急性白血病细胞增殖的影响

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1、急性白血病细胞增殖的影响p90核糖体S6激酶(p90ribosomalS6kinase , RSK属于丝氨酸/苏氨 酸激酶，是丝裂原活化蛋白激酶( mitogen-activatedproteinkinase ， MAP)K / 细胞外信号调节激酶(extracellular-signalregulatedkinase , ERK信号通路下游重要的调控因子。在哺 孚L动物中，RSKgt族有RSK1 RSK2 RSK竽口 RSK4这4个亚型，约 73%- 80%勺氨基酸序列相同。RSK5白结构最显著的特性是具有 2个功 能区域，即C末端激酶活性区(C-terminalkinasedomain ,

2、 CTKD)及N 末端激酶活性区(N-terminalkinasedomain , NTKD。RSKh3 亚型的 CTKDfc要是接受上游的ERK言号，通过一系列丝氨酸部位的磷酸化及 自身磷酸化而快速有效地激活 NTKD从而对RS砥物实行磷酸化，在 调节细胞核信号、细胞周期、细胞增殖和蛋白合成等方面发挥重要作用。即使在人类肿瘤中未发现 RS罐因突变，彳1当前认为 RSK侪口 RSK2 为致癌基因，在恶性肿瘤的发生和发展中起促动作用2-5。RSKlf异性抑制剂BI-D1870可通过和AT喙争性结合NTKDK域，特异性抑制 RSK 活性而不影响其他天冬氨酸谷氨酸转运蛋白激酶如：AMP舌化蛋白激酶(

3、AMP-activatedproteinkinase , AMPK、MAPKS:死亡相关蛋白激酶 (death-associatedproteinkinase , DAPK 等的活性 6。BI-D1870 可抑制多种类型实体肿瘤细胞的增殖，促动细胞凋亡 6-8 。关于 BI-D1870对急性白血病(acuteleukemia , AL)细胞的作用及其机制尚未明确，本研究主要探讨BI-D1870 联合依托泊苷对人类AL 细胞的细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期分布的影响。1.1 主要试剂RPMI1640W养液和胎牛血清购自美国 Gibco公司，淋巴 细胞分离液购自美国 Mediatech公司，DMS赠

4、自美国Sigma公司，总 RNAI取试剂盒购自美国Invitrogen 公司，反转录试剂盒和实时荧光 定量PCR式剂盒购自日本TaKaR必司，实时荧光定量 PC网物由生工 生物工程(上海)股份有限公司合成，RSK卬制齐【J BI-D1870购自美国Selleck 公司，化疗药物依托泊苷注射液购自江苏恒瑞医药股份有限公司，CCK-8购自日本Dojindo公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、荧光染料碘化丙咤(propidiumiodide , PI)和细胞周期检测试 剂盒均购自美国BD公司。1.2 细胞及细胞培养急性T淋巴细胞白血病细胞 Molt-4和Jurkat、 急性 B 淋

5、巴细胞白血病(acuteB-lymphoblasticleukemia , B-ALL)细 胞 Nalm-6、急性单核细胞白血病(acutemonocyticleukemia , AML 细 胞THP1和U937以及急性早幼粒白血病细胞 NB-4这6种人类AL细胞 均由同济大学附属同济医院药物临床试验研究机构所属实验室传代培养。这6种细胞均用含10咖台牛血清的RPMI1640W养液，置于37C、 CO昨积分数为5%勺恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实 验。1.3 实时荧光定量PCR&检测AL细胞中RSK侪口 RSK2mRNA表达水平 收集上述6种AL细胞及用淋巴细胞分离液分离的健康志愿

