e医药卫生科研项目可行性报告

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1、TiO2纳米管载pH响应型胶束药物控释体系的研究（ 面上项目 ）1、立项的背景和意义牙列缺损及牙列缺失是口腔患者的常见病、多发病，不仅直接降低患者的咀嚼 效率，同时对患者的颜面部外形、全口牙齿咬合的稳定性、全身营养的均衡都有一 定的影响。 随着生活质量水平的不断提高 , 人们对牙齿修复体的要求已经不仅仅是满 足于简单的咀嚼功能的恢复，更要求在修复过程中不损伤天然牙，修复体更舒适， 修复牙齿更逼真等。因此，以钛材为基础的骨内种植技术应运而生，成为牙列缺损、 牙列缺失和颌面部缺损最有效的修复手段之一，种植义齿以其不损伤临牙，美观， 咀嚼功能强等不可替代的优点已经作为牙列缺损及缺失重要的修复方式被广

2、泛应用 于口腔临床治疗。随着优质钛合金的出现及钛合金表面改性技术的发展，钛合金以其优异的综合 性能（良好的生物相容性、机械强度、钝化能力、抗腐蚀性、与骨组织相近的低弹 性模量等）成为牙种植体、颌面赝复体固定桩、骨内植入式假肢以及各种矫形材料 等人体硬组织替代物和修复物的首选材料。据统计，每年我国植入牙种植体数百万 颗，人工关节、脊柱装置、冠脉支架数十万件，骨折内固定器械数百万套。然而， 由此引起的植入物相关性感染问题也逐渐凸显出来，成为临床上一个非常棘手的问 题 1 。牙种植体由植体、穿龈部分及上部结构三部分组成，植体材料基本为商业纯 钛或 TC4 钛合金，钛植体经应力分析对材料形态和结构优化

3、设计，表面采用不同技 术处理以增大比表面积及使其在体内容易形成类骨磷灰石（BLA）层，已实现材料与骨的化学性键合，其抗剪切力达 50Mpa以上，完全可满足负重、承载修复体的应用要求；上部结构的修复可根据不同口腔情况的要求，基本实现形态和功能并举的目 标。但在实际应用中，牙种植体仍有较高失败率，其基本表现为牙龈附着下移或牙 周袋形成，牙槽骨吸收，最终种植体松动、脱落。大量报道对种植体失败的原因进 行了分析，除应力过载或屏蔽致骨吸收外，种植体周围炎的发生和发展是其最终失 败的重要表现和主要原因。因此，寻找有效的方法消除种植体相关感染具有非常重 要的临床意义，对钛合金种植体进行表面改性研究十分必要。

4、种植体表面易感染的主要有两方面原因：一、表面生物膜的形成；二、种植体 / 组织界面免疫能力低下。钛种植体在生理环境下其表面会吸附一层蛋白层，使钛表 面适合于细菌聚集和生物膜形成 2-3 。生物膜是指附着在物质表面的微生物实体， 是细菌在复杂多变的环境中，产生外部多糖包膜多聚体，使细菌相互粘连形成膜状 物，它可以通过多种机制保护其内部的细菌不受攻击 3 。此外，在种植体植入后的 早期，种植体 / 组织界面血管分布量较少，防御能力较低，有利于细菌入侵从而发生 感染。种植体手术的病人临床上常规会给予全身抗生素预防性治疗以阻止感染的发 生 4,5 。然而，全身抗生素给药具有许多缺点，如靶点药物浓度低和

5、全身毒副作用 等。因此，从这些角度考虑局部抗生素给药更有优势。目前已有多种方法实现植入 体表面局部缓释给药， 如在种植体表面制备各种涂层 6-7 ，采用共价结合的方法将 药物固定在钛表面等方法 8 ；但是这些缓释方法存在药物载量少， 且涂层易剥脱等 缺点。近年来一种新的局部药物缓释设计理念是在钛种植体表面用阳极氧化法形成TiO2 （二氧化钛）纳米级小管作为局部“药物纳米储存缓释器”，为种植体局部药 物缓释提供了新思路 9 。药物在 TiO2 纳米管中的释放主要受管孔结构支配（直径 和长度比），纳米管长径比对于药物释放率起着决定性作用，可以有效延迟或加速药物释放 10。目前延长药物释放的方法主要

