C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文

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1、其次探讨了C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其作 用机制。水牛COCs先在含不同浓度CNP(0 nM，100 nM，200 nM，400 nM)的成熟液中预培养6 h，然后常规成熟培养18 h(即总成熟时间为 24 h)。结果发现，200 nM处理组的卵母细胞成熟率(6836VS 6121) 及随后体外受精(In vitro fertilization，IVF)胚胎的分裂率(7520VS6486)、囊胚率(2364VS 1629)均显著高于对照组(氏O05)。选 定200 nM为水牛卵母细胞成熟液中CNP适宜添加浓度，探讨CNP处理 的适宜时间。结果显示：CNP预培养COCs 6 h

2、或9 h后，卵母细胞的成 熟率(6872和6685)、IVF卵裂率(7503和7396)和囊胚率 (2438和2319)均显著高于对照组(6203，6683和1835，PO05)。然而，200 nM CNP预培养处理裸卵6 h对其成熟率(4236VS 4197)、IVF分裂率(4973VS 5036)和囊胚率(235VS 246) 均没有显著影响(胗O05)。地衣红染色结果显示：200 nM CNP预培养 处理水牛COCs 6 h能显著推迟卵母细胞GVBD的发生时间(PO05)。 QRT-PCR检测结果发现：水牛COCs经200 nM CNP培养处理6 h后能显 著提高其卵丘细胞的Cx37和C

3、x43以及NPR2的mRNA表达水平(氏O05)，但下调了卵母细胞中PDE3A的mRNA表达(尸O05)。Elisa 检测发现： 200 nM CNP培养处理COCs 6 h能显著提高卵丘细胞、卵母 细胞中cGMP浓度(尸O05)，以及卵母细胞中cAMP的浓度(尸O05)；而NPR2的抑制剂G6 6976能显著降低CNP提升卵丘细胞中cGMP、卵 母细胞中cAMP浓度的幅度(P005)。以上结果表明：(1)CNP及其特异性受体NPR2的mRNA在水牛卵万方数据巢中呈现高水平表达，其中CNP主要表达在颗粒细胞，NPR2主要表达 在卵丘细胞，但二者在卵母细胞均未见表达；(2)适宜浓度(200nM)

4、的 CNP培养处理水牛卵母细胞一定时间(6h)能推迟其减数分裂的恢复， 这一作用可能是通过CNP与其受体NPR2相结合，产生cGMP，经缝隙 连接途径传递到卵母细胞中，抑制PDE3A的表达，提高卵母细胞中cAMP 水平来实现的。关键词C型利钠肽水牛卵母细胞减数分裂恢复作用机制万方数据STUDIES RELATED TO T眦EFFECT ANDCHANISM OF CTYPE八ATRIURETIC PEPTIDE ON匝IOTIC RESI】-N【PTION OF BUFFALO OOCYTESAB STRACTC-type natriuretic peptide(CNP)is one of

5、the main members of the natriuretic peptides，which widely express in many tissues of mammalIt has been reported that CNP plays an important role in meiotic resumptionThe aim of this study was to investigate the effect of CNP on meiotic resumptionof buffalo oocytes and its regulation meschanism，SO as

6、 to provide a foundation for further optimizing the IVM culture system and improving the efficiency of in vitro embryos productionFirstly,the mRNA expression of the mainly natriuretic peptides and their receptors in buffalo ovary were detected，the result of qRT-PCR showed that the mRNA expression of

7、 CNP was significantly higher than ANP and BNP畔O05)，and the mRNA expression of NPR2 was significantly higher thanNPRl俨005)Then the expression of CNP and its receptor NPR2 in buffalo follicles and COCs were further investigated by using the qRT-PCR， immunochemistry and immunofluorescence technologyTh

8、e result indicated that the protein of CNP and NPR2 were detected in all stages of follicles，CNPV万方数据mainly expressed in mural granulosa cells and NPR2 primarily presented in cumulus cellsMoreover,the mRNA expression of CNP in granulosa cells wassignificantly higher than in cumulus cells，the mRNA ex

9、pression of NPR2 incumulus cells was significantly higher than in granulosa cellsHowever,theboth of CNP and NPR2 had no expression in oocyteSecondly,the effect of CNP on meiotic resumption of buffalo oocytesand its regulation meschanism were preliminary studiedBuffalo COCs were respectively cultured

