HIV单克隆中和抗体Y的抗病毒活性和机制研究

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1、中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。学位论文作者签名：稍孀签字日期：沙J一年，月，日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解j曼立迹塑匡堂瞳有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j立拯塑医堂瞳可以将学位论文

2、的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：奔圣爱媛导师姥1巧气勘签字日期：沙眸IJ月亿日签字日期：约，年I月目学位论文作者毕业后去向：工作单位： ：通讯地址： ：万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文HIV-1单克隆中和抗体Y498的抗病毒活性和 机制研究Research on antiviral activity and mechanism of HIV-1 monoclonal neutralizing antibodyY4983万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学

3、位论文目录图表6摘要6Abstract ， 8前言1 O1实验材料一231-1相关细胞、菌株及辅助噬菌体2312本实验相关抗体和抗原2313用于HIV一1假病毒包装的相关质粒2414一l物2515常用溶液和培养基一2616二1二要仪器设备一272实验方法2921 Y498抗体的基因序列分析2922 Fab Y498的表达及纯化一2923 ELISA检测Fab Y498交叉反应活性3024 Fab Y498的中和活性检测一3025 Y498仝分子IgG表达载体的构建3 I26 Y498(Y498 IgG)的表达及纯化3327 ELISA检测抗体Y498交叉反应活性3328表面质子共振(Surfa

4、ce Plasmon Resonance，SPR)实验：3429 Y498与去构象HIV-1 gpl20的结合反应35210竞争ELISA(Competition ELISA)3521 l Hlv一1假病毒的制备362】2基于HIVI假病毒的中和实验36213 Y498洲-J源建模和分子对接37214噬菌体表面展示肽库筛选Y498所识别的模拟且太39215预测Y498所识别的表位一42216点突变分析预测的Y498结合位点。4321 7 Capture ELISA检测Y498的识别表位442】8 Y498对筛选到的点突变进行中和反应45219 Y498所识别表位的结构展示及分析453实验结果4

5、631 Y498 q变区序列分析4632 Fab Y498抗体的Ni杜亲和纯化4733 Fab Y498反应活性的检测一4734 Fab Y498抗体中和活性的鉴定4835 Y498(Y49SlgG)(向载体构建4936 Y498的结合反应4937 Y498的表达纯化5038 Y498的交叉反应5039表面等离了共振(SPR实验)5 14万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文310 Y498IgG具有广谱的中和活性：5231l Y498识别位于gpl20上的CD4结合区域的构象表位563】2 Y498的生物信息学分析58313 Y498的表位筛选和预测6l314突变对入侵能力的影响6

6、2315突变对结合能力的影响一6231 6 Y498对突变体的中和耐受63317 Y498识别表位的结构展示654讨论 67d、结71参考文献72综述79至定谢87个人简历885万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文图表图1：Y498Fab的SDSPAGE 图2：Y498Fab与10株不同HIV一1包膜蛋白的交叉反应性 图3：Y498Fab对HIV一1假病毒NL43，SFl62的中和活性 图4：巢式PCR分别扩增Y498的重链和轻链 图5：全分子Y498载体 图6：ELISA检测Y498(Y498IgG)的结合活性 图7：IgG柱纯化的Y498抗体 图8：Y498与4种不同HIV一1

7、抗原的交叉反应性 图9：SPR检测Y498与CN54一gpl20和JRFLgpl20的亲和力 图10：Y498对H1V一1假病毒NL43，SFl62的中和活性 图11：Y498与DT丁处理的gpl20的结合反应 图12：Y498与sCD4的竞争实验 图13：Y498与b12和VRC01的竞争结果图14：同源建模 图15：用Profile3D与Procheck对Y498模型合理化评估 图16：分子对接模型(PDB：3DNN) 图17：Y498的表位预测 图18：突变对入侵能力和表达能力的影响图19：Capter ELISA检测Y498抗体与转染野生型和突变型NL43假病毒gpl60的 结合反应图

8、20：Y498与NL43的1i同突变株的中和反应 图21：Y498识别表位存HXBc2 gpl20单体上的结构展示 表1：Y498的序列特征 表2：Y498对12国际流行株的中和能力 表3：Y498对8l株H1V一1假病毒的中和能力 表4：Y498序列模板 表5：Y498与NL43的突变位点的结合反应和中和反应6万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文HIV-I单克隆中和抗体Y498的抗病毒活性和 机制研究摘要为实现预防、治疗和治愈艾滋病的目标，近二十年来基于HIV-I中和抗体的研 究成为热点。这些HIV中和抗体为通过技术手段在艾滋病感染者血液中分离、鉴定 和改造的具有广谱中和活性的抗