6、是减小TiO2 纳米管径，通过降低药物释放率来延长释放持续时间，但是此法存在降低药物装载总量、纳米管直径调控范 围有限（20-300nm）, “突释”现象明显以及很难满足长时间（数周）药物连续释 放的临床需求等缺点：11： o因此，如何增加可控孔径范围内TiO2纳米管的药物装载总 量,达到药物缓释的可控性,实现植入体表面缓释给药从而达到有效控制种植体周 围炎十分重要。近年来，生物可降解聚合物胶束作为纳米药物载体备受瞩目12-14。它能包裹疏水性药物，提高药物在水中的溶解度，延长药物在体液中的循环时间另外，聚合 物胶束的尺寸一般为10200nm处于TiO2纳米管直径调控范围之内（20-300nm

7、）, 装载入TiO2纳米管内可以避免聚合物胶束过早地被肾脏清除和机体免疫系统吞噬，局部用药可降低全身药物副作用和改善药物利用率15.值得注意的是，单纯TiO2纳米管装载聚合物胶束无法控制药物的释放量为靶向位点提供有效的药物浓度。刺激 响应性胶束可根据内部刺激（如 pH、氧化还原电位、溶酶体酶）或外部刺激（如温 度、磁场、光）快速响应，如溶解、溶胀或坍塌，从而达到在合适时间释放药物的 目的，提高治疗疗效。在这些刺激中，pH响应性是使用最广泛的，在正常人体组织，ph值在7.4，某些病理状态（如炎症）下，病灶组织局部由于缺氧导致无氧代谢而被酸 化，pH直降低，在种植体穿龈或穿皮部位，由与细菌大量产酸

8、，在菌斑内ph值甚至低至5.5。因此，低pH直被视为炎症反应的重要标志之一。因此，我们可以利用正常 组织和炎症组织的ph值差异，设计一种能对环境中 pH值做出响应的TiO2纳米管加载聚合物胶束的药物缓释系统。综上所述，充分利用TiO2纳米管结构的可控性、聚合物胶束良好的稳定性、药 物包封率及腙键的pH响应性能等优势，结合两者的优势对钛基体表面进行改性研究， 从而达到钛种植体表面pH智能响应型药物缓释的目的，降低药物全身副作用，改善 药物利用率。本项目在前期已成功采用阳极氧化法在纯钛基体表面制备TiO2纳米管阵列，针对不同电压、 电解质浓度、 阳极氧化时间等因素对制备不同管径、长度 TiO2纳米

9、管阵列的影响做了初步的实验和探讨，确定参数后制备结构稳定的 TiO2纳米管，采用简易真空冻干法成功在TiO2纳米管内直接加载阿莫西林，通过 SEM XRD EDS 观测等手段对TiO2纳米管进行表面观测及结构表征，同时在缓冲溶液中模拟体外药 物释放，证实了钛表面TiO2纳米管结构直接装载药物呈现出药物“突释”现象，本 项目拟在前期研究基础上，采用聚合物胶束良好的药物包封率和 pH智能响应的优势， 改善TiO2纳米管载药“突释”现象，从而建立一种新型种植体周抗炎药物缓释体系 并实现释放速率的调控，模拟正常生理过程中出现种植体周围炎时药物的响应性释 放，最大限度的降低种植体周围炎对种植体初期愈合产

10、生的不良影响，促进种植体 早期愈合、提植成功率。2、国内外现状和发展趋势阳极氧化是指金属或合金的电化学氧化。 在相应的电解液和特定的工艺条件下， 由于外加电流的作用下，将金属或合金的制件作为阳极，采用电解的方法使其表面 形成氧化物薄膜。虽然阳极氧化的历史已经超过 50 年，但直到 1995年，人们发现 通过优化阳极氧化条件可以形成高度有序孔阵列的氧化膜。 1999年， Zwilling 16 等 第一次报道了在含氟离子溶液中，钛表面经过电化学阳极氧化得到TiO2 纳米管阵 列。 TiO2 纳米管制备设备要求较低，并可通过调整制备电压、电解质浓度、阳极氧 化时间、 pH 值等参数获得一定管径和管