10、 in the maturation medium supplemented with different concentrations of CNP(O nM，1 00 nM，200 nM，400 nM)for 6h，then moved into the maturation medium without CNP to culture for 1 8h，which meanedCOCs totally culturing for 24hThe result showed that 200 nM CNP significantly improved(氏O05)the maturity rat

11、e of oocytes(683 6VS 6 12 1)，the cleavage rate(7520VS 6486)and the blastocysts rate(2364Vs 1 629)of the subsequent IembryosThen，the suitabletreatment time of CNP was groped after selecting 200 nM as the appropriate treatment concentrationThe result indicated when COCs were cultured in the culture me

12、dium with 200 nM CNP for 6h or 9h，the maturity rate of oocytes (68。72and 6685)，the cleavage rate(7503and 7396)and the blastocysts rate(243 8and 231 9)of the subsequent IVF embryos weresignificantly higher than that of the control group(6203，6683and1 835，尸O05)on the maturity rate of the denuded oocyt

13、es(4236VS 4197)，the cleavage rate(4973Vs 5036)and the blastocysts rate(235VS 246)of the subsequent IembryosResult of cudbear dye stainning revealed that the time of GVBD in the oocytes could be significantly delayed pNPRlNPR3，这表明NPR2是CNP的 特异性受体。现己被认可的小鼠中经典CNPNPR2信号通路主要组成包括：CNP、 NPR2、cGMP等。当CNP结合受体NP

14、R2，改变受体激酶同型区域(kinase homologydomain，KHD)的构象，鸟苷酸环化酶活性被激活，越来越多的GTP转化为cGMP，下游通路被激活，cGMP能够与3种蛋白结合从而激活下游生理反应，分别为cGMP 依赖蛋白激酶G、PDE、环核苷门控离子通道蛋白【6l-64。6万方数据广西大掌硕士学位论文C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂1灰复的影响及其机制研究23 CNP在哺乳动物卵巢中的表达及功能231 CNP在哺乳动物卵巢中的表达 利钠肽成员中，最先被发现在卵巢上表达的是ANP，并且证实了ANP对促性腺激素的合成起到了调节作用65，66】，人们逐渐意识到利钠肽对雌性生殖功能发挥作用

15、。 自此，研究者们开始分析CNP和NPR2在不同哺乳动物卵巢的表达模式。Stepan等【67】 对未交配小鼠各组织中CNP的表达进行了定量分析，发现卵巢中CNP的mRNA表 达量是其他组织的数十甚至上百倍，甚至超过了肾脏和大脑。Reis等【68研究发现， CNP及其受体NPR2的蛋白和mRNA在大鼠卵巢表达，并且受到动情周期的调控， 在发情前期表达最高。以上研究揭示，CNP及其受体在哺乳动物卵巢强表达，可能受 到激素调节。Noubani等【69】运用原位杂交技术定位了大鼠卵巢中CNP和NPR2，结果 在卵泡间质细胞和膜细胞上发现CNP的阳性表达，在颗粒细胞上发现NPR2阳性表 达。Cheng等

16、【53】发现随着卵泡的发育，卵泡中CNP和NPR2的mRNA表达显著增强， CNP蛋白水平也逐渐增加。Zhang等【70】通过qRT-PCR和原位杂交的方法研究了CNP和NPR2在小鼠卵母细胞和卵泡细胞中的定位与表达，发现CNP和NPR2的mRNA 在卵母细胞上没有表达，卵泡细胞中的壁层颗粒细胞主要表达CNP的mRNA，而卵 母细胞外围的卵丘细胞主要表达NPR2的mRNA，这对研究CNP及NPR2受体信号 通路奠定了基础。随后人们围绕CNP及其受体NPR2在大动物卵巢上的表达进行了 大量研究，其结果与小鼠类似。为研究CNP及其受体NPR2在卵巢中的表达调控，Jankowski等【71】分析了发

17、情周 期各阶段卵巢中CNP及其受体NPR2的mRNA表达情况，发现发情前期的CNP及其 受体NPR2的mRNA表达量高于其他时期，推测激素能调控CNP及NPR2的表达。 为证实这一观点，Noubani等【69】对大鼠注射了外源马绒毛膜促性腺激素和雌激素，分 析它们对卵泡细胞中CNP及NPR2的表达的影响，结果表明外源马绒毛膜促性腺激 素和雌激素提高了受体NPR2在卵泡细胞的表达，但对CNP的表达没显著影响。这 一结果虽然有一定意义，但是他们并未分离不同类型的卵泡细胞，即将颗粒细胞和卵 丘细胞分离出来。而Zhang等【70】在体外培养液中添加FSH和雌激素处理小鼠COCs，发现FSH对卵丘细胞中