9、体，HIV中和抗体在疫苗设计和免疫治疗艾滋病感 染者中发挥重要作用。目前为止，中国已发现了A、B、B、C、CRF D2(CRF07 BC) CRF01 AE、CRF02 AG 7种亚型的HIV病毒，其中HIV BC、AE重组亚型毒株 已成为中国主要的流行毒株。本论文以中国流行株BC亚型病人为研究对象，在前期筛选到Y498Fab抗体 的基础上，进一步对该抗体的抗病毒活性和机制进行了研究。在前期大规模筛选人源单克隆抗体的基础上，我们首先表达纯化了Y498Fab形式的抗体，通过活性检测实验证实抗体Y498Fab具有交叉反应活性和中和活性，之 后成功构建了全分子Y498(Y498IgG)抗体，进行活性

10、检测，发现Y498对HIV-I B、 C、BC多种亚型抗原具有交叉反应活性，同样对指示毒b朱NL43矛USFl62具有中和 活性，SPR实验证实了Y498抗体与JRFL抗原有着非常强的亲和力，KD值为086nM， 均高于b12(11lnM)和VRC01(535nM)；与CN54抗原同样有着非常强的亲和力， KD值为046nM，均高于b12(1328nM)和VRC01(2529nM)。而针对被检测的八个业型8l株假病毒中，Y498能够有效中和高达26(21181)的假病毒株，在81株假病毒中，有43株中国株，Y498能够中和其中的12株，占28，而在所有被检测的BC 亚型中国株中，Y498的中和

11、能力达到32，_日Y498对部分假病毒株中和能力强于b12 年IVRC01。提示该抗体具有一定的广谱中和活性。我们进一步对Y498的抗病毒机制做了研究。实验证实了Y498抗体与b12抗 体一样，识别HIV-1包膜刺突上gpl20的构象表位，随后的竞争实验发现其识别 gpl20上的CD4结合区，并与b12和VRC01竞争结合。生物信息学分析预测Y498 抗体所识别的表位，联合筛选噬菌体随机展示文库技术发现，两者共有】5个氨基 酸位点重叠，我们以噬菌体12肽随机展示文库筛选到的6条肽段为基础，利用 Pepitope service软件对Y498所识别的表位进行预测，共得到24个可能的表位氨基 酸残

12、基，对这些位点进一步定点突变进行活性检测，发现有4个重要的氨基酸位点 影响j-Y498抗体的结合活性，分别为F277，D279，D368，E370，该4个位点均万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博士学位论文位于gpl20的CD4结合区内，随后的针对突变株中和实验发现，有2个氨基酸位点 影响了该抗体的中和能力，分别为D368，E370，并且它们同时影响了Y498抗体的 结合活性和中和活性，据此认为D368和E370为Y498抗体识别表位的关键位点。 将这些Y498抗体表位相关的氨基酸位点与VRC01和b12相比较，发现D279为 VRC01的关键位点，D368和E370为b12的关键位点，该

13、结果与Y498分别竞争VRC01和b12相吻合。少数情况下，突变导致了中和活性的提高，推测主要由于单 个氨基酸突变不足以破坏高亲和力抗体结合配体，这种情况同时印证了VRC01的 类似中和机制。结合CD4在gpl20上的结合位点分布，利用PyMOL软件将Y498抗体所识别的表位氨基酸进行展示，发现该四个位点位于CD4结合区的loop D区(F277，D279)，CD4 binding Loop区(D368，E370)。综合针对Y498的抗病毒活性和机制研究，我们得出结论：Y498抗体对HIV-1 不同亚型抗原均有较强的交叉反应活性和高的亲和力，同时对不同亚型的部分病毒 毒株具有较为广谱的中和能力

14、；Y498主要识别CD4结合区的CD4 binding loop，通 过阻断受体结合的作用机制来阻止HIV的入侵；表位鉴定发现F277，D279，D368 和E370为该抗体识别表位的关键氨基酸。Y498抗体的抗病毒活性和机制研究对了 解HIV感染的中和抗体免疫应答分子机制，艾滋病疫苗设计以及免疫治疗和预防等 具有一定的科学意义和应用价值。关键词：HIV-1，人源单克隆抗体，中和活性，表位万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博士学位论文Research 011 antiviral activity and mechanism of HIV-1monoclonal neutralizing a

15、ntibody Y498 AbstractIn order to achieve effective antibodybased vaccine and passive immunotherapy, research on HIV-1 neutralizing antibody identified from peripheral blood mononuclear lymphocyte(PBMC)of donors infected with HIV-1 appeared unprecedented prosperityin recent yearsCharacterization and

16、isolation of human monoclonal antibodies wereproviding important insights into the specificities that underlie broad neutralization of HIV二1So far,7 clades including A，B，B，C，CRF07一BCCRF08_BC，CRF01_AE， of HIV-1 have found in ChinaWe identified monoclonal antibody Fab Y498CRF02一AGisolated from phage a

17、ntibody library constructed from a Chinese popular subtype BC patient，firstly we expressed and purified antibody Fab and IgG of Y498，then confirmed that Y498 had neutralizing activity，found that Y498 had cross reactivity tO varioussubtypes of HIV-1，SPR experiments confirmed that antibody Y498IgG(Y49