11、长的 TiO2 纳米管阵列，具有很好的生物相 容性。目前 TiO2 纳米管阵列已广泛用于种植体表面处理方面的研究。近年来，在钛种植体表面用阳极氧化法形成TiO2纳米级小管作为局部“药物纳米储存缓释器”为种植体局部药物缓释提供了新思路。TiO2纳米管的制备是钛金属基片通过在电解质溶液中阳极腐蚀而获得纳米级小管，这种方法可以制得排列整齐 的纳米管阵列，且纳米管与基体金属直接相连，结合非常牢固。TiO2纳米管具有良好的生物相容性，且其纳米管状结构有利于药物装载和缓释，已经使用TiO2纳米管实现药物缓释 17 。药物在 TiO2 纳米管中的释放动力学主要受孔结构支配 （直径和长 度比），纳米管长径比对

12、于药物释放率起着决定性作用，可以有效延迟或加速药物 释放 17。目前延长药物释放的方法主要是减小 TiO2 纳米管径，通过降低药物释放 率来延长释放持续时间，此法存在降低药物装载总量、“突释”现象明显以及很难 以满足长时间（数周）药物缓释的临床需求等缺点18。一些学者用各种方法对钛纳米管药物缓释进行调控。如采用PLG/和壳聚糖对钛纳米管管口进行封闭药物可以以零级速率缓释达6-8 周。还有一些学者采用电化学沉积法将羟基磷灰石沉积于钛纳米管管口，大大延缓了药物的释放速率。目前这些调 控缓释的方法仅仅是针对早期的药物突释进行调控，这些缓释系统不能对组织的微 环境做出反应，不管种植体周围组织是否存在感

13、染，抗菌药物都按既定的方式进行 释放。在正常生理状态下，人体组织环境处于 pH=7.4，某些病理状态（如炎症）下，病 灶组织局部由于缺氧导致无氧代谢而被酸化，pH直降低，在种植体穿龈部位，由于细菌大量产酸，在菌斑内pH直甚至低至5.5。因此，可以将低pH直作为炎症状态的一种典型特点，充分利用炎症状态与正常生理组织环境下pH的差异，设计一种对pH响应敏感的种植体表面改性体系。近年来，生物可降解胶束作为纳米药物载体备受瞩目。聚合物胶束是一类由两 亲性共聚物在水溶液中通过自组装形成的纳米粒子，亲脂性的药物分子能通过物理 包裹进入胶束的疏水内核，而亲水的壳层用来稳定胶束，聚合物胶束具有良好的生 物相容

14、性和生物可降解性。聚乙二醇（ PEG和聚（ -己内酯）（PCL是具有生物 可降解性和良好生物相容性的材料，并已获得FDA比准.由PEG-PC嵌段共聚物自组装形成的胶束作为纳米药物载体尤为常见但其存在降解缓慢和无刺激响应性等缺 陷，从而阻碍了药物在靶向部位高效累积，降低了药物的有效利用率。目前，已有大量基于酸敏感键（原酸酯、腙和缩醛等）的pH响应性胶束的研 究。其中，特别是腙键，它在中性条件下稳定，酸性环境中容易水解，并被广泛用 于连接聚合物主链和各种活性治疗药物.在已有的文献报道中，腙键常被用到pH敏感聚合物胶束中，且能在酸催化下快速水解，其结构合成简单，对酸灵敏度高，最 常被用来作为pH敏感

15、药物载体的酸可裂解官能团。Wan等19报道了叶酸和细胞穿透肽R7修饰的含腙键PLGA-mPE胶束，负载硫酸长春碱以后，在 pH=7.4条件下8 h内释 放了 35.8%.而在pH=5.0条件下8h内释放了 65.6%.说明载药胶束释放呈pH依赖性。因 此,充分利用官能团腙键敏感的pH响应特点，结合PEG-PC嵌段共聚物良好的生物相 容性和生物可降解性，将其共聚物载药后装载入钛表面TiO2纳米管内，从而可获得一种具有pH智能响应的药物缓释体系。参考文献1 Campoccia D, Montanaro L, Arciola CR. The significance of infection rel

16、ated to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials 2006, 27(11): 2331-2339.?2 Evan M. Hetrick, Mark H. Schoenfisch. Reducing Implant-Related Infections: Active Release Strategies. Chem Soc Rev 2006,37(48)780-789.3 Dunne WMJr. Bacterialadhesion: seen any good biofilms lately