18、NPR2的表达没有显著影响，而雌激素则提高了卵丘细胞中 NPR2的表达；注射外源马绒毛膜促性腺激素也能提高卵丘细胞中NPR2的表达。Lee 等【72】发现单独添加FSH对颗粒细胞中CNP的mRNA表达没有影响，注射雌激素的同万方数据广西大掌硕士掌位论文C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究时添加FSH，CNP的表达显著高于单独注射雌激素。以上结果表明，FSH作用于雌 激素间接调节CNP及其受体NPR2的mRNA表达。另有一些研究表明LH也参与了 CNP及其受体NPR2在卵巢中的表达调控。Wang等【73】发现添加LH能激活EGF受体 信号通路，下调体外培养的卵丘卵母复合体中NP

19、R2的mRNA表达。232 CNP对卵母细胞减数分裂恢复的作用 卵母细胞成熟质量是保证体外胚胎生产效率的前提，而在哺乳动物胚胎体外生产工作中，人们发现卵母细胞一旦脱离了卵泡液环境，没有了促性腺激素的刺激，细胞 核会迅速自发地启动减数分裂，提前完成成熟。但细胞质发育并未成熟，各细胞器尚 未具备完全成熟的能力。虽然卵母细胞排出第一极体，发育到M II期，但受精后很难 得到囊胚。甚至无法卵裂。这反映了卵母细胞核质发育同步、协调成熟的重要性。为 了更好的模拟体内环境，促进卵母细胞质积累足够的蛋白质和母源mRNA，研究者们 开发了更为科学的体外两步成熟法。顾名思义，就是将体外成熟分为两步，第一步在 培养

20、液中添加减数分裂抑制剂成熟培养一段时间，然后再放入没有减数分裂抑制剂的 培养液中进行常规成熟。目前，许多研究者采用两步成熟法探讨不同的减数分裂抑制 剂对卵母细胞发育能力的影响，结果却并不一致。Miyano等74】、Vanhoutte等【75】、 Thomas等【76】分别选取抑制剂PDE3A、丁内酯I、次黄嘌呤处理人、绵羊、牛的卵母 细胞，发现均能提高早期胚胎发育能力。而Adona等77】采用Roscovitine，Dode等78】 采用6二甲氨基嘌呤却抑制了早期胚胎的发育。以上不同结果可能是因为不同的减数 分裂抑制剂作用机理的差异导致的，而且他们使用的都是化学抑制剂，对卵母细胞结 构都有不同

21、程度的破坏，不利于胚胎发育。近几年，学者们都在寻找能代替化学抑制剂的生理性减数分裂抑制剂。Zhang等【70】的研究引起了人们的注意，他们发现CNP作为活性肽可以通过CNPNPR2信号通 路，提高小鼠卵母细胞中第二信使cGMP与cAMP含量，从而抑制减数分裂的恢复， 提高卵母细胞发育能力。他们还发现CNP对裸卵中cGMP与cAMP含量没有影响， 推测CNP是通过卵丘卵母细胞间的通讯发挥作用。Kawamura等【46研究也表明CNP 提高小鼠卵母细胞中第二信使cGMP与cAMP含量，抑制减数分裂的重新启动，而且 LHhGC能下调CNP在颗粒细胞的表达，恢复减数分裂。Hiradate等79】在猪体

22、外培养 液中添加CNP处理COCs和裸卵，发现COCs中的卵母细胞减数分裂被抑制，而裸 卵则没有。Kiyosu等【80】研究报道CNP突变不影响小鼠的交配和排卵，但是卵丘细胞8万方数据广西大掌硕士学位论文 C型利钠肽对水等唧母细胞减数分裂恢复的影响及其机制司院扩展不充分，卵母细胞中碎片增多、胞质严重发黑退化，受精后发育在2细胞阶段停 滞不前。Tsuji等8l】发现，NPR2突变小鼠的卵母细胞激活EGF受体信号通路，提前启动了减数分裂。贾振伟82】对黄牛的研究表明，CNP处理COCs 6h后常规成熟培养，提高了卵母细胞质质量，促进了体外胚胎发育。以上结果表明，CNP能抑制小鼠、猪、 牛、羊的减数