18、8)had a very high affinity to JRFLgpl20，KD of Y498(086 nM)The affinity of Y498 were higher than that of b12(11 1 nM)and VRC01(535 nM)，and have a higher affinity to CN54一gpl20，KD of Y498(046 nM)higher than b12 0328 nM)and VRC01(2529 nM)And 81 strains of virus detected were effectively neutralized叩to

19、26among which capacity of neutralization towards the subtype BC reached 32，and neutralization capacity of Y498 was better than that of b1 2 and VRC01 for some pseudovirusesWe concluded that Y498 antibodies had a strong cross reactivity and asomewhat broad spectrum of neutralizing ability to differen

20、t pseudovirusIn addition，we proved Y498 antibody recognized conformational epitope of gpl 20 which mimicked that ofbl2 and VRC01 antibodyThen we predicted a total of 15 amino acids both overlapping bioinformatic and 1 2 peptide phage displayUsing pepitope service software we forecasted 24 amino acid

21、 residues related to recognization epitope，and then found that there were four important amino acid sites affecting activity of the antibodyThese 4 amino acids(F277，D279，D369 and E370)were located at CD4 binding zone of the gp 1 20Once mutated D368 and E370，neutralizing ability ofY498 completely los

22、tPyMOL software found that the four amino acids，mainly in loop DR万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文(F277，D279)，CD4 binding loop(D368，E370)As a somewhat broadspectrum antibody,Y498 reco嘶zes CD4 binding site，by blocking action of CD4 receptor to prevent HIV-1The isolation and identification of theantibody tends

23、 to understand the molecular mechanism of neutralizing antibody immuneresponse among donors infected with HIV-ITherefore may thus be a complement tocurrent monoclonal antibodybased approaches to immunotherapies，prophylaxis and vaccine designKeywords：HIV-1，human monoclonal antibody,neutralization act

24、ivity，epkope9万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博士学位论文前言人类免疫缺陷病毒(HIV)为引起艾滋病的病原体，HIV通过识别和入侵CD4 受体的靶细胞攻击人体的免疫系统，感染者大约经过数年、甚至长达10年或更长 的潜伏期后会发展成艾滋病病人。患者因机体免疫力极度下降，合并其他病原体的 机会感染，会出现多种感染，后期常常发生恶性肿瘤，并发生长期消耗，最终导致 全身功能器官衰竭而死亡。除南极洲外，HIV的流行已经蔓延到世界上的各大洲的 每一个国家和地区，平均每分钟就有一个孩子死于艾滋病，有超过1500万的儿童 因为艾滋病而失去父母。截至2013年底，有3500万人感染艾滋病，其中

25、1549岁 人群中感染率为约08。中国CDC估计，截止至2011年底，我国存活HIV携带 者及艾滋病患者约78万人，伞年新发感染者48万人，死亡28万人。HIV作为引起艾滋病的病原体，根据其核酸序列和血清学反应分为两个型： HIV-1和HIV-2。HIV-1毒株在全球流行肆虐，世界上绝大部分艾滋病患者感染的都 是HIV-I毒株：HIV-2毒株的感染者只集中在少数几个西非国家，其临床症状轻于 HIV-1感染者，与HIV-I感染者相比平均寿命较长。全球范围内绝大部分感染者所感染的HIV-1毒株属于M组，只有在非洲中部的一小部分人群中感染的是N组和O组。M组HIV-I又包含A、B、C、D、F、G、H

26、、J、K 9个亚型。此外，流行性 重组型(circulating recombinant form，CRF)病毒是HIV-1流行过程中由于不用亚 型问或业型内双(多)重感染导致病毒基因组重组而形成的亚型问或亚型内重组体。 到目前为止，我国已发现了A、B、C、B(泰国B亚型)、CRF D2(CRF07 BCCRF08 BC)、CRF01 AE、CRF02 AG 7种类型的HIV病毒，其中我国主要的流行 毒株HIV BC、肌重组型病毒在感染者中占绝对优势。人类免疫缺陷病毒大致呈球形，直径约120nm。病毒外膜是类脂包膜，为病毒 出芽时获得的宿主细胞的细胞膜，包膜上嵌有由gpl20和gp41组成的蛋

27、白gpl60 (ENV)，gpl20位于外表面，gp41是跨膜蛋白，gpl20与gp41通过非共价作用结 合。病毒包膜内是球形基质(Matrix)由蛋白p17形成，以及半锥形衣壳(Capsid) 由蛋白p24形成，在电镜下衣壳呈现高电子密度排列。衣壳内含有病毒的RNA基 因组、由两条相同的正向RNA组成，其上结合有酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶) 以及其他来自宿主细胞的成分【1】。1998年研究的IIIB去糖基化蛋白gpl20与CD4的部分区域以及抗体17b共结 晶f2】，使得ENV的结构和功能的研究取得了重大突破，随后完成了YU2 gpl20核 心结构的解析【3】。在JRFL gpl20核心与