17、 ChinMicrobiol Rev 2002,15(2):155-166.4 Jahoda D, Nyc O, Pokorny D, et al. Antibiotic treatment for preventionof infectious complications in joint replacement. Acta Chir Orthop Traumatol Cech 2006,73(2):108-114.5 Williams DN, Gustilo RB, Beverly R, et al. Bone and serum concentrations of five cephal

18、osporin drugs. Relevance to prophylaxis and treatment in orthopedic surgery. Clin Orthop relate Res 1983,179:253-265.6 Neut D, Dijkstra RJB, ThompsonJI, et al. A gentamicin-releasing coating for cementless hip prostheses Longitudinal evaluation of efficacy using in vitro bio-optical imaging and its

19、wide-spectrum antibacterial efficacy. JBiomed Mater Res A, 2012, 100 (12): 3220-3226.7 Pichavant L, Amador G, Jacqueline C, et al. pH-controlled delivery of gentamicin sulfate from orthopedic devices preventing nosocomial infections.J Control Release, 2012, 162(2): 373-381.8 Keton is C, Barr S, Shap

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21、gin eered tita nia nano tube arrays. Therapeutic Delivery (2012) 3(7), 857- 873.10 梁砚琴.TiO2纳米管的制备及改性研究D.天津大学,2012.11 Vallet- Regi M. Ordered mesoporous materials in the con text of drugdelivery systems and bone tissue engin eeri ngJ. Chemistry. 2006 Aug 7;12(23):5934-43.12 Basalious EB, Shamma RN. N

22、ovel self-assembled nano-tubular mixedmicelles of Pluro nics P123, Plur onic F127 and phosphatidylcholi ne for oraldelivery ofnimodipine:In vitro characterization, ex vivo transportand invivo pharmacoki netic studies. I nt J Pharm. 2015 Sep 30;493(1-2):347-56.13 MLi ，丫 Liu , L Feng , F Liu , L Zhang

23、 et al. Polymeric complex micelles with double drug-load ing strategies for folate-mediated paclitaxeldeliveryJ. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2015,131 :191-201.14 S Aleja ndro, MR Maya. Polymeric micelles in mucosal drug delivery:Challe nges towards cli nical tra nslati on J.Biotech no logyA

24、dva nces,2015,33(6 Pt 3):1380.15 Y Che ng , J Hao , LA Lee , MC Biewer , Q Wang et al.ThermallyCon trolled Release of An tica ncer Drug from Self-Assembled 丫 -SubstitutedAmphiphilic Poly( e -caprolactone) Micellar NanoparticlesJ.Biomacromolecules,2012,13(7):2163-2173.16 V. Zwilling, E. Darque-Cerett

25、i, A. Boutry-Forveille, et al. Structureand physicochemistry of anodic oxide films on titanium and TA6V alloy. Surf In terface Anal 1999,27(7):629-637.17 S. P. Albu , A. Ghicov , J. M. Macak ,et al. Self-Organized,Free-StandingTiO2 Nano tube Membra ne for Flow-through Photocatalytic Applicatio ns. N

26、anoLett. 2007, 7 (5):1286 128918 Vallet- Regi M. Ordered mesoporous materials in the con text of drug delivery systems and bone tissue engin eeri ngJ. Chemistry. 2006 Aug 7;12(23):5934-43.19 WangY, Dou L M, He H J, Zhang Y, Shen Q. Mol Pharmaceutics, 2014, 11(3): 885-894.3、研究内容、研究目标、拟解决的问题和今后研究思路(一)

27、 研究内容1. 微结构的制备：采用阳极氧化法在Ti表面制备不同管径、长度的 TiO2纳米管，构建PEG-NH-N二CH-PC聚合物胶束装载的载体（已部分完成） 在含 NH4F，H2O 和甘油的电解液中通过阳极氧化法在钛表面制备TiO2 纳米管阵 列。 对 TiO2 纳米管阵列进行表征。2. 制备PEG-NH-N二CH-PC聚合物胶束并载药 利用具有生物相容性和生物可降解的PEG和PCL作为原料，采用幵环聚合方法，合成PEG-NH-N二CH-PC嵌段共聚物，并将腙键引入到 PEG-NH-N二CH-PC的主链上， 并以此为构筑单元制备共聚物胶束。 取一定量的 PEG-NH-N=CH-PC和阿莫西林