23、分裂恢复，在小鼠体内是通过提高小鼠卵母细胞中cGMPcAMP浓度发 挥作用，而在其他大动物中的作用机制尚未清楚，值得进行深入探讨。3研究目的和意义影响哺乳动物成熟过程中卵母细胞减数分裂恢复的因素有很多，MPF、促性腺激 素、细胞生长因子、cAMP等。目前对减数分裂恢复研究离不开对这些因素的调控， 而CNP作为一种生理活性物质，己被众多学者研究证实具有延缓减数分裂恢复的作 用。本研究首先探讨CNP及其受体NPR2在卵泡和COCs中的表达规律，进而研究 CNP对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制，以期达到完善水牛卵母细胞成熟 培养体系，提高水牛卵母细胞成熟质量的目的，为进一步提高水牛卵母细胞体

24、外成熟 效率和胚胎生产效率奠定基础。万方数据广西大掌硕士掌位论文C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究第二部分实验部分10万方数据广西大学硕士掌位论文 C型利钠肽时水牛卵母细胞减数分裂1灰复的影响及其机制习院第一章CNP及其受体NPR2在水牛卵巢和COCs表达模式分析-_-】一刖吾利钠肽家族主要成员及受体广泛表达在哺乳动物各组织中，如大脑、心脏、 肾脏、血管等，具有利尿、排钠、调节神经内分泌、促进骨骼生长、抗纤维化、舒张 血管、抗炎等功能。利钠肽家族成员都具有一个相同的环状结构，是由二硫键联结2 个半胱氨酸残基形成的17个氨基酸，这个环状结构是利钠肽发挥作用的必需空间结 构。C

25、NP是第三个被发现的利钠肽家族成员，近年来，许多研究表明CNP及其受体 NPR2在哺乳动物的卵巢中呈现高表达，并且随着卵巢的发育表达逐渐增强，揭示它 们可能在雌性哺乳动物生殖过程中发挥了十分重要的作用。CNP是维持体内卵母细胞 减数分裂阻滞的重要物质，也有一些研究表明CNP具有促进卵泡发育的作用。目前， 有关CNP的研究主要是基于以小鼠、大鼠、猪、羊为材料展开的，鲜少有对水牛中 CNP的报道。本研究主要运用qRT-PCR、免疫组化、免疫荧光技术，分析了CNP及 其特异性受体NPR2在水牛卵巢和COCs的表达模式，为进一步研究CNP对水牛卵 母细胞发育的影响提供生物学依据。l材料与方法11试验材

26、料111水牛卵巢 水牛卵巢均来自南宁市某定点屠宰场。将卵巢放入盛有37。C生理盐水的保温瓶里，于3h之内送至实验室，先用757,醇消毒卵巢30s，再用生理盐水洗净。 112主要试剂CNP Antibody(H一115)、NPR-2 Antibody(H一80)购自Santa Cruz公司；TrizolReagent购自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex TaqTM II、DNA Marker购自TaKaRa公 司；二甲基亚砜(DMSO)、多聚甲醛(PFA)购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购 自Hyclone公司；苏木素染液购自北京索来宝公司；辣根过氧化物酶(DAB)显

27、色试 剂盒、3氨丙基3乙氧基甲硅烷(APES)购自北京中杉金桥公司；链蛋白酶亲和素万方数据广西大掌硕士掌位论文C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究标记HRP购自BIOST公司等。 113主要实验仪器普通冰箱购自海尔公司；组织自动脱水机购自湖北孝感市亚光生物公司；Leica RM2235手动轮转式切片机购自德国Leica；恒温水浴锅购自LAUDAAqualine公司；电子分析天平购自METTER TOLEDO公司；倒置显微镜购自Leica公司；实体显微镜、荧光显微镜购自日本Nikon公司；超净工作台购自苏州佳德净化科技公司；MilliQ 超纯水机购自德国Millipore公司；

28、制冰机购自SANYO公司；PCR仪、凝胶成像 系统、水平电泳仪购自BIORAD公司；恒温箱、高速冷冻离心机购自德国Thermo 公司；荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司等。114主要溶液配制方法1141免疫组织化学试剂配制(1)生理盐水：4 g KCl，180 g NaCl，2 g MgCl，4 g CaCl2，溶于三蒸水定容至20 L。 (2)PBS缓冲溶液：06 g KH2P04，432 g NaHP04，06 g KCl，24 g NaCl，溶于三 蒸水定容至3 L，调PH至7274，用O22岬过滤器除菌，4冰箱保存。(3)4PFA：12 gPFA，溶于300