28、CD4和FabX5结晶成功后，gpl20的结构 得以解析完成【41。10万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文Opl20和CD4以及抗体的共结晶解析发现gpl20存在一个独特的折叠，包括内 区和外区两个区域，内区包括两个螺旋和一个小的五链B层叠。外区包括一个六链 B折叠，其钳住一个螺旋、Q 2和七个反向平行Bbarrel。V1V2干与内区相邻，V4和V5区从外区表面不同区伸出。此外，由于核心区7个二硫桥保守，gpl20的核 心区由内区和外区经由桥连形成。内区(innerdomain)的序列，相比于外区(outer domain)，更为保守。游离的gpl20存在结构重排，不同于其CD4

29、结合形式。因为CD4结合诱导了 gpl20内区较大的结构变化。尽管游离的gpl20的内区结构不同于CD4结合结构， gpl20的二级结构元件仍具有参考意义。相比于结合状态，游离状态的内区不是单个区域而是不同亚结构的混合体，包括Q螺旋，B条带以及三个B片层。内区有四个保守的二硫键锁住结构元件并允许大的移动。相比于内区，gpl20的外区结构在 CD4结合后不会有大的变化。游离的gpl20和结合CD4的gpl20有两个主要的不 同，第一，CD4结合环与保守GGDPE序列基元的转位，该基元与CD4的CDR2环互作；第二，形成桥连p带的p20p2l环的再定位。此外，在游离gpl20中未形 成受体和辅助受

30、体的结合位点，与结合状态的gpl20不同。Gp41与gpl20复合物结构的天然状态有待进一步研究，然而，gp41的许多结 构片段得以阐明。自身装配的HIV-I和SIV六聚体重复的晶体结构57揭示了六个 卷曲螺旋束，该卷曲螺旋特征在血凝素业单位HA2上非常明显8，91，TM亚单位在 MoMLV病毒中明显f101。七肽重复区HRI和HR2大约有4060个氨基酸残基，每 个有疏水重复序列，定位在融合区和转膜区。基于这些七肽重复序列使得gp41形 成的热稳定核心。Op4l的核心，N36一C34形成的复合物，为一个六个螺旋形成的 束形结构。Gp41结构对膜融合机理提供了有用的信息，突变gp41影响HIV

31、的感染 性和膜融合。为了治疗艾滋病，世界各国不惜代价投入大量的人力财力，先后研制了十几种 疫苗和近百种药物，但迄今尚未发现一种特效药能够治愈艾滋病。作为治疗艾滋病 的新武器，华裔科学家何大一教授提出的“鸡尾酒”疗法能够有效地抑制HIV病毒的 扩散，一经公布就立即轰动了整个医学界。“鸡尾酒”治疗发挥了很大的作用，至少 可以使患者发病时问延后数年，但是严重的副作用也让患者心生敬畏，不过服用后 还是能够延长患者的寿命，近年美国艾滋病死亡逐年下降就是证明。但是他们很快 发现，“鸡尾洒”疗效并不能治愈艾滋病，该疗法虽然能够消灭人体内的大部分艾滋 病病毒，但是，仍有很少的病毒隐藏在淋巴结内，病人必须长期服

32、药，但如果停止 服药，即使还剩下0001的病毒，病毒也会卷土重来，大量扩增反弹，引起艾滋病。最近几年HIV-I中和抗体的研究呈现蓬勃发展之势，HIV中和抗体不仅可以作 为疫苗的模板，而且在被动免疫治疗HIV-1感染者中发挥极其重要的作用。Balazs万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文等研究了载体介导的中和抗体有效地保护了人源化小鼠的HIV感染，所用载体为经 特殊优化的携带全分子中和抗体的腺相关病毒(AAV)，该过程简称载体介导的免 疫预防(VIP)。经静脉注射后，在体内表达了高浓度的中和抗体，该中和抗体对感染有HIV的人源化小鼠有很好的保护作用。Matthew等利用AAV载体能够

33、稳定表达HIV-1广谱中和抗体eCD4一Ig，eCD4一Ig为CD4Ig和小CCR5模拟二硫肽的融合 物，其结合在HIV-I的包膜糖蛋白上，具有极强的中和能力，能够中和100的各 个亚型病毒，包括耐药性的HIV-1，HIV-2，SIV毒株，以及对CD4结合位点抗体 如VRC01、NIH45-46和3BNCl 17耐药的毒株。给猴注射AAV载体能够稳定表达 177799mL功能性eCD4一Ig达40周之久，这些受试猴子可抵抗SHIV-AD8的感染【11】。另外，在基于联合多个有效的中和抗体治疗AIDS方面，取得了卓越成就。 美国的Barouch和Shingai两个课题组分别在Nature上发表各