28、溶于N，N -二甲基甲酰胺（DMF中， 超声溶解后滴入磷酸盐缓冲溶液后离心处理，冷冻干燥上层清液得到载药胶束。 采用动态光散射（DLS测量聚合物胶束的粒径及粒径分布.通过透射电镜（ TEM 观察其形态结构， 利用核磁共振证实腙键的成功引入， 用 UV/Vis 可见光谱检测 230nm 激发波长处的吸光度，绘制标准曲线，计算包封率和载药量。3. 采用真空冻干法装载聚合物胶束 在TiO2纳米管内装载已完成药物包封的 PEG-NH-N二CH-PC胶束。 在体外模拟体液中研究 PEG-NH-N二CH-PC胶束的pH智能响应性释放，通过改变TiO2 纳米管管径比，选出能最大程度装载聚合物胶束的制备参数。

29、4. 生物学评价1）体外细胞学评价对加载了含阿莫西林的 pH响应型聚合物胶束的TiO2纳米管进行生物相容性评价， 以及体外模拟炎症环境下药物缓释对于种植体周围炎中常见致病菌中金黄色葡萄球 菌、大肠杆菌的抑制作用。（二）研究目标本课题的主要目标是成功构建一种安全、有效的种植体周pH响应型局部缓释给药系统，以获得最大限度装载阿莫西林及聚合物胶束，充分发挥聚合物胶束pH智能响应型释放药物的优势，模拟种植体周围炎情况下的低 pH 环境，最大限度的提高 药物利用率，保证种植体的稳定性，提高种植成功率。其中包涵以下任务：（1） 成功构建一种安全、有效的种植体周局部缓释给药系统，获得TiO2 纳米管 加载聚

30、合物胶束实现pH响应性释放药物的效果。（2）体外模拟试验证实TiO2纳米管加载聚合物胶束 pH响应型释放药物，抑制种 植体周围炎的发生发展，提高种植成功率。（三）拟解决的问题如何控制聚合物胶束的粒径和 TiO2 纳米管管径及管长，以期可以达到最大载药 量和包封率的同时，保证 TiO2 纳米管的结构稳定性，是本项目亟需解决的问题。（四）今后研究思路利用本课题的实验基础，进一步探讨种植体周辅助给药应用，进一步研制更加 “智能”的种植体药物缓控释系统，如不需要时药物不会从 TiO2 纳米管中释放，而TiO2 纳米管情况需要时在某种因素刺激下药物可以按我们设定的释放动力学药从中释放。并进一步开展体内试

31、验研究，为其应用于种植临床奠定基础。在完成本课题的研究内容后，将申报浙江省自然科学基金以获得资金资助，使 研究工作继续发展，推动种植体周辅助给药领域的进步。4、研究方法、技术路线和进度安排（一）研究方法 阳极氧化法法制备 TiO2 纳米管阵列及表征材料：纯钛片1mn 2mm 0.5mm电解液： 0.50wt% NH4F+ 10vol% H2O 的甘油溶液。 DH1715A-5 型直流稳压电源提 供阳极氧化所需电源 , 在 2060V 电压下阳极氧化一定时间后， 立即取出样品用二次 水超声清洗并晾干。表征：场发射扫描电镜（SEM和透射电镜（TEM）观察分析试样表面形貌和内部结构， 并利用X射线能

32、量色散谱（EDS）分析TiO2纳米管组试样表面元素组成。 幵环聚合法制备PEG-NH-N二CH-PCL束及表征1.1 试剂聚乙二醇（PEG Mnr 5000）、对硝基苯基氯甲酸酯 （NPCF、对羟基苯甲醛（PHB、 -己内酯（ -CL）、阿莫西林、吡啶、水合肼、锌酸亚锡（阿拉试剂公司）；二 氯甲烷（CHCL）、二甲基亚砜（DMSO、N,N -二甲基甲酰胺（DMF （北京化工 厂）；其他为常用分析纯试剂1.2 PEG-NPCF勺合成称取PEG( 100mg 0.02mmol)溶于20mLC2CI 2中，用微量进样器向该反应体系中加入16.11 口 L吡啶，不断搅拌直至溶解.将5 mL NPCF