29、mLPBS，60水浴助溶12 h，调PH至7274。(4)PBSTWeen20：1 mL TWeen20，溶于1 L PBS。 (5)APES溶液：2 mLAPES，溶于98 mL丙酮，现配现用。 (6)3H202：10 mL 30H202，甲醇90 mL，现配现用。(7)柠檬酸钠缓冲溶液：A液：2101 g柠檬酸，双蒸水定容至1 L。B液：2941 g柠檬酸钠，双蒸水定容至1 L。A液18 mL，B液82 mL，双蒸水定容至1 L，调PH至60左右。(8)1Triton X100溶液：141 mL 30Triton X100，364 mL PBS，37水浴助溶2 h。(9)5BSA：02 g

30、 BSA，溶于4 mL PBSTWeen20，现配现用。 (10)抗体：按实验设计浓度用PBS稀释，4冰箱保存。 (11)HRP标记的链蛋白霉亲和素：按1：200比例稀释，现配现用。 (12)DAB显色液：1 mL 1HRP缓冲液1 mL，50此20x试剂A，50 laL20x试剂B，现配现用。(13)分色液：1 mL浓HCl，100 mL 75乙醇，现配现用。12万方数据广西大学硕士掌位说吁C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究1142细胞免疫荧光试剂配制(1)T-BSAPBS(TBP)：O3 g BSA，10 vL Triton X一100，PBS定容至100 mL，调pH

31、至7274，4冰箱保存。(2)阻断液：03 g BSA，07507 g甘氨酸，PBS定容至100 mL，调pH至7274，4冰箱保存。(3)1BSA：1 g BSA，PBS定容至100 mL，调pH至7274，4冰箱保存。(4)Hoechst33342：10斗gml，即1 ug溶于100此三蒸水。115引物合成参照GenBank中己公布的原牛ANP、BNP、CNP、NPRl、NPR2、18S rRNA的mRNA序列，用premier50软件设计6对引物。引物序列信息见表11，引物均由上 海生工生物工程股份合成。表11引物序列信息Table 1-1 Primer sequences inform

32、ation万方数据广西大掌硕士掌位论文C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其机制研究12试验方法121水牛颗粒细胞收集 参考高亚可83】的方法，用生理盐水洗净卵巢，然后用带有12号针头的10 mL注射器将卵泡液抽出；将卵泡液收集到离心管，37恒温箱沉淀杂质5 min；移取上层 液体到新的离心管，500 rpm离心5 mira移取上层液体到新的离心管，1200 rpm离 心5 min；弃去上清，加1 mL PBS，吹打混匀，1200 rpm离心5 min；弃上清，加入l mL Trizol，吹打混匀，全部液体转入15 mL EP管，80保存。 122水牛卵丘细胞收集用拣卵针将从卵巢卵泡中

33、抽出的COCs拣到玻璃小皿内，将卵丘细胞吹打下来， 拣出其中卵母细胞用于裸卵培养，而将其余液体收集到15 mL EP管，1200 rpm离心 5 min；弃上清，加1 mL PBS，吹打混匀，1200 rpm离心5 min；弃上清，加入1 mL Trizol，吹打混匀，80保存。123 RNA提取及反转录 参照李润论文84】，将卵巢组织剪成黄豆大小，立即放入液氮中速冻，再放入研钵中进行液氮研磨，从研钵中取出组织粉末放入盛有1 mL Trizol的EP管，待温度渐渐 升高后盖上盖子快速混匀充分裂解。将之前收集到的颗粒细胞和卵丘细胞从80冰 箱取出，共同进行以下步骤。吹散组织和细胞，使其悬浮，冰上

34、裂解5 min，使核蛋 白复合物分离；加入氯仿200 IxL，剧烈振荡15 S，冰上放置5 min，使其自然分层， 13000 rpm 4C离心15 min；取上清到新的EP管，加入500 mL预冷的异丙醇，混匀 后冰上放置5 min，13000 rpm 4C离心10 min；弃上清，加入1 mL 75乙醇，混匀后 7500 rpm 4离心5 min；弃去乙醇，开盖晾干；加入10此左右的DEPC水溶解RNA； 用2琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解，测OD后计算RNA浓度，保存于80 冰箱。消化反应体系：RNA模板2肛g，10xDNase I buffer 1此，DNase I 1此，RNase Inhibotor O5此，加RNasefree水补至10此。反应程序：3730min，9510min。 加入1此EDTA终止消化，6510 min，4保存。逆转录反应体系：AMV buffer 4此，dNTP 2此，Random Primer 1此，AM