34、自的研究成果，联合 多个中和抗体有效地降低了慢性感染猴的SHIV病毒水平，给病人采用广谱性中和 抗体治疗人类免疫缺陷疾病带来了希望【24】。单个抗体或抗体组合能够有效地抑制HIV的感染，一些抗体在感染的动物模型以及临床一期中担负起被动保护的作用。单个或多个中和抗体的联合治疗，不仪像 常规的鸡尾酒疗法一样能够阻止病毒扩散，而且抗体借助其内在的本质效应功能， 不仅清除感染细胞产生的病毒粒子，而且通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用、补体裂解或者吞噬作用来破坏感染细胞。同时引起前病毒DNA水下下降以及SHIV 特异的CD8+T细胞的功能提高。并且治疗停止后，病毒载量维持在一个稳定水平， 甚至低于治疗

35、前的水平，免疫系统和病毒复制达到一种平衡，应用中和抗体治疗艾 滋病增强了机体的抗病毒免疫功能【1216】。治疗用的单克隆抗体有着高度有效、良好的耐受性以及借助于宿主免疫系统发 挥有效功能的特性。2015年Marina Caskey等研究发现被动输入单个抗体3BNCll7 在控制艾滋病患者的病毒血症中发挥有意义的效应。在一期临床试验中，单一输入30mgkg的3BNCll7减少了0825log的病毒载量，并有效控制病毒血症达28天。 他们认为单一抗体的治疗是安全而有效的，联合抗病毒药物能够避免耐药性，中和 抗体半衰期长，具有潜在的杀细胞能力，通过Fc受体增强宿主免疫；进一步人为 改造设计可使抗体活

36、性提高loo倍；抗体和抗病毒药物的联合使用能够活化潜伏病 毒，干扰病毒储存库，可以作为HIV预防、治疗和治愈的新的治疗方法【17】。中和抗体针对的抗原表位主要为HIV-1表面的刺突(ENV)，由gpl20和gp41 组成。机体针对HIV病毒的早期中和抗体反应大约产生于感染后3个月，为毒株特 异性的。机体对该病毒的抗体反应驱使病毒逃离，因此病毒突变，在表位附近或表 位内产生快而广的ENV进化，进而对自体血浆产生耐药性，表位区的进化早于中 和抗体的广谱性获得。这种抗体与病毒问的竞赛导致80病人体内的中和抗体少或万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博上学位论文特异性局限，然而，20病人的病毒进化突

37、变体诱导了广谱性中和抗体。18-22能 够中和80HIV分离株的中和抗体识别广谱敏感表位区，有四个这样的位点得以鉴 定，均位于HIV的包膜刺突上，其中三个在gpl20上，一个在gp41上23】。一分离和鉴定中和抗体的技术方法 1994年Barbas报道的b12为最早分离到的中和抗体之一，将美国感染B亚型并且长期无症状个体，抽取5mL骨髓构建噬菌体展示肽库，利用IIIB毒株的gpl20 作为抗原筛选得到，中和广谱性在30-一5024，251。同年Katinger等分离到2F5， 4E10，2G12等中和抗体，利用电融合和EBV转化将HIV阳性者血液中外周血淋巴 细胞通过电转化或EBV转化，将含有

38、IgG阳性克隆通过ELISA以gpl60和gp4l 或P24为抗原筛选得到【26】。2009年，PG9和PGl6从1800个HIV感染者rfl，主要为非B亚型，利用高通 量筛选A亚型感染者大约30000个活化的记忆性B细胞分离到的两个强的抗体27】。2010年Wu等利用重设糖蛋白表面，构象稳定的探针(RSC3)，通过计算机设计，保留了b12的中和表位并修改了b12表位以外的抗原表面，包括消除CD4和F105 结合突变以及剪去V12来消除辅助受体表位，利用HXB2核心来优化表达和折叠 分离到VRC01【28】。从HIV感染的B亚型感染1 5年进展缓慢的个体分选记忆性B 细胞，之后克隆表达抗体基因

39、鉴定。同年Lanzavecchia等从非B亚型病人中，采用EBV固定方法，以A亚型和BC亚型的gpl40，BC业型和B亚型的gpl20，B亚 型的gp41为抗原筛选到HJl6129。2011年8ANCl95同时识别gp41和gpl20上与 CD4结合位点相邻的N糖基化，利用CD4结合构象2CC核心做诱饵，单细胞分选记忆细胞，富集的B细胞利用生物素化的gpl40在流式仪上分选抗原特异的阳性B 细胞30】。同年Nussenzweig等利用流式分选单个记忆性B细胞，CDl9+B细胞利 用抗人的CDl9磁珠从PBMC中富集，随后利用抗人的CD20和抗人的IgG抗体，以及2CC或YU2筛选，之后合成cD

