基因文库与筛选学习教案

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1、会计学1基因文库与筛选基因文库与筛选(shixun)第一页，共60页。第1页/共59页第二页，共60页。第2页/共59页第三页，共60页。第3页/共59页第四页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第4页/共59页第五页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第5页/共59页第六页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第6页/共59页第七页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第7页/共59页第八页，共60页。基因文库的好坏要看该文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未因克隆基因文库的好坏要看该文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未因克隆(k l

2、n)操作丧失其中的基因或某些序列。操作丧失其中的基因或某些序列。 构建基因文库时，一个最重要的指标就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆盖所有原初序列构建基因文库时，一个最重要的指标就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆盖所有原初序列(代表性文库代表性文库)?如果某些序列如缺少限制性酶切位点的重复序列未被克隆如果某些序列如缺少限制性酶切位点的重复序列未被克隆(k ln)，这样的文库就不具代表。，这样的文库就不具代表。同样如果文库中未能含有足量的克隆同样如果文库中未能含有足量的克隆(k ln)，则极有可能会丢失某些基因。富含某种序列的，则极有可能会丢失某些基因。富含某种序列的cD

3、NA文库显然会缺少其他一些基因，但若正确制备并扩增，也可以成为富含文库显然会缺少其他一些基因，但若正确制备并扩增，也可以成为富含mRNA起始材料的具代表性的文库。起始材料的具代表性的文库。具有具有(jyu)代表性的基因组文库代表性的基因组文库第8页/共59页第九页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学只有当此文库中重组子总数达到只有当此文库中重组子总数达到(d do)某一值时，才能包含基因组某一值时，才能包含基因组中所有基因，才可称之为完整基因组文库。所需重组子数目主要取决中所有基因，才可称之为完整基因组文库。所需重组子数目主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小。于基因组的大小

4、和目的基因片段的大小。 1975 年，年，Clarke 和和Carbon 提出了一个计算这一重组子数目的公式。提出了一个计算这一重组子数目的公式。第9页/共59页第十页，共60页。第10页/共59页第十一页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第11页/共59页第十二页，共60页。第12页/共59页第十三页，共60页。第13页/共59页第十四页，共60页。第14页/共59页第十五页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第15页/共59页第十六页，共60页。 质粒、噬菌体、粘粒、BAC或酵母(jiom)人工染色体等载体都可被用来构建基因组文库，选用哪种载体取决于基因组的大

5、小。这些载体所能插入的片段大小的上限分别依次为10kb、23kb、45kb、350kb和1000kb用T4DNA连接酶将基因组DNA片段与制备好的载体分子相连接。 第16页/共59页第十七页，共60页。第17页/共59页第十八页，共60页。第18页/共59页第十九页，共60页。第19页/共59页第二十页，共60页。第20页/共59页第二十一页，共60页。质粒载体质粒载体(zit)的宿主菌的宿主菌第21页/共59页第二十二页，共60页。第22页/共59页第二十三页，共60页。第23页/共59页第二十四页，共60页。第24页/共59页第二十五页，共60页。第25页/共59页第二十六页，共60页。南

6、京南京(nn jn)林业大学林业大学第26页/共59页第二十七页，共60页。通常不用原核mRNA来构建cDNA文库，因为原核mRNA通常不稳定；相比之下则较易制备基因组文库，且可包含所有基因组序列。从真核mRNA构建cDNA是非常(fichng)有用的，因为cDNA不含内含子序列，可被用来在大肠杆菌中表达编码蛋白。 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料(cilio)直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶

7、段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库文库(wnk)第27页/共59页第二十八页，共60页。第28页/共59页第二十九页，共60页。cDNA文库(wnk)的构建：基因(jyn)重组反转录反转录(zhun (zhun l)l)酶酶mRNAmRNAcDNAcDNA第29页/共59页第三十页，共60页。第30页/共59页第三十一页，共60页。第31页/共59页第三十二页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第32页/共59页第三十三页，共60页。南京南京

8、(nn jn)林业大学林业大学mRNA完整性的检测完整性的检测 1)mRNA分子的大小分子的大小(dxio)： 哺乳动物哺乳动物mRNA长度为长度为500-8000bp，大部分，大部分mRNA位于之间位于之间. 2)总总mRNA指导合成指导合成cDNA第一链长分子的能力第一链长分子的能力第33页/共59页第三十四页，共60页。mRNANARNA第34页/共59页第三十五页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第35页/共59页第三十六页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第36页/共59页第三十七页，共60页。第37页/共59页第三十八页，共60页。末端(m dun)

9、转移酶DNA聚合酶I缺失5至3外切酶活性的截短部分第38页/共59页第三十九页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学双链双链cDNA末端的形成及其接头末端的形成及其接头(ji tu)添加添加第39页/共59页第四十页，共60页。基因组基因组DNADNA文库文库(wnk)(wnk)cDNAcDNA文库文库(wnk)(wnk)附：基因组DNA文库(wnk)与cDNA文库(wnk)的比较第40页/共59页第四十一页，共60页。第41页/共59页第四十二页，共60页。第42页/共59页第四十三页，共60页。第43页/共59页第四十四页，共60页。第44页/共59页第四十五页，共60页。南京

10、南京(nn jn)林业大学林业大学第45页/共59页第四十六页，共60页。第46页/共59页第四十七页，共60页。第47页/共59页第四十八页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第48页/共59页第四十九页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第49页/共59页第五十页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第50页/共59页第五十一页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第51页/共59页第五十二页，共60页。南京南京(nn jn)林业大学林业大学第52页/共59页第五十三页，共60页。放射性抗体放射性抗体(kngt)检测检测法法滤膜（固定滤膜

11、（固定(gdng)抗体）抗体）+第53页/共59页第五十四页，共60页。第54页/共59页第五十五页，共60页。扣除(kuch)杂交（Subtractive Hybridization） 第55页/共59页第五十六页，共60页。Section I: Gene libraries and screeningmRNAcDNA应用细胞(xbo)外翻译系统第56页/共59页第五十七页，共60页。Section I: Gene libraries and screeningmRNAmRNAcDNA第57页/共59页第五十八页，共60页。染色体步移染色体步移 从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作

12、为探针筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步.是一种重要(zhngyo)的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。第58页/共59页第五十九页，共60页。NoImage内容(nirng)总结会计学。P 为选出某一基因的概率(通常期望为99%)。a) 确定限制(xinzh)酶用量，改变酶切时间。b) 固定酶切时间，改变限制(xinzh)酶的用量。DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷。长到一定浓度后，加入终浓度为25%。杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。染色体步移第六十页，共60页。