33、(200mg 0.99mmol)的CHC 溶液逐滴加入到反应体系中，搅拌 24h,控制整个反应过程的温度为0C.反应后，浓缩反应液并用石油醚、乙酸乙酯沉淀，重复操作3次后，真空干燥至恒重，即得白色固体PEG-NPCF1.3 PEG-NH-NH 的合成称取PEG-NPC(100mg 0.02mmol)溶于10mL无水乙醇，将29.10 口 L水合肼逐滴滴加 到反应体系中，90 C回流搅拌48h.冷却至室温后，浓缩反应液，加入石油醚、乙酸 乙酯，使沉淀析出，用无水乙醇洗涤沉淀，重复操作3次后，真空干燥即得淡黄色固体 PEG-NH-N2H1.4 PEG-NH-N二CH-OH勺合成称取 PEG-NH-

34、NH(200mg 0.04mmol)，PHB(20mg 0.016mmol)置于 Schlenk 瓶中, 用4 m啲DMS溶解，加入1滴无水乙酸，抽真空充氮气循环35次，密封Schlenk瓶，于65 C搅拌反应4 8h .用石油醚、乙酸乙酯沉淀，过滤，重复操作3次后， 真空干燥即得白色固体.1.5 PEG-NH-N二CH-PC的合成在Schlenk 瓶中，将PEG-NH-N二CH-(!00mg 0.02mmol)， -CL (130mg 1.14mmol)， 锌酸亚锡(20.25mg，0.05mmol)溶于5m呼苯中，抽真空充氮气循环35次，于110C搅拌反应24h.冷却至室温后，加入适量氯仿

35、使反应物完全溶解，用冷乙醚沉淀，过滤，真空干燥即得淡黄色固体PEG-NH-N二CH-PCL1.6 聚合物胶束的自组装将10m聚合物加入到ImIDM中，超声直至溶解，然后逐滴滴加（1滴 /15s ） 10ml蒸 馏水，室温搅拌14h后即得稳定的聚合物胶束.取 5mLL胶束溶液转移至透析袋（MWCO300冲，用蒸馏水透析48h，即得空白聚合物胶束。37C条件下，采用动态 光散射（DLS测量聚合物胶束的粒径及粒径分布.通过透射电镜（TEM）观察聚合物胶束的形态结构.将透析得到的聚合物胶束滴在铜网表面，放在红外灯下，待干燥 后，采用TEM检测，加速电压为200kV。1.7 载药胶束的制备与体外释放将5

36、mgPEG-NH-N二CH-PCL2mg阿莫西林溶于0.5mL DM中，超声直至溶解，然后向溶液中逐滴滴加（1滴/15s）5mL磷酸盐缓冲溶液（pH7.4），室温下搅拌24h .将载药胶 束溶液转移至透析袋（MWC030000中，在磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）中透析48h，在 12000r/min下离心15min，冷冻干燥上层清液得到载药胶束，整个过程在避光条件下进行.配制不同浓度的阿莫西林溶液，在 37C下，用UV/Vis可见光谱检测230nm激发 波长处的吸光度，绘制标准曲线.为了测量载药量，将冻干的载药胶束溶于DM中，检测其在230nn处的吸光度值，并带入标准曲线方程中，包封率和载药量的

37、计算公式 如下：包封率=（负载到胶束中阿莫西林的质量/投入药质量）X 100%药量=（负载到胶束中阿莫西林的质量/载药胶束质量）X 100% 真空冻干法加载PEG-NH-N二CH-PCL束至TiO2纳米管及表征用PBS溶液将PEG-NH-N二CH-PCt束配制成0.5mg/mL的溶液。在清洗并干燥完成的二氧化钛纳米管表面加载PEG-NH-N二CH-PC胶束。每次在二氧化钛纳米管表面移液管滴加10卩L PEG-NH-N二CH-PCL交束溶液，尽量铺匀整个表面。然后将试样放入冻干机中，在温度设定为室温，抽真空，干燥 2h。重复上述加载步骤，直到每片试样加载到100ug（A组，n=5）或每片加载到2