40、NA并扩增Ig筛选到3BNCll7131】。201 2年Bjorkmand等利用YU2 i聚体而非RSC3做钓饵从分离出VRC01的 AIDS患者中分离到一个比VRC01更强的突变体NIH4546。同年Connor从N152 外周血记忆性B细胞分选并添加IL2，IL21和CD40配体，约16500个B细胞培 养物上清得以筛选，具有中和活性的IgG的基因克隆且再表达分离到两个抗体10E8 和7H6，10E8中和广谱性在981321。2013年Haynes等从非洲病人CH505中分离 到CD4结合位点的广谱中和抗体CHl03，通过流式分选结合RSC3包膜蛋白的记 忆性B细胞，该抗体能够中和55病毒

41、331。2014年，利用单个细胞分选记忆性B 细胞利用IL一2和lL一2l以及辐射3T3一msCD40L细胞，接种到384孔微板以每孔4 个细胞培养，13天后用MN和Bal高通量微中和反应，阳性孑L免疫球蛋白基因的重 链和轻链町变区RT-PCR扩增并表达35022广谱性中和抗体34】。2015年报道13万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博士学位论文eCD4Ig，为CD4Ig与小的CCR5模拟肽的融合，为目前最强的中和抗体，中和能 力100，还能够中和VRC01，NIH4546和3BNCll7耐药的毒株【ll】。二HIV-1广谱性中和抗体的分类HIV一1感染带有CD4分子的靶细胞，攻击人体的

42、免疫系统，早先研究弥漫着的 体液免疫反应的负面观点主宰了HIV1研究的前20年，随着研究的逐步深入，人们 陆续发现了多个广谱性中和抗体。在1994年有几个较为理想的中和抗体(b12，2F5， 4E10和2G12)，这些中和抗体的发现以及某些HIV患者的血清具有广谱中和活性的 研究，推动了研究者从中和抗体的角度为出发点治疗和预防艾滋病的理念3538】。2004年前后，研究者陆续开始报道HIV患者的血清能够中和各种分离株，研究者发现交叉反应中和抗体一般产生于患者感染后24年，同时建立了许多技术，包括 亲和纯化血清抗体、基于特异性突变假病毒的中和检测，这些方法证实了广谱反应 性中和抗体识别ENv上的

43、特定的区域，包括gpl20上的CD4结合区，糖基化可变区 以及gp41上的近膜外区(MPER)【39-42】。2009年发现的PG9和PGl9能够中和70一80检测的病毒43】；2011年晶体 结构的VRC01的病毒中和率为9044，45；2012年晶体结构的10E8中和98检 测的病毒【46】最近发现的35022抗体能够同时识别gpl20和gp41，其中和能力为 62(共检测了181株)【47。这些广谱性中和抗体的鉴定给研究者从体液免疫角 度研究治疗和预防艾滋病提供了重要的信息。人们把广谱性中和抗体分成了四类，依据为广谱性中和抗体所识别的表位区在 gpl60上的分布，分别为gpl20的CD4

44、结合区，gpl20的V1V2区，gpl20保守的 糖基化V3区，gp41的MPER区【4850】。爹辫伽2 t 15一_疆 娜蛐胍吼姗眦垂；叭小滋2嚣趁蓠爹147：三1B)洲郴肌h佴1 肌州脚眦毗2G12，PGTl21-J37，10107410E8，35022P很多广谱性中和抗体识别gpl20的CD4结合位点区，这些广谱性中和抗体有14万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博士学位论文NIH4546、VRC01、12A12、3BNCll7等，能够中和8090的病毒51-531。尽管 抗体对表位识别的精确性有待进一步研究，CD4结合位点功能上保守。2010年研究 者晶体结构解析了VRC01的Fa

45、b与ME亚型93TH057的gpl20复合物，发现VRC01 模仿CD4与gpl20相互作用。VRC01主要通过V区与gpl20接触，最初的互作主 要是V区的CDR H2，其后CDR L1和L3，CDR H1和H3进一步与gpl20作用， 此外，模拟受体和广泛的亲和力成熟驱使其有效地中和病毒11。2011年发现 NIH4546识别gpl20的外区，包括CD4 binding loop，loop D以及loop V5，而该抗 体的CDR3区域gpl20的内部区域互作。在VRC0193TH057结构中重要的相互作 用在NIH454693TH057同样保守。NIH4546与VRC01最显著的不同点是

46、在前者 的CDRH3区插入了四个氨基酸残基(99a99d)，其中三个氨基酸的插入有利于与gpl20的结合，若敲除该插入会引起中和能力下降10倍。其Tyr99d俱1链氢键与loopD 的Ala281羰基氧作用，阻止了病毒通过突变逃逸。Tyr99d的重要性通过丙氨酸替 代体现，该突变降低了中和强度。Asp99c与gpl20上的Lys97通过静电相互作用， Ar999b氢键与gpl20上的Ash99互作，该插入的构象通过两个分子内氢键稳固。 3BNCll7相比于VRC01，后者对17181个病毒更敏感，但前者表现更广谱的中和 活性，而3BNCll7相比于N珊45-46活性更强，3BNCll7能中和9