6、者外周血单 核细胞，按照总RNAI取试剂盒操作说明书提供的方法提取细胞总RNA紫外分光光度计测定D260nm/D280nml值，鉴定RNA勺纯度和浓量。 应用反转录试剂盒和实时荧光定量 PCR式剂盒将1区g总RNAK转录合 成cDNA以此cDNA模板实行实时荧光定量PCR检测细胞中RSK1 和RSK2mRNA表达水平。RSK1游弓I物序列为5 -ATT- GGTGTGGGCTCCTACTC-下游引物序歹U为 5- CATACAGGATGTTGCTGGGCRSK2游引物序歹U为 5- ATCAAGCCACCGT-TCAAACC吓游引物序歹U为 5 -ACTCGGT- GTCTGTGGCTTTA-

7、;内参照 p -actin 上游引物序列为5- CTGGATTCTGGCGATGGT3GTAT游引物序歹U为 5 -CGGACAATT- TCACGTTCAGCA-。PC皈应条件：95 c 预变性 30s; 95 C 5s、 60c 34s、72c延伸40s,共40个循环。以2 ACt法计算RSK侪口 RSK2mRNA表达水平，a=目的基因Ct值内参照基因Ct值。1.4 CCK-8法检测BI-D1870和依托泊昔对AL细胞增殖的影响1.4.181- D1870 对 Molt-4、Jurkat、 Nalm-6、 THP1 U937和 NB-4细 胞增殖的影响取对数生长期的 Molt-4 、 Ju

8、rkat 、 Nalm-6、 THP1、 U937 和NB-4细胞接种于96孔板中(1X105个/mL, 100区L/孔)，并给予10.0 w mol/L6BI-D1870 处理（BI-D1870 用 DMSd己制，作为实验组）， 同时设置对照组（细胞用含与 BI-D1870处理组相同浓度的DMS怎行 处理）和空白组（不含细胞的培养液），每组设3 个复孔。当 BI-D1870处理细胞 0、6、12、24 和 48h 时，加入 CCK-810 L/孔，37c 反应2h,上酶联免疫检测仪测定波长为 450nm处各孔的吸光度（D）值, 计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（% =1（实验组D值空 白组

9、D值）/ （对照组D值空白组D值）X 100%1.4.2 不同浓度 BI-D1870 及依托泊苷单药对Molt-4 细胞增殖的影响按 1.4.1 节的方法接种 Molt-4 细胞，分别给予 0.5 、 1.0、 2.0、 4.0 、 8.0、10.0 mol/L 的 BI-D1870 及 0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 wg/mL的依托泊甘单药处理，对照组和空白组的设置与1.4.1节的方法相同，每组设3个复孔。 BI-D1870 和依托泊苷单药处理细胞24h后，加入CCK-81小L/孔，37c反应2h,上酶联免疫检测仪测定波长 为450nm处各孔的吸光度（D）值。按1.4.1节的

10、方法计算细胞增殖抑 制率，应用 Excel 软件计算 BI-D1870 和依托泊苷作用 Molt-4 细胞 24h 的半数抑制浓度（ halfmaximalinhibitoryconcentration ， IC50 ）值。1.4.3BI-D1870 联合依托泊苷对Molt-4 细胞增殖的影响按1.4.1 节的方法接种Molt-4细胞，分别给予40%口 60%IC5雁的BI-D1870 （即 3.0 区 mol/L 和 4.0 区 mol/L）和依托泊甘（即 0.2 区 g/mL 和 0.3 g/mL） 单药及 BI-D1870 联合依托泊苷处理Molt-4 细胞，对照组的设置与1.4.1 节

11、的方法相同，每组设3个复孔。 BI-D1870 和依托泊苷单药及BI-D1870联合依托泊昔处理细胞24h后，加入CCK-810 L/孔，37c 反应2h,上酶联免疫检测仪测定450nm波长处各孔的吸光度（D）值。按1.4.1节的方法计算细胞增殖抑制率，并应用金（正均）氏公式0=E （a+b） / （Ea+ Eb Eax Eb） , Ea为 BI-D1870 单药干预后的细胞增 殖抑制率，Eb为依托泊昔单药干预后的细胞增殖抑制率， E （a + b）为 联合用药干预后的细胞增殖抑制率判定 2种药物间的相互作用。当QK 0.85时，2药联合具有拮抗作用；当0.85 WQ 1.15时，2药联合为单

