HE染色实验报告

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1、1.1.1 篇一：he染色与免疫组织化学染色实验报告华中农业大学动物科技动物医学院he染色与免疫组织化学染色实验报告实验目的及意义了解石蜡切片的制作过程掌握he染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法熟悉he染色与免疫组织化学染色后的读片知识实验方法及步骤石蜡切片制作及he染色步骤取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块（一般厚度不超过05厘米）投入预先配好的固定液中（10福尔马林）使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。1.1.2 脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石

2、蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。1.1.3 浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器（如折叠一小纸盒），倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。1.1.4 切片前的准备工作：先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm勺石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。1.1.5 切片与贴片：将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往

3、往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45C恒温箱中烘干。1.1.6 脱蜡至水华中农业大学动物科技动物医学院二甲苯i20分钟，二甲苯ii20分钟，无水乙醇3分钟，95%酒精3分钟，80%酒精3分钟，70酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。1.1.7 染色：苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1%盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1%氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95%酒精3分钟，1%伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。1.1.8 脱水和透明：95%酒精2分钟，无水酒精i2分钟，无水酒精i2分钟，二甲苯i5分钟，二甲苯ii5分

4、钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。1.1.9 封固：将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37C烘箱。1.1.10 sabc染色步骤脱蜡至水：二甲苯i20分钟，二甲苯ii15分钟，100%酒精2分钟，95%酒精2分钟，80%酒精2分钟，70%酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。流水冲洗5分钟（水流要小）用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1:9配制，配100ml）,室温封闭15分钟，注意避光。2.2.4 蒸馏水洗5分钟，重复2次。2.2.5 热抗原修复，将切片浸入0.01m枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。2.2.

5、6 取出切片放入染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。227取出切片放入湿盒中，滴加5%bsa封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。2.2.8 甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加pbs,放入4C冰箱过夜。2.2.9 放入染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。2.2.10 取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。2.2.11 取出置染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加sabc（覆盖满组织为宜），室温30分钟。华中农业大学动物科技动物医学院取出置染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。2.2.12 dab显色，取一试管加1ml单蒸水，b、c、a

6、试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。2.2.13 终止显色用单蒸水洗5分钟，重复2次。2.2.14 苏木素衬染1分钟，流水冲洗5分钟。2.2.15 脱水透明，70酒精3分钟，80酒精2分钟，90酒精2分钟，95酒精2分钟，95%酒精ii2分钟，100%酒精i2分钟，100%酒精ii2分钟，100%酒精iii2分钟二甲苯i8分钟，二甲苯ii5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。中性树胶封片，放入37C烘箱。实验结果3.1he染色结果华中农业大学动物科技动物医学院aibbibib：狂犬病毒包涵体（内基氏（negri）小体）图1狂犬病毒感染后脑组织病变he染色

7、a:小脑浦肯野细胞内包涵体x400;b:脑神经元内多处包涵体x400狂犬病的病理变化在显微镜下主要表现为神经元退变,淋巴细胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖以及特征包涵体形成。狂犬病毒包涵体又称为内基体，直径华中农业大学动物科技动物医学院约310nm边缘整齐，内有12个状似细胞核的小点，主要出现在大脑海马区及小脑，其他部位也可见，在病变神经元胞浆内成圆形或卵圆形，苏木素一伊红染色脑组织切片中呈嗜酸性反应，病变神经元可含包涵体。大脑海马区神经元和小脑浦肯野细胞胞浆内检出狂犬病病毒包涵体，伴脑组织淤血、水肿。神经元变性abcdcp：豆状囊尾蚴虫卵的壳图2肝脏与肾脏的病变he染色a:豆状囊尾蚴在肝脏形成

8、包囊x200;b:脑神经元内多处包涵体x400c:肾小管结构模糊，破坏x200;d:肾小管上皮从基底膜脱落x400篇二：he染色实验技术服务说明he染色实验技术服务说明-上海高校科研技术实验室he服务简介苏木精伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称he染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。he染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法客户提供样品：1，组织样本材料要新鲜，组织离体后应立即投入固定液(10%中性甲醛

9、、4%多聚甲醛，)中。2，细胞样本离心后弃去上清液加入3%戊二醛固定液。实验流程：(1) 二甲苯(i)15min二甲苯(ii)15min(4) (3)二甲苯：无水乙醇=1:12min100%乙醇(i)5min100%乙醇(ii)5min80%乙醇5min蒸馏水5min苏木精液染色5min流水稍洗去苏木精液1-3s1%盐酸乙醇1-3s稍水洗10-30s蒸馏水过洗1-2s0.5%伊红液染色1-3min蒸馏水稍洗1-2s80%乙醇稍洗1-2s95%乙醇(i)2-3s95%乙醇(ii)3-5s无水乙醇5-10min石炭酸二甲苯5-10min二甲苯(i)2min二甲苯(ii)2min二甲苯(iii)2m

10、in中性树胶封固检测周期二天左右提供结果预约及收费预约时间：早上9：0019：00(节假日不休)3.收费标准：30元/样本提供结果1. 1.染色后的切片；每张切片提供一张照片；完整的实验报告，包括具体实验方法、步骤、所用试剂、仪器等，将以电子或书面形式提交给您。篇三：实验技术he染色小鼠胚胎切片原位杂交(一)主要试剂及配制方法：原位杂交用10Xpbs储存液(0.5l体积配方)：向11烧杯中依次加入29.22gnacl,13.86gna2hpo412h2o和1.763gnah2po42h2o，然后加入400mlddh2o充分搅拌溶解，用固体naoh将ph调节至7.4，然后加入ddh2o定容至0.

