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1、石蜡切片提取DNA步骤注意事项：1所有离心步骤在室温（15-25）下完成2 新鲜组织样品取样量约为20 mm3, 从石蜡块上切下的组织，每次制备最大量每片10 m，最多8片,每片大约 250 mm2,如果对样品总量和产量没有把握，建议用2-3片样品进行一次预实验。准备事项：1将样品置于室温2将水浴锅或其他加热设备预热至56，以备第11步使用3若Buffer AL产生沉淀，可在70水浴锅中水浴将其融解4向Buffer AW1中加入25 ml乙醇（96%-100%），向Buffer AW2中加入30 ml乙醇（96%-100%），每次使用之前摇一摇使溶液混匀，室温下保存一年操作步骤1. 使用手术刀
2、，修剪多余的石蜡样本块。2. 至少切割8个样品截面，厚度为5 10 m。如果样品表面暴露在空气中，丢弃第一个2 - 3部分。3. 立即将切割样品放在1.5或2 ml微型离心管（试剂盒中没有提供），然后向样品中添加1毫升二甲苯。合上离心管盖子，充分涡旋大于10秒。4. 离心机在室温(15 - 25C)全速离心2分钟。5. 使用移液器除去上清，小心不要移除任何沉淀颗粒。6. 向沉淀颗粒加入1 ml乙醇（96 - 100%），并且涡旋混匀。乙醇可以溶解样品中残余的二甲苯。7. 离心机在室温全速离心2分钟。8. 使用移液器除去上清，小心不要移除任何沉淀颗粒。使用适当的微量移液器小心除去残存乙醇9. 打
3、开离心管，在室温或者37C下孵育10分钟或直到样品中的残留乙醇蒸发干净。10. 向离心管中加入180 l的ATL和20 l的蛋白酶K，涡旋混匀。11. 56C孵育一个小时（或者孵育至样品完全溶解）。12. 90C孵育一个小时。样品在ATL缓冲溶液中90C孵育时可以部分逆转甲醛对核酸的损害。但是过长的孵育时间和过高的孵育温度可能会导致更多的断裂的DNA产生。如果孵育采用同一个模块进行，再上一步56C孵育后样品要降至室温，直到加热模块达到90C后，再进行孵育。13. 将1.5 ml离心管瞬时离心，将管盖上的液体离心下来。如果需要RNA-free基因组DNA，则需要在继续步骤14之前加入2 l RN
4、aseA(（100 mg/ml），孵化2分钟。再加入RNaseA之前，样品需要冷却到室温。14. 加入200 l缓冲夜AL到样品中，涡旋混匀。然后再加入200 l乙醇(96 - 100%)，涡旋混匀。至关重要的是样品、缓冲液AL、和乙醇需要立即彻底涡旋混匀，或者使用移液器将溶液混匀。缓冲液AL和乙醇可以提前进行预混，缓冲液AL和乙醇可以提前预混后一起加入待处理的样品中。在加入缓冲液AL和乙醇后会有白色沉淀物产生，这种白色沉淀并不会影响QIAamp的提取过程。15. 将1.5 ml离心管瞬时离心，将管盖上的液体离心下来。16. 将全部裂解液小心的转移到2 ml收集管里的QIAamp提取柱中（尽量
5、将溶液转移至提取柱中央），盖紧离心管盖，以6000g(8000 rpm)离心1分钟。将离心管取出，放入一支洁净的2 ml收集管中，丢弃收集管及其中液体。如果离心后还有裂解溶液没有通过柱膜，再次以更高转速离心直到QIAamp提取柱中没有残留溶液。17. 小心打开QIAamp提取柱的盖子，向柱心加入500 l缓冲液AW1。盖紧离心管盖，以6000g(8000 rpm)离心1分钟。将离心管取出，放入一支洁净的2 ml收集管中，丢弃收集管及其中液体。18. 小心打开QIAamp提取柱的盖子，向柱心加入500 l缓冲液AW2。盖紧离心管盖，以6000g(8000 rpm)离心1分钟。将离心管取出，放入一
6、支洁净的2 ml收集管中，丢弃收集管及其中液体。避免QIAamp提取柱与收集管中的流出液接触。某些离心机转子在离心减速时会发生振动，使含有乙醇的收集管中的流出液接触到QIAamp提取柱。将QIAamp提取柱和收集管从离心机中取出时要小心，避免收集管中的流出液接触到QIAamp提取柱。19. 将QIAamp提取柱置于一支新的2 ml收集管中，离心机全速离心(20000 x g，14000 rpm)尽量甩干柱膜。这个步骤非常重要，因为在流出液中的乙醇会干扰下游的核酸扩增实验。20. 将QIAamp提取柱置于一支洁净的1.5 ml的离心管中（自卑），丢弃收集管及其中液体。小心打开QIAamp提取柱的盖子，向柱心加入20-200 l缓冲液ATE。注：确保ATE在使用前已平衡置室温。如果采取小量洗脱（ 50 l），将缓冲液ATE加入到离心柱的柱心，确保柱膜上吸附的DNA可以被完全洗脱。QIAamp提取柱在洗脱液体系的选择性上有很大的灵活性，可以根据下游扩增实验而选择适当的洗脱体积。得到的洗脱产物比加入的洗脱液要少5 l。21. 盖上盖子，在室温下静置1分钟，离心机全速离心(20000 x g，14000 rpm)1分钟。离心前缓冲液ATE在QIAamp提取柱上室温静置5分钟会大大提高DNA的产量。
QIAamp-DNA-FFPE-Tissue