12、 纯相加作用；当 81.15时，2药联合具有协同作用。1.5FCM法检测BI-D1870和依托泊昔对Molt-4细胞凋亡及细胞周期分布的影响1.5.1BI-D1870 对 Molt-4 细胞凋亡的影响取对数生长期的 Molt-4 细 胞接种于6孔板中（1.5 X 106个/孔），给予7.0 wmol/L的BI-D1870（BI-D1870的IC50值为7.0 口 mol/L ）处理，对照组的设置与1.4.1 节的方法相同。BI-D1870处理Molt-4细胞24h后，应用Annexin V- FITC 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。收集待检测的各组细胞，调整细胞密度为1X106j/mL, P

13、BSa涤后，加入 100wL1XBindingBuffer、5 LAnnexin V-FITC 和 5 区 LPI,室温避光 反应 15min;加入 400 区 L1 x BindingBuffer , 4 c避光反应 15min,于 1h 内上流式细胞仪检测细胞的凋亡率。1.5.2BI-D1870 对 Molt-4 细胞周期分布的影响取对数生长期的 Molt-4细胞接种于直径为10cm的培养皿中（密度为5X106个/皿），给予 7.0区mol/L的BI-D1870处理，对照组的设置与1.4.1节的方法相同。 收集BI-D1870作用24h后的Molt-4细胞，应用细胞周期检测试剂盒 检测Mo

14、lt-4细胞的细胞周期分布情况。在收集的细胞中加入6mL75骑乙醇溶液，4c固定过夜；PBSa涤细胞，将细胞重悬于0.5mLPI染色 液中，室温避光反应15min,于1h内上流式细胞仪（上流式细胞仪分 析前，样品置于4 避光保存）分析细胞周期的分布情况。1.5.3BI-D1870 联合依托泊苷对Molt-4 细胞凋亡的影响取对数生长期的Molt-4细胞接种于6孔板中（1.5 X 106个/孔），分别给予4.0区mol/L的BI-D1870和0.3 g/mL的依托泊昔单药及 4.0 mol/L 的BI-D1870联合0.3区g/mL的依托泊昔处理，对照组的设置与 1.4.1 节的方法相同。收集药

15、物处理24h 后的各组细胞，按1.5.1 节的方法检测各组细胞的细胞凋亡情况。1.6统计学方法本研究中的各项实验均重复 3次。应用SPSS13.0软件 对实验的结果数据实行统计分析。计量资料以士s 表示，两独立样本间 的比较采用 t 检验；多组间均数的比较采用方差分析，组间两两比较采用SNKfeo以P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 多种AL细胞中RSK1和RSK2mRNA表达水平上调应用实时荧光定 量PCR&检测了 6种AL细胞及健康志愿者外周血单核细胞中RSK1和RSK2mRNA表达水平。结果（图1）显示，除Nalm-6细胞以外， Molt-4 和 THP1 细胞中 RSKIm

16、RNA表达水平以及 Molt-4、Jurkat、 THP1 U937和NB-4细胞中RSK2mRNA表达水平均高于健康志愿者外 周血单核细胞（P值均 0.05 ）。2.2 RSK抑制齐1J BI-D1870和依托泊昔抑制AL细胞的增殖221BI-D1870 可显著抑制AL细胞的增殖应用CCK-8法检测10.0 mol/L 的 BI-D1870 处理 Molt-4、Jurkat、Nalm-6、THP1 U937 和NB-4细胞0、6、12、24和48h后细胞的增殖情况。结果（图 2A） 显示，随着BI-D1870 作用时间的延长， 6种细胞的增殖抑制率逐渐递增（P 0.05）,以Nalm-6和M