11、5l，最后各组分终浓度为nacl=1.3mol/l，na2hpo4=70mmol/l，nah2po4=30mmol/l，高压灭菌后室温保存备用；1xpbs工作液：将10Xpbs储存液用灭菌水稀释10倍即可；10x甘氨酸溶液：称取甘氨酸10g溶于ddh2o或depc水中，最后补足ddh2o定容至1000ml,高压灭菌备用。该液为储备液，-20C储存。使用时用pbs将10x甘氨酸储备液稀释为工作液(1.0mg/ml)；5mnacl:在800ml水中溶解292.2gnacl，加水定容至1l，高压灭菌后室温保存备用；1mtris-hcl(ph7.5，ph9.5)：在800ml水中溶解121.91gtr

12、is碱,加入浓hcl调节ph值至所需值(应使溶液冷至室温后方可最后调定ph值)，然后加水定容至1l，最后高压灭菌，室温保存备用；f)1mmgcl2:在800ml水中溶解203.4gmgcl26h2o,用水定容至1l，高压灭菌，室温保存备用；20%(w/v)sds：20gsds溶解于80mlddh2o中,加热到68?c溶解,加热的同时用玻璃棒搅拌助溶，用浓盐酸调节ph值到7.2，加水至100ml，高温高压灭菌，室温保存备用；3%过氧化氢溶液：用于组织脱除血色,也可起到一定rnase抑制剂效果,使用时将h2o2原液(30%)用ddh2o稀释10倍即可使用；i)2g/mlproteinasek/pb

13、s:使用时配制，将proteinasek(20mg/ml,-20?c冷冻保存)用pbs稀释10000倍使用；j)乙酰化试剂：如配制40ml溶液,需加入530?l三乙醇胺,100?l冰乙酸,70?l浓hcl,ddh2o定容至40ml；k)ntbuffer：各种成分终浓度为0.1mtris-hcl(ph7.5),0.15mnacl。如配制1l该溶液,需加入100ml1mtris-hcl(ph7.5),30ml5mnacl,ddh2o定容至1l；l)ntmbuffer：各种成分终浓度为0.1mtris-hcl(ph9.5),0.1mnacl,0.05mmgcl2。如配制40ml该溶液，需加入4ml1

14、mtris-hcl(ph9.5),0.8ml5mnacl,2ml1mmgcl2，ddh2o定容至40ml；m)20xssc:如配制250mlnacl43.8g，二水合柠檬酸钠(c6h5o7na32h2o)22.1g,然后加入ddh2o至200ml，加入hcl或naoh调节ph至7.0，最后定容至250ml，高压灭菌备用；n)50xdenhardts:10g聚蔗糖(ficoll400),10g聚乙烯吡咯烷酮(pvp),10g牛血清白蛋白(bsa)用水定容至1l，过滤后-20?c保存备用；o)杂交液(预杂交液):即5xsschybridizationbuffer，各成分终浓度及用量如下表:注:配制

15、好的预杂交液在-20?c保存备用；p)马来酸缓冲液：含100mm马来酸(maleicacid，顺丁烯二酸)和150mmnacl,ph为7.5；如配制500ml该缓冲液:向400ml去离子水中加入4.38gnacl和5.81g马来酸，然后加入适量固体naoh调节ph至7.5，定容为500ml，灭菌后-20C保存备用；q)10x封闭剂(blockingreagent):向80ml马来酸缓冲液中加入10g的脱脂奶粉粉末，搅拌后定容至100ml，该溶液很难溶，需加热，可以直接高压灭菌致溶，然后-20C保存备用；（注：10x封闭剂也可用ntbuffer来配制）r）抗体溶液：抗体原液用1X封闭剂稀释500

16、0倍后使用，可回收存于4?c再使用；s）nbt溶液：把0.75g氯化氮蓝四唑（nbt）溶解于10ml70%的二甲基甲酰胺中，保存于4C。t）bcip溶液：把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（bcip）溶解于10ml的二甲基甲酰胺中，保存于4Cu）染色液：8-12卩lnbt/bcip混合溶液（nbt:bcip=1:1）加到1mlntm溶液中；v）10xte:tris-hcl（ph7.5）终浓度为0.1m,edta终浓度为0.01m，配制1l该溶液配方如下：100ml1mtris-hcl（ph7.5），加20ml0.5medta（ph8.0），定容至1l，高压灭菌室温保存备用。（二）主

