细胞电生理研究进展学习教案

会计学1细胞细胞(xbo)电生理研究进展电生理研究进展第一页，共44页。第2页/共44页第二页，共44页。 20世纪世纪50年代，年代，Hodgkin and Huxley 首次应用电首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流(dinli)的测定。的测定。第3页/共44页第三页，共44页。工作原理：离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础工作原理：离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础(jch)。电生。电生理实验以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离理实验以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。因而，须人为地使膜电位在一定时间内维变化又会影响该离子的通透性的变化。因而，须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充持在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。意义意义 ：1）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平（）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平（不变）；不变）；2）通过电流检测装置，记录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子）通过电流检测装置，记录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流，从而了解膜通道的电流的反相电流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流，从而了解膜通道的电导及功能活动。电导及功能活动。第4页/共44页第四页，共44页。容完成充放电过程进入电压钳制的稳态期， 测得的跨膜电流(dinli)可以认为来自于离子通道电流(dinli)。第5页/共44页第五页，共44页。存在问题： 没有考虑钳制电压的微电极阻抗RCE（兆欧姆数量级） 若考虑微电极电阻，钳制电压VC就就被分压， 并且，膜电阻Rm 可以(ky)有大幅度改变， 第6页/共44页第六页，共44页。A1和和A2为两个高增益的运算放大器，为两个高增益的运算放大器，A1连接成电压跟随器，提供连接成电压跟随器，提供(tgng) 高输入阻抗和低输出阻抗；高输入阻抗和低输出阻抗；A2连接成负反馈放大器。连接成负反馈放大器。 第7页/共44页第七页，共44页。第8页/共44页第八页，共44页。由德国神经生物学家赫尼（Neher）和萨克曼 （Sakmann）在1970s年代(nindi)中期发明，1991年两人共同荣获诺贝尔生理学和医学奖。 NeherSakmann第9页/共44页第九页，共44页。第10页/共44页第十页，共44页。第11页/共44页第十一页，共44页。第12页/共44页第十二页，共44页。1 显微照片2 单个离子通道电流(dinli)3 多个离子通道电流(dinli)的叠加。 第13页/共44页第十三页，共44页。双电极(dinj)电压钳技术低电阻(dinz)P2、高增益A2时，VmVc 对细胞(xbo)有损伤，不宜于小细胞(xbo) 单电极电压钳技术（膜片钳）电极电阻远小于膜片电阻， A1高增益，A2单位增益（检测），第14页/共44页第十四页，共44页。运算放大器的正负输入端子为等电位，向正输入端子施加指令电位、经过短路负端子可以使膜片等电位，达到电位钳制的目的。当膜片微电极尖端与膜片之间形成10G欧（以上封接时其间(qjin)的分流电流达到最小，横跨膜片的电流（I）可100做为来自膜片电极的记录电流（Ip）而被测量出来。RsealIpIIpRfR0第15页/共44页第十五页，共44页。R0是与膜片阻抗相串联的局部串联电阻（或称输入阻抗）。R0通常为1-5 M欧，如果Rseal高达 10G欧，此时Ip/I=Rseal/(R0+Rseal).此时Ip可作为(zuwi)在IV转换器(点线）内的高阻抗反馈电阻（Rf）的电压降而被检测出。实际上这时场效应管运算放大器A1的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在第二级场效应管运算放大器A2时被减掉。RsealIpIIpRfR0第16页/共44页第十六页，共44页。第17页/共44页第十七页，共44页。子单通道记录。子单通道记录。电极(dinj)玻璃第18页/共44页第十八页，共44页。般为般为25M，而全细胞记录则，而全细胞记录则最好在最好在23M。4. 进行实验，记录和分析数据进行实验，记录和分析数据准备工作就绪后即可进行实验准备工作就绪后即可进行实验操作，数据记录和分析操作，数据记录和分析第19页/共44页第十九页，共44页。 传统膜片钳技术(jsh)主要优缺点总结 第20页/共44页第二十页，共44页。第21页/共44页第二十一页，共44页。免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！第22页/共44页第二十二页，共44页。第23页/共44页第二十三页，共44页。打破孔下面的细打破孔下面的细胞膜形成全细胞胞膜形成全细胞记录模式。记录模式。第24页/共44页第二十四页，共44页。第25页/共44页第二十五页，共44页。第26页/共44页第二十六页，共44页。 3.1 重要的生理功能 细胞生物电现象的基础 参与维持(wich)细胞正常形态 细胞兴奋-收缩偶联和兴奋-分泌偶联 细胞跨膜信号转导第27页/共44页第二十七页，共44页。第28页/共44页第二十八页，共44页。细胞生物电现象的基础(jch)动作电位的形成第29页/共44页第二十九页，共44页。第30页/共44页第三十页，共44页。第31页/共44页第三十一页，共44页。第32页/共44页第三十二页，共44页。第33页/共44页第三十三页，共44页。第34页/共44页第三十四页，共44页。 在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子(lz)具有通透性，即细胞静息电位的钾离子(lz)学说；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子(lz)都可以自由通过。 Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪3050年代做出了开创性研究。他们基于电压钳技术，提出并验证了所谓的HodgkinHuxley方程，数学模拟出和真实状况相符合的神经冲动的传导，由此建立了细胞动作电位的钠离子(lz)学说。离子(lz)通道的近代观念也由此产生。3.33.3离子通道研究离子通道研究(ynji)(ynji)理论理论第35页/共44页第三十五页，共44页。Erwin Neher(1944- )Kenneth Cole(1900-1984)第36页/共44页第三十六页，共44页。第37页/共44页第三十七页，共44页。第38页/共44页第三十八页，共44页。电学部分电学部分(b fen)(b fen) 信号放大器信号放大器 数据采集卡数据采集卡 PC PC 周边设备控制器等周边设备控制器等光学光学(gungxu)(gungxu)部分：部分： 荧光显微镜荧光显微镜 CCD CCD照相机照相机 监视器监视器 激光器等激光器等 机械部分机械部分 防震台，气压泵或气瓶 高精密微电极操作器 灌流操作器 显微镜移动平台或可移动载物台辅助部分辅助部分： 信号屏蔽罩 微电极拉制仪 药物灌流设备 温度控制器第39页/共44页第三十九页，共44页。工作站工作站平板平板(pngbn)(pngbn)芯片芯片+ +即：即：德国Nanion公司(n s)Patchliner德国Nanion公司Syncropatch 96美国MolecularDevices公司Ionworks第40页/共44页第四十页，共44页。1 1 记录记录(jl)(jl)模式模式传统传统(chuntng)(chuntng)膜片钳膜片钳平板膜片钳平板膜片钳第41页/共44页第四十一页，共44页。2 2 各自的优缺点各自的优缺点第42页/共44页第四十二页，共44页。第43页/共44页第四十三页，共44页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)！第44页/共44页第四十四页，共44页。