47、6假病毒。与VRC01一样，3BNCll7通过R71与gpl20的CD4 binding loop的D368互作，通过 Y91与gpl20上的loop D的T278相互作用，E91与gpl20上的loop D的N280相 互作用；2G12结合到变性的gpl60，但与去糖基化的变性gpl20不反应18】。第二个广谱性中和抗体的敏感结合区为gpl20上的V1V2区。这样的抗体有PG9， PGl6，PGTl45，CAP256一VRC262154和CAP256VRC262555，以及广谱性稍逊的CH0104和PGTl41144156】。这些抗体主要识别gpl20 V1V2区的N160，其与病毒的免疫逃

48、避有关57】。PG9和PGl6为从1800个H1V-1感染个体中，主要为非 B亚型，筛选出的单克隆抗体，随后利用高通量中和筛选含抗体的培养上清，从A 亚型非洲感染者中大约30000个活化的记忆性B细胞中分离的两个强的中和抗体， 表位鉴定发现PG6和PG9定位在gpl20上V2和V3的保守区。PG9和PGl6尤其 中和非B亚型毒株，对世界上流行的多数HIV-1流行株具有保护作用。gpl20上保守的糖基化v3区形成了刺突上第三个敏感区。有效的中和抗体有 PGTl21，PGTl28、101074，还有活性稍弱的2G12，PGTl22123，PGTl25127，PGTl29131和PGTl35137。

49、【58，591突变分析以及重链和轻链互补发现该类抗体 有多种识别模式，一些识别蛋白以及糖基化位点如N301和N332，一些只识别糖 基。与vlV2区一样，N332糖基化与免疫逃避相关6062】。2G12表位位于gpl20的C3V4区，并且为该部分的糖基化位点。334SN和392NE1397NE的突变，降低了2G12的结合能力，其他的突变386NQ和450NT万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博士学位论文损害了2G12的结合，但并未破坏结合能力，对2G12的中和敏感性有一定的影响。【63，64】PGTl21为糖依赖的中和抗体，从A亚型感染的个体中筛选到的，利用gpl40 钓取单个分选的细胞分

50、离到29个新的克隆突变体。PGTl21克隆家族包括PGTl21和101074群。PGTl21和101074的表位均识别gpl20上Asn332的PNGS以及 V3100p。PGTl21的可变区结合到N糖基化区，对于101074，gpl20上的Asn332 糖基化位点影响其中和能力，其与PGTl21有着不同的糖结合位点。前者含有高的U露糖糖基化，后者显示相反的倾向。101074与PGTl21序列的不同表明两者结 合表位的相异。65，661还有gp41的MPER区，2F5、4E10和10E8为gp41的MPER区的最广谱的中 和抗体。2F5结合gp41上外区的线性表位，同样结合到天然的、变性的以及

51、去糖基 化的gpl60167。10E8有着长的CDR3区，高的体细胞突变，无或低的自身反应性， 能中和98假病毒株(共18l株)。10E8抗体与gp41 MPER的互作主要通过重链， 尽管轻链CDR L3也参与介导。抗体与gp41有三个主要的互作位点，一个在CDR H3 环的末端和肽的C端螺旋末端：一个在CDR H2环的残基和肽的铰链区，第三个， 在三个重链CDR和轻链CDR L3之间，形成一个疏水裂隙紧紧抓住MPER C末端 螺旋的起始。而MPER形成0【螺旋，一端在残基671以Asn，Thr或Ser结尾，另，末端为跨膜外区。病毒在入侵时，MPER预融合或形成构象中间体，经历有意义 的构象改

52、变，与病毒的包膜互作，介导膜融合121。最近报道了一个新的HIV广谱性中和抗体35022，其刁i与单体形式的ENV结合，但是能够结合三聚体形式的ENV，突变JRCSF的ENVN端的N88A，N230A， N241A和N625A，35022中和能力降低，该结果表明35022同时识别gpl20和gp4l。 通过电镜负染抗体Fab与三聚体复合物也揭示其结合到一保守表位，延伸跨gpl20和gp4l。35022的特异性代表了HIV ENV的新敏感位点，其中和62(181株) 的假病毒，IC50501agmL。该新位点丰富了当前基于抗体的免疫治疗、预防和疫 苗设计的方法和理念【131。目前发现的广谱性中和

53、抗体1994b1230502010HJl63040CD4 binding2010VRC0196site of gp l 20VRC02，NIH45-4616万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文20113BNCll7963BNC60，3BNC62201112A12922015eCD4一Igloo2012PG04882013CHl035520131F72017万方数据中国医学科学院北京协和医学院博士学位论文三广谱性中和抗体的特征几乎所有的抗HIV-1 BnAbs都具有两个以上的独特特征68，69】，HIV-1在感染 过程中机体产生了大量的成熟抗体，但针对CD4bs的中和抗体显得更为成熟