17、olt-4细胞较为显著。2.2.2BI-D1870 与依托泊苷可协同抑制 Molt-4 细胞的增殖分别给予Molt-4 细胞 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mol/L 的 BI-D1870 及 0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 wg/mL的依托泊昔单药处理 24h后，应 用CCK-8法检测细胞的增殖情况并计算 BI-D1870和依托泊昔作用 Molt-4细胞24h的IC50值。结果（图2B和2C）显示，BI-D1870和依 托泊昔作用于Molt-4细胞24h的IC50值分别为7 mol/L和 0.5 wg/mL。分别给予 40骑口 60%IC5雁的 BI-D18

18、70 （即 3.0 mol/L 和4.0区mol/L）和依托泊甘（即0.2 wg/mL和0.3 g/mL）单药及BI- D1870联合依托泊昔处理 Molt-4细胞24h后，应用CCK-8法检测细胞 的增殖情况，并计算2药联合的Q值。结果（图2D和2E）显示，2药 联合组细胞的增殖抑制率高于各单药组（P值均 0.01 ）。3.0区mol/L 的BI-D1870联合0.2区g/mL的依托泊昔作用时，Q= 1.19 ;4.0区mol/L的BI-D1870联合0.3 g/mL的依托泊昔作用时，Q= 1.20 所以， BI-D1870 联合依托泊苷可协同抑制 Molt-4 细胞的增殖。2.3BI-D1

19、870和依托泊昔促动AL细胞的凋亡并阻滞细胞周期进程2.3.1BI-D1870 可诱导Molt-4细胞凋亡并阻滞细胞周期于 G2/M期 FCMfc检测7.0mol/L的BI-D1870处理Molt-4细胞24h后细胞的凋 亡和周期分布情况。结果（图 3A和3B）显示，BI-D1870处理组Molt- 4细胞的凋亡率明显高于对照组（P 0.01） ; BI-D1870处理组G2/M 期细胞所占百分比明显高于对照组（P0.05）。2.3.2BI-D1870 可增强依托泊甘诱导的 Molt-4细胞凋亡FCMfc检测 4.0区mol/L的BI-D1870和0.3 g/mL的依托泊昔单药及 4.0 mo

20、l/L 的BI-D1870联合0.3g/mL的依托泊昔处理24h后Molt-4细胞的凋 亡情况。结果（图3Q显示，BI-D1870和依托泊昔单药处理组 Molt-4 细胞的凋亡率均明显高于对照组（P值均0.05）,并且BI-D1870联 合依托泊昔处理组Molt-4细胞的凋亡率明显高于各单药组（P值均 0.01 ）。这个结果说明， BI-D1870 可促动依托泊苷诱导的细胞凋亡。3 讨论AL 是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆的白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，细胞发育停滞于较早阶段9。化疗仍是当前治疗AL的主要方法，虽然绝大多数 AL患者化疗后能够获得较高的缓解率， 但化疗药物的不良

21、反应较大，有时甚至危及生命，而且部分患者在获 得完全缓解后会出现疾病复发或对当前传统的化疗药物有原发性耐药，预后极差。所以，探索新的靶向药物已成为当今 AL亟待解决的问题。 Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是细胞重要的MAPI路之一，常常在生长 因子、细胞因子及分裂素等刺激后被激活，介导细胞的分化、增殖、存活及原癌基因的转化。MAPK/ER借号通路在人类恶性肿瘤中常被异 常激活，在恶性肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。而且，30%以上恶性肿瘤患者存有MAPK/ERK1号通路的基因突变，并在 AL中发生更 为频繁。Ras、Kit 和 Fms样酪氨酸激酶（3Fms-liketyrosinek