38、00 ug （B组，n=5）。在最后一次加载蛋白干燥后，每一试样用移液管吸取500卩L PBS快速冲洗表面，移除未与纳米管牢固结合多余的 BSA收集冲洗液，保存用于后续分析。实验重复3次。加载量D1,冲洗下来的量是D2,那么加载效率为:n =（D1-D2）/D1 。 体外模拟炎症状态下阿莫西林释放测试将试样放入24孔板中，500卩L SBF中浸泡，分两组，分别为pH7.4和5.5，置于 每分钟70转的摇床上，在一定时间间隔内（ 1h、3h、5h、10h、24h、3d、5d、7d、 10d、20d、30d、40d、50d）收集200 口 L液体备用，再加入新鲜的 200 口 L SBF。收 集的

39、液体用ELISA法检测浓度，计算释放的剂量，绘制释放曲线。 抗菌性能检测将载有含阿莫西林的聚合物胶束组、对照组（仅装载阿莫西林）、空白对照组（不装载药物）的钛片裁成 1mm 1mm大小，每组个三个样本，灭菌放置，备用。再将 金黄色葡萄球菌接种于三组材料表面培养 24 小时，将洗脱液于琼脂平板上均匀推 开，需氧培养 24 小时后平板计数。抗菌率=（对照组菌落数cfu-实验组菌落数cfu）/对照组菌落数cfu x 100%（二）技术路线纯钛片阳极氧化TiO2纳米管阵列 I IPEG-NH-N二CH-PC胶束真空冻干法载药TiO2纳米管阵列在体外模拟体液中研究阿莫三）进度安排、西林的pH响应型释放动

40、力学采用对照组和实验组进行抗菌性能检测第一年度(2018 1-2018 12 ):1. 资料收集，调研、课题设计完善；2. TiO2纳米管阵列制备及检测3. pH响应型PEG-NH-N二CH-PC胶束制备及其表征第二年度（2019.1-2019.12 ）:1. 完成TiO2纳米管内PEG-NH-N二CH-PC胶束装载2. TiO2纳米管负载PEG-NH-N二CH-PC胶束性能检测3. 载阿莫西林聚合物胶束的缓释动力学研究及其调控第三年度( 2020.1-2020.12 )：1. 细胞生物学评价及抗菌性能检测2. 结果分析，综合评价，课题结题，成果鉴定5、主要创新点本课题针对目前钛种植体表面抗菌

41、药物缓释存在的问题， 设计了一种新型的智能药物缓释系统，利用炎症和正常组织的 PH差异，实现种植体微环境对抗菌药物释放 的智能调控；改变了目前钛种植体表面药物缓释系统仅仅按照既定程序释放而不能对组织微环境作出相应响应的缺点，提高抗菌效率。在钛纳米管表面实现 PH响应的药物缓释系统，为种植体体表面生化修饰和药物缓释提供了新思路。6、项目预期成果、考核指标1. 成功将腙键引入到两亲性嵌段共聚物 PEG-NH-N二CH-PCL主链上，实现聚合物的pH 响应特性，制备载药胶束。2. 明确载药胶束最大程度的装载入 TiO2纳米管内，并实现pH响应型药物缓释。3. 钛种植体均具有良好的生物相容性， 不影响

42、钛种植体表面的生物矿化和细胞活力。4. 细胞生物学实验结果证实，在炎症状态下ph响应药物缓释系统有更好的抗菌效果， 更有利于炎症状态下，种植体周围骨结合。 5. 在国内外核心期刊上发表论文 2篇，其 中SCI源刊文章1篇，申请国家发明专利1项。7、现有工作基础和条件(1) 课题组人员组成及实验室条件项目申请者长期从事口腔相关生物材料研究，已经在 Carbonhydrate Polymers(IF=3.628), International Journal of Molecular Sciences ( IF=2.453), Advanced Materials Research ，中国组织工程

43、医学研究、口腔医学研究发 表文章数篇，其中以第一作者发表 SCI论文3篇，以通讯作者发表EI论文1篇，具有一 定的生物材料研究经验。项目组成员均具有生物材料研究经验，发表多篇论文。申请者所在口腔材料研究所一贯强调口腔医学特色， 以牙颌面修复重建为研究 主线，开展生物材料研制和评价，先后承担国家、部省级课题多项。本课题组前期 研究为本项目钛表面改性材料制备进行了系统的工作。所在单位设备齐全，测试手 段完整，已有设备包括扫描电子显微镜、光学显微镜、原子力显微镜、 X 射线光电 子能谱分析、冷冻干燥设备、真空干燥设备、恒压稳压电、百级细胞培养净化室， 细胞及分子生物学研究工作所需的设备和仪器，如：细