54、，其核苷酸的体突变频率高达30以上70，高频突变本质上是从gpl20弱识别的未突变 的始祖种系进化到gpl20强识别高亲和力成熟的中和抗体的过程，它们的VH大部 分是起源VHl2的等位基因。VRC01中和广谱性在96，其CDRH3长度为14个 氨基酸，体细胞突变率为32， 靶点为V1V2的广谱性中和抗体(BnAbs)则通 常为长CDRH3(2432AA)，为穿透“多糖外壳”到达VIV2所必需，体细胞突变程 度较低，具有不同的轻重链原始基因，说明此类抗体一旦其形成长CDR H3后，位点识别就能和许多成对的轻重链适应配合【71，72。如PG9的CDRH3长度为28个 氨基酸，体细胞突变率低于10。

55、靶点为V3区的BnAbs则具有相对较长的CDR H3 长度(1826 AA)，体突变频率中度到高度，表现为插入型或缺失型突变，和靶点 为V1V2高频突变抗体相比，其突变似乎是为了更好适应抗体和多糖的紧密结合731， 如PGTl21的CDRH3长度为26个氨基酸，其重链突变率为19。靶点为gp41的 MPER的BnAbs则具有相对适中长度的CDR H3(1722 AA)，体细胞突变频率也 呈现中度到高度特点，这既适合其增强的CDR H3识别功能，也是它们能通过疏水性氨基酸和病毒包膜亲和的一个重要原因174，751。10E8为识别MPER区lgG3类中 和抗体，CDRH3区有22个氨基酸，其中和能

56、力存98100，其中重链的体细 胞突变率高达21，轻链的体细胞突变率为14，为一个长CDR区和高体细胞突 变率的中和抗体。CD4iAb表现为VH基因的高选择性和酪氨酸的硫酸化，不同长 度CDR H3的抗体又呈现不同特征，较短CDR H3(1014AA)抗体的CDR H3呈 电中性，CDR H2残基上携带较多极性的酸性氨基酸；较长CDR H3(1725 AA) 抗体CDR H2上残基则更偏中性，CDR H3则有更多带静电的酸性残基【12，且还 有4i少硫酸化的酪氨酸，通常酪氨酸和负电荷伴随识别所必须的翻译后修饰，表明 它们与膜的结合程度很高35361。既能识别gpl20又能识别gp4l的中和抗体

57、莫过 于最近报道的一个新的HIV广谱性中和抗体35022，中和能力在60以上，其 CDRH3由14个氨基酸组成，月一在FR3区有8个氨基酸的插入，重链的体细胞突变 率高达35，轻链的体细胞突变率为24。因此长的CDR3区以及高的体细胞突 变是广谱性中和抗体的两个重要特征。四广谱性中和抗体与HIV病毒的共进化 理解HIV感染的自然过程和适应性免疫的出现给预防性疫苗的设计提供了有用的线索。HIV-1包膜刺突驱使病毒进入宿主细胞，感染者早期产生的中和抗体和适 应性免疫被病毒的逃逸所击败，该时期的病毒不断突变并经历感染和逃离中和抗体 的作用【76。经过多年的持续性慢性感染，一些感染者的记忆性B细胞表达

58、ENV特18万方数据中国医学科学院北京协和医学院 博士学位论文异的抗体，能够中和自身HIV病毒的变异株。重要的是，这些抗体对其他感染者亚 型病毒也显示了强的广谱的交叉反应性1771。ENV特异的中和抗体的存在表明适应 性免疫反应能够击败逃离的病毒。纵向研究单个感染个体描绘了中和抗体和病毒突 变逃逸的动力学共进化78】。这些研究揭示了成熟的CHl03 B细胞系表达中和抗体识别CD4结合位点的loop D区，病毒逃逸和中和抗体的进化在追踪CH505感染者中得以阐明。Gao等更深入地探究了病毒和记忆性B细胞的进化机制【79】。感染者 早期的外周血中记忆性B细胞的体外再生揭示了ENV特异的B细胞属于CHl03家 系。广泛地筛选124个不同的假病毒突变体揭示了CHl03家系的接触位点为CD4结合位点的loop D区，该关键的发现说明CHl03不能选择表达loop D突变体的中 和抗体。基于前期发现，Gao等从大量的记忆性B细胞培养物中筛选能够中和出现的病 毒的抗体，150个克隆家系中有一个拥有此种特性。虽然表达广谱性中和抗体的感 染者不能消除感染，这些强的抗体在感染人源化小鼠模型和恒河猴被动免疫中是有 效的，人源化鼠和恒河猴中显示r卜和抗体联合能够阻止疾病并抑制进行性感染。不 幸