Fig. 39.9)6/19/202219红细胞吸附抑制试验正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。可作为初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。6/19/202220红细胞吸附add red blood cells6/19/202221Hemadsorption of erythrocytes to cells infected with influenza viruses, mumps virus, parainfluenza viruses, or togaviruses. These viruses express a hemagglutinin on their surfaces, which bind erythrocytes of selected animal species. (From Medical Microbiology, 5th ed., Murray, Rosenthal & Pfaller, Mosby Inc., 2005, Fig. 51-5.)Hemadsorption6/19/202222Plaque formation6/19/202223PlaqueFields Vriology (2007) 5th edition, Knipe, DM & Howley, PM, eds, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia Fig. 2.56/19/202224Plaque formation6/19/2022251:1001:101:101:101:101:1010-210-310-410-510-610-7virusserial dilutionplate 1 mlplaques100101(1000)(100,000)(10,000)Titer = 1 x 107 pfu/mlPlaque assay: method6/19/202226Plaque assayTiter = 1.2 x 108 pfu/ml6/19/202227免疫荧光6/19/202228免疫荧光可以直接用来检测采集的标本中是否含有免疫荧光可以直接用来检测采集的标本中是否含有病毒抗原、细胞培养的病毒，或者用来检测血清中是否病毒抗原、细胞培养的病毒，或者用来检测血清中是否存在特异性抗体。存在特异性抗体。细胞蛋白表达检测6/19/2022290 00h0h4h4h6h6h4h4h8h8h10h10h12h12h14h14h16h16h18h18h20h20h22h22h24h24h6/19/202230= infected= uninfectedEndpoint titrationFive replicate wells of cells are infected with one ml of each of four different virus dilutions, incubated, and scored for infection by looking for CPE. In this example, the final titer is 106.3 TCID50 per ml. (TCID = tissue culture infective dose)10-510-610-710-85 replicate samplings12345dilution6/19/202231Endpoint titration6/19/202232106.35 TCID50 per ml病毒中和实验 (特异性抗体检测)6/19/2022336/19/202234Hemagglutination (血凝检测)RBC6/19/202235Titer = 32 HA units/mlHemagglutination test1:81:21:21:21:21:28163264128256virusserial dilutiontop viewmix with red blood cellsside view6/19/202236Hemagglutination assay. Seven different samples of influenza virus, numbered 1 through 7 at the left, were serially diluted as indicated at the top, mixed with chicken red blood cells (RBC), and incubated on ice for 1 to 2 hours. Wells in the bottom row contain no virus. Agglutinated RBCs coat wells evenly, in contrast to nonagglutinated cells, which form a distinct button at the bottom of the well. The HA titer, shown at the right, is the last dilution that shows complete hemagglutination activity. (From Fields Vriology (2007) 5th edition, Knipe, DM & Howley, PM, eds, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia Fig. 2.9)Hemagglutination assay: influenza virus6/19/202237血凝抑制实验6/19/2022386/19/202239核酸类型鉴别及序列测定利用5溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或 DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。6/19/202240耐酸试验肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。 乙醚敏感试验病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。6/19/2022412、电镜观察病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。6/19/202242鸡痘病毒（超薄切片）鸡痘病毒（超薄切片）6/19/202243Adenovirus电镜电镜负染负染6/19/202244腺病毒腺病毒Human Rotavirus电镜电镜负染负染6/19/202245轮状病毒轮状病毒Paramyxovirus (Parainfluenza)电镜电镜负染负染6/19/202246副流感病毒副流感病毒6/19/202247免疫电镜免疫电镜6/19/202248通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。