44、胞活力仪、流式细胞仪、实 时荧光定量PCF仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、低温离心机、激光共聚焦显微镜、 Micro-CT 仪等较为齐全的研究手段和设备。具备以上条件将给本项目的实施及计划 落实提供可靠保证。另外，本研究所需的试剂和原料(包括国外公司产品)均可在 国内购得，实验所需的细胞株、标准菌株本课题组实验室均具备。综上，本项目所开展的工作在理论上、研究的内容和技术手段、研究人员的前 期工作基础、目前的实验室条件评价可行，并有望达到预期目标。发表的相关论文：ite?Coatings?on?Titanium?Substrates.International?Jouranl?of?Molecul

45、ar?0862.In vivo evaluation of in situ polysaccharide based hydrogel for prevention of postoperative adhesion. Carbohydrate Polymers,2012,90(2):1024-1031.3.Sol-Gel-Derived Hydroxyapatite-Carbon Nanotube/Titania Coatings onTitanium Substrates. International Journal of Molecular Sciences，2012,13(4):524

46、2-5253.4. Effects of Shaking Frequency on Growth and Adhesion Behaviour ofStreptococcus Mutans,2013,749:p206-2105. Hierarchical structure and mechanical properties of remineralized dentin.J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2014, 40, 297-306.6. Biomimetic promotion of dentin remineralization using L-glut

47、amic acid:inspiration from biomineralization proteins, JOURNALOFMATERIALSCHEMISTRY B,2014, 2: (28): 4544-45537. Prosthodontic Rehabilitation of Malpositioned Implants AfterAmeloblastoma Followed by Mandibulectomy and Costal Bone Graft: A ClinicalReport, Implant Dentistry,2013,22 (1):16-198. Bio-insp

48、ired enamel repair via Glu-directed assembly of apatitenanoparticles: an approach to biomaterials with optimal characteristics. AdvMater 2011, 23 (40), 4695-4701.9. Does endodontic post space irrigation affect smear layer removal and bonding effectiveness EUROPEAN JOURNAL OF ORAL SCIENCES, 2009,117

49、(5), 597-60310. Effect of Different Irrigation on Smear Layer Removal after Post Space Preparation, JOURNAL OF ENDODONTICS, 2009 35 (4),583-58611. Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks,JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY, 2011, 18 (34), 4079-408412. Glutaraldehyde-

50、induced remineralization improves the mechanical properties and biostability of dentin collagen.Materials Science andEngineering C , 67 (2016) 657- 665(2) 课题组前期相关的研究成果本课题组前期利用阳级氧化法成功地在 Ti 表面制备了 TiO2 纳米管阵列， 通过控 制反应条件可控制形成的 TiO2 直径在 20-300nm 之间，为装载聚合物胶束奠定了基 础。图一 不同电压下制备 TiO2纳米管阵列表面形貌 5皿图(10.0kv X 30,0

51、00 ) (a)80V (b)60V (c)40V (d)30V图二 经450C退火处理的TiO2纳米管阵列EDS图谱上图是iO2纳米管阵列的EDS图谱，只检测到Ti、O元素，且峰值明显。元素定量分析结果表明，样品中含有Ti、O所占的原子百分比分别为33.79、66.211:2,表明样品以TiO2形式存在为主。图三载阿莫西林TiO2纳米管阵列XR谱图四阿莫西林体外释放曲线8、经费预算与说明幵支科目专项经费（万元）配套经费（万元）预算说明设备费0.000.00无材料费1.01.15购买钛片、试剂、细胞培养相关材料试验化验加工费1.01.0场发射扫描电镜（SEM、透射电镜（TEM），并利用X 射线能量色散谱（EDS）、接触角测量仪测量接 触角、原子力显微镜(AFM)、X射线电子能谱仪(XPS)燃料动力费0.000.00无管理费0.150.00按相关规定提取会议费0.000.00无差旅费0.350.35参加学术交流以 及到其他科研机 构科学咨询的差 旅费出版/文献/信息传播/知识产权事务费0.30.3文章出版费及文献检索费用合作、协作研究与交流费0.20.2参加口腔生物材料会专家咨询费0.000.00无人员劳务费0.000.00无外拨费用0.000.00无其他幵支0.000.00无