17、要实验步骤：（1）切片脱蜡-杂交（第一天）a）将切片按一下顺序进行脱蜡并水饱和（室温下操作）：二甲苯5分钟（x3次）通风橱操作100%乙醇/pbs5分钟（X2次）镜检是否组织完整75%乙醇/pbs5分钟50%乙醇/pbs5分钟1xpbs5分钟（x2次）注意：防止脱片,如果组织有脱落的趋势,在每步操作中轻拿轻放,并且尽量水平放置片子。b）蛋白酶k处理：2卩g/mlproteinasek/pbs，室温反应5分钟左右；在杂交盒中放平操作，可将200300卩l蛋白酶k滴加于切片上形成液滴并刚好覆盖胚胎；蛋白酶k的作用是在胚胎切片上消化打孔；c）如果切片上在胚胎的心脏附近有红色的血迹，可用h2o2（终浓

18、度为3%室温漂白35分钟；d）用甘氨酸（终浓度为2mg/ml）处理10分钟，以终止蛋白酶k的消化和h2o2的漂白；应先配制20mg/ml的甘氨酸保存于4c冰箱,使用时用pbs稀释10倍；e）切片用pbs漂洗5分钟x两次后，用三乙醇胺乙酰化处理15分钟；0.1m三乙醇胺的配方是：530卩l三乙醇胺，70卩l37%hcl,100卩l冰醋酸，灭菌水补齐至40ml；f）pbs漂洗，室温，5分钟（x3次）；g）预杂交：将切片平放至密封小盒内,滴加预杂交液,使胚胎被完全覆盖；室温静置5分钟后，65?c放置1小时。可在盒底铺一层滤纸后加一些5xssc，以保持湿润；注意保持切片水平,防止杂交液侧流；h）杂交：

19、去掉预杂交液,加上含有300500ng/ml的探针的杂交液,盖上一层石蜡膜,并注意排出气泡；将小盒密封好,放入65?c恒温箱内,静置过夜；（2）抗体反应（第二天）a）揭掉切片上的石蜡膜,注意揭膜的时候要用镊子提一个角,后卷变压边揭。如果切片上液体已蒸发,可将切片放置5xssc中浸泡片刻再揭膜,泡下来也勉强可以；b）洗净：0.2xssc65?c12小时洗净；（用含0.1%sds的0.2xssc洗效果更好）0.2xssc室温10分钟；ntbuffer室温5分钟；c）封闭：将切片放入小盒内，加上1x封闭剂，室温反应1小时；d）抗体反应：去掉封闭剂，加上用1x封闭剂稀释的抗体溶液，4?c静置过夜（推荐

20、）或者37?c反应4小时；（3）染色（第三天）a）取出切片,洗净；b)ntbuffer，室温，5分钟(x3次)；c)ntm，室温，10分钟；d)将切片放至小盒内，加上染色液，室温，避光处反应；每隔一段时间观察一次染色情况；待染色信号强度较适合时，用te终止染色或者流水冲洗，停止染色；封片，取数据a)采用去离子水清洗；b)自然干燥；c)按以下步骤脱水：50%乙醇/pbs5分钟；75%乙醇/pbs5分钟；100%乙醇/pbs5分钟；d)在切片上加一滴中性树胶，盖上盖玻片；e)显微镜下观察，拍照。he染色苏木素、伊红染色，简称he染色，是组织学技术的常规染色方法，目的是增加组织细胞结构各部分的色彩差

21、异，利于观察。苏木精(hematoxylin，h)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(eosin，e)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。恒定优质he切片应该是红蓝相映，层次浓淡均为分明。(一)主要试剂及配制方法：a) 苏木精染料：先配制i液(苏木精1g加入到10ml无水乙醇中，搅拌溶解)和ii液(al2(so4)3?18h2o33.83g加入到200ml去离子水中)，将ii液煮沸溶解，去火，然后加入i液再煮沸，再去火，立即加入0.17gkmno4,再煮沸，冷却后加入冰醋酸8ml，过滤后室温保存过夜后

22、即可使用；1%尹红染料：0.025g伊红(又名曙红，醇溶性)加入到10ml75%乙醇中，然后加入冰醋酸调节ph至4.5左右，过滤后室温保存备用；1%盐酸乙醇：1ml75%乙醇中加入10itl浓盐酸混匀。(二)石蜡切片he染色法的基本步骤：(1)切片在二甲苯i、ii、iii中各脱蜡5分钟，直至完全透明；入100%、95%、85%、70%酒精，各级为25分钟。最后经去离子水洗后转入染液；苏木精染液染色2分钟；水洗玻片上多余染液，1%盐酸乙醇分化片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟；流水冲洗1530分钟，细胞核呈蓝色；(6)蒸馏水短洗；1%伊红染液染色30秒左右；经95%、100%酒精脱水，各级为23分钟；(9)二甲苯透明5分钟(X2次)；(可省略)可作透明度试验：在黑色背景下以光线照于切片如果见有乳白色斑片系脱水不足，需再行脱水。(10)封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其它成分呈深浅不同红色。