感染，是病毒学诊断的重大发展。分子诊断分子诊断 3、快速诊断6/19/202249免疫检测免疫检测核酸检测核酸检测检测机体免疫反应检测机体免疫反应检测病毒抗原检测病毒抗原检测病毒核酸检测病毒核酸检测特异性抗体检测特异性抗体检测检测病毒病毒组成组成6/19/202250方法学方法学A 间接法间接法Ab1Ab2B夹心法夹心法 Ab2 Ab1C 捕获法捕获法D 竞争法竞争法抗抗 原原标标 记记 物物抗抗 体体支持介质支持介质免疫检测ELISA6/19/2022516/19/2022526/19/2022536/19/202254A A、纳米微球、纳米微球胶体金胶体金彩色乳胶微球彩色乳胶微球纳米磁性微球纳米磁性微球纳米荧光微球纳米荧光微球B B、酶免纸条、酶免纸条免疫检测进展化学发光6/19/202255 所谓化学发光 (CL) , 就是化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激发到激发态从而产生发光的现象。化学发光反应能级图化学发光反应能级图酶促发光化学发光6/19/202256免疫检测进展时间分辨荧光6/19/202257Antibody detection: western blot6/19/202258病毒感染检测：病毒感染检测：病毒感染的检测方法: （针对病原体，针对特异性免疫反应）1.细胞培养鉴定2.病毒直接观察3.检测病毒抗原4.检测病毒核酸5.中和检测6.IgM检测7.IgG 4倍以上升高8.细胞因子检测6/19/202259特异性检测病毒特异性检测病毒特异性检测抗病毒免疫特异性检测抗病毒免疫 012345678910111213WeekResponseClinical illnessALTIgMIgGHAV in stoolInfectionViremiaEVENTS IN HEPATITIS A VIRUS INFECTION核酸检测模板扩增PCR、NASBA、TMA、HDA、SDA探针扩增RCA、Expar信号扩增 Invader、杂交6/19/202261Real time PCR6/19/2022625353SGExcitationSGSGSGSGEmission PCR-probe6/19/2022635353SGSGSGSGSGExcitationEmission6/19/202264RQExcitationRQQRExcitationEmissionMolecular Beacon6/19/2022656/19/202266Taqman6/19/202267Scorpion primers535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQRAmplifluor Probe6/19/202268Isothermal-NASBA6/19/202269Isothermal-TMA6/19/2022706/19/2022国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 福福建省医学分子病毒学研究中心建省医学分子病毒学研究中心71Amplification6/19/2022国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 福福建省医学分子病毒学研究中心建省医学分子病毒学研究中心72Detection (TMA)AE：吖啶酯In high pHIsothermal-RCA6/19/202273Isothermal-HDA6/19/202274Isothermal-SDA6/19/202275Isothermal-Expar6/19/2022766/19/202277 012345678910111213WeekResponseClinical illnessALTIgMIgGHAV in stoolInfectionViremiaEVENTS IN HEPATITIS A VIRUS INFECTION病毒感染的特异性预防主动免疫 疫苗被动免疫 免疫球蛋白6/19/202279l HEV疫苗可预防的疫苗可预防的2828种疾病种疾病Smallpox天花天花Rabies狂犬狂犬Cholera霍乱霍乱Typhoid fever伤寒伤寒Diphteria白喉白喉Pertussis百日咳百日咳Tetanus破伤风破伤风Anthrax炭疽热炭疽热Tuberculosis结核结核Yellow fever黄热病黄热病Influenza流感流感Polio脊髓灰质炎脊髓灰质炎Measles麻疹麻疹Mumps腮腺炎腮腺炎Rubella风疹风疹Men C流行性脑膜炎流行性脑膜炎Men ACWYS. pneumoniae肺炎肺炎Hepatitis B乙肝乙肝Herpes zoster带状疱疹带状疱疹 (varicella & shingles)H. influenzae type b 嗜血嗜血流感流感Hepatitis A甲肝甲肝Lyme disease莱姆病莱姆病Tick-borne encephalitis蜱传脑炎蜱传脑炎Japanese encephalitis日本脑炎日本脑炎Rotavirus轮状轮状Human papilloma virus宫颈癌宫颈癌Hepatitis E virus戊肝戊肝疫苗的研究历史疫苗的研究历史第一代疫苗（减毒或灭活疫苗）第一代疫苗（减毒或灭活疫苗） 十九世纪中叶，法国科学家十九世纪中叶，法国科学家ParsteurParsteur首先首先发明了减毒疫苗的制备技术。用病原体减发明了减毒疫苗的制备技术。用病原体减毒或灭活制成疫苗，称之为第一代疫苗。毒或灭活制成疫苗，称之为第一代疫苗。 特点：以减毒、弱化或灭活的病原体做特点：以减毒、弱化或灭活的病原体做疫苗。疫苗。第二代疫苗第二代疫苗 ( (基因工程疫苗基因工程疫苗 ) ) 将病原体的抗原（某种蛋白质）基因克将病原体的抗原（某种蛋白质）基因克隆在细菌或真核细胞内，利用其生产的隆在细菌或真核细胞内，利用其生产的病原体抗原作为疫苗。病原体抗原作为疫苗。 特点：利用病原体的某些抗原成分作为特点：利用病原体的某些抗原成分作为疫苗。疫苗。 疫苗的发展疫苗的发展第三代疫苗第三代疫苗 ( (核酸疫苗、病毒载体疫苗核酸疫苗、病毒载体疫苗) ) 将含有编码病原体抗原基因序列的将含有编码病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗，经肌肉注射或质粒载体直接作为疫苗，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。生对该抗原蛋白的免疫应答。 特点：用含有病原体抗原基因序列的质特点：用含有病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗。粒载体直接作为疫苗。 疫苗的发展疫苗的发展病毒感染的治疗干扰素核苷类似物逆转录酶抑制剂蛋白酶抑制剂治疗性疫苗/抗体6/19/202285