22、inase3 , Flt3 ）以及血小板衍生生长因子受体（ platelet- derivedgrowthfactorreceptor , PDGFR 等基因突变可导致 MAPK/ERK 信号通路的异常激活。MAPK/ERK1路的基因突变是不良预后的相关因 子，与白血病化疗药物的耐药密切相关10。染色体易位产生的融合基Bcr/Abl 、融合基因 TELtranslocationerythroblasttransformation-specificleukemia /PDGF喏也可激活该通路。另外，某些化疗药物会诱发MAPK/ERK勺级联反应，促动耐药的发生。所以，阻断MAPK/ERK路有望增强

23、传统化疗药物的疗效，克服耐药性， 改善AL患者的预后。当前已经开发了针对 Ras、Raf、ME双ERK勺抑 制剂，并开始用于临床试验。虽然这些抑制剂表现出了相对应的疗效，但仍会发生复杂的并发症。RS提位于MAPK/ER借号通路下游的重要 调控因子，通过对底物实行磷酸化而调节细胞核信号、细胞周期、细胞增殖、蛋白合成和细胞移行等 1。研究发现，RSK1和RSK2在孚L腺癌、 前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤及骨肉瘤等多种实体肿瘤细胞中高表达，且伴有蛋白活性的增高；抑制 RSK舌性或敲除RSK1和RSK2的表达可 抑制实体肿瘤细胞的增殖。本研究发现，RSK侪口 RSK2mRNA多种AL细胞中高表达；RSK卬

24、制剂BI-D1870可抑制多种AL细胞的增殖，诱导 Molt-4细胞凋亡并将其阻滞于 G2/M期。虽然在Nalm-6细胞中RSK1和 RSK2mRNA表达水平较低，但 BI-D1870对Nalm-6细胞的增殖抑制率 最高，作者认为这可能与该细胞中RSK蛋白活性增高或其他机制相关，具体机制有待进一步研究。绝大多数化疗药物（如：依托泊苷等）主要是通过破坏白血病细胞DNA勺完整性，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤的作用14。不过，化疗药物造成的DN硼伤可激?S细胞内DN龈伤应答信号通路，使受损的 DNA 得到即时修复，从而减弱化疗药物的疗效或导致耐药的发生。完整的DN龈伤应答信号通路包括 DNA伤感知复合物

25、DN硼伤修复蛋白、毛 细血管扩张性共济失调症突变激酶、Rad3相关激酶、DNAR赖性蛋白 激酶、细胞周期检控点激酶、效应复合物和细胞分裂周期基因。研究发现，RS阿通过直接磷酸化细胞周期检控点激酶 1的Ser280位点，改变细胞周期检控点激酶1 在细胞内的位置或细胞周期检控点激酶1活性，促动肿瘤细胞的DN硼伤应答15。DN硼伤亦可激活RSK2使 其在细胞核内与毛细血管扩张性共济失调症突变相互作用，通过毛细血管扩张性共济失调症突变/p53信号通路，促动DN硼伤的修复16。本研究检测了 BI-D1870 联合依托泊苷对Molt-4 细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响，考虑到应用BI-D1870和依托

26、泊昔A IC50值的药物浓度处理细胞可能无法有效观察二者的协同效应，所以本研究选用 BI- D1870和依托泊昔40崎口 60%IC50的浓度处理细胞，发现 BI-D1870 联合依托泊苷可协同抑制细胞的增殖，促动细胞凋亡。作者推测，通过抑制化疗药物所激活的DN龈伤应答反应可能是RSK卬制剂的作用 机制之一。综上所述，RSK侪口 RSK2mRNA多种AL细胞中呈高表达； RSK卬制剂能有效抑制856曹雨娜，等.RSK抑制剂BI-D1870对急性白 血病细胞增殖的影响多种 AL细胞的增殖，其机制可能与 RSK卬制剂诱 导细胞凋亡和阻滞细胞周期相关；而且， BI-D1870 联合化疗药物依托泊苷可协同抑制细胞的增殖，促动依托泊苷诱导的细胞凋亡。作者推测，RSK卬制剂BI-D1870可能是治疗AL潜在的分子靶向药物。急性白血病细胞增殖的影响