分子生物学6-分子克隆

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1、分子克隆分子克隆（基因工程）（基因工程）周坤福前言前言n 二十世纪二十世纪4040年代，基因分子生物学家确定年代，基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNADNA，而不是蛋白质而不是蛋白质 19441944年年O.T.AveryO.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是等证明了肺炎球菌转化因子是DNADNA n 50 50年代，年代，WastonWaston和和CrickCrick揭示了揭示了DNADNA分子的分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制双螺旋结构模型和半保留复制机制 深刻意义在于：深刻意义在于：解决了基因自我复制和遗传信息

2、的传解决了基因自我复制和遗传信息的传递问题递问题n 5050年代末和年代末和6060年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码。和操纵子学说，并成功破译了遗传密码。 从而阐明了遗传信息的流向和表达问题从而阐明了遗传信息的流向和表达问题DNA mRNA DNA mRNA 蛋白质蛋白质 转录转录 翻译翻译tRNAtRNA，rRNArRNA 逆转录逆转录复制复制这些都为基因工程的诞生奠定了坚实的这些都为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础理论基础 基因工程的诞生基因工程的诞生n 7070年代初，年代初，DNADNA限制性内切酶的发现和一整套限制性内切酶的发现

3、和一整套DNADNA体外重体外重组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。n 19721972年，美国学者年，美国学者Berg.PBerg.P等人首次在体外把等人首次在体外把SV40SV40（一种一种猴病毒）的猴病毒）的DNADNA和噬菌体和噬菌体DNADNA分别切割，又将两者接在一起，分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工成功地构建了第一个体外重组的人工DNADNA分子。分子。n 19731973年，年，CohenCohen等人首次将体外重组的等人首次将体外重组的DNADNA分子导入大肠分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无

4、性繁殖，从而完成了杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNADNA体外重组和体外重组和扩增的全过程。扩增的全过程。 基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。 基本概念基本概念n 基因工程的核心是基因工程的核心是重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technique），），又叫又叫DNA克隆克隆（DNA cloning）。）。n 所谓所谓克隆克隆（clone）是指通过无性繁殖过程所产是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。生的与亲代完全相同的子代群体。n 在基因工程中所指的克隆，是指在体外对在基因工程中所指的克隆，是指在体外对

5、DNA分分子按照既定目的和方案进行人工重组，并将重组分子子按照既定目的和方案进行人工重组，并将重组分子导入适合的宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以导入适合的宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该获得该DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。基本概念基本概念n 这类克隆是在分子水平上操作，故又称这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆分子克隆（molecular cloningmolecular cloning）。）。由于研究对象常常是特异的基因由于研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作片段，所以又称作基因克隆基因克隆（gene cloninggene cloning）。）。实现基因实现

6、基因克隆所采用的方法及相关工作统称为克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程基因工程（genetic genetic engineeringengineering）。）。n 基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域工程共同构成了当代新兴的学科领域生物技术工程生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大动力。卫生事业的进步提供了巨大动力。细胞克隆技术：细胞克隆技术：在制备单克隆抗体的在制备单克隆抗体的B B淋巴细胞杂交淋

7、巴细胞杂交瘤技术中运用的最为充分。瘤技术中运用的最为充分。哺乳动物的克隆：克隆概念在个体水平上的应用哺乳动物的克隆：克隆概念在个体水平上的应用 采用了核质分离、细采用了核质分离、细胞融合、体外培养及胞融合、体外培养及胚胎移植等技术胚胎移植等技术 主要内容从复杂的生物有机体基因组中，分离出从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段目的基因片段。在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的选择标记的载体分子载体分子上，形成上，形成重组重组DNADNA分子分子。将重组将重组DNADNA分子转移到适当的分子转移到适当的受体细胞受体细胞（

8、亦称（亦称宿主细胞宿主细胞），），并与之一起增殖。并与之一起增殖。筛选出获得了重组筛选出获得了重组DNADNA分子的分子的受体细胞克隆受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。进一步研究使用。将目的基因克隆到将目的基因克隆到表达载体表达载体上，导入寄主细胞，使之实上，导入寄主细胞，使之实现功能表达。现功能表达。供 体 细 胞目 的 基 因载 体重 组 D N A 分 子转 化 细 胞受 体 细 胞多 肽 药 物疫 苗 、 抗 体基 因 治 疗基 因 诊 断 转 基 因 动 物( 畜 牧 业 、 渔 业 生 物

9、反 应 器 )转 基 因 植 物( 农 业 、 林 业 生 物 反 应 器 )冶 金 、 环 保轻 工 、 食 品应用实例应用实例n 重组重组DNADNA技术跨越天然物种屏障，将原核和真核生物，技术跨越天然物种屏障，将原核和真核生物，植物和动物，细菌和人，动物和人的基因连接起来，进行植物和动物，细菌和人，动物和人的基因连接起来，进行基因交流基因交流。 利用大肠杆菌（利用大肠杆菌（E.coliE.coli) )、酵母、哺乳动物细胞表达系酵母、哺乳动物细胞表达系统来生产人类所需要的，从其他方法又难以大量获得的统来生产人类所需要的，从其他方法又难以大量获得的重重组蛋白质组蛋白质。n1 1、第一个用细

10、菌表达的用于人类的基因重组药物、第一个用细菌表达的用于人类的基因重组药物人胰人胰岛素岛素上市（上市（ 19791979年美国基因技术公司）年美国基因技术公司）牛、猪胰岛素，免疫反应牛、猪胰岛素，免疫反应化学合成人胰岛素基因化学合成人胰岛素基因插入插入E.coliE.coli表达载体中表达载体中 - -半半乳糖苷酶基因后乳糖苷酶基因后融合蛋白融合蛋白溴化氰水解溴化氰水解混合重建混合重建2、用酵母细胞生产乙、用酵母细胞生产乙型肝炎病毒亚单位疫型肝炎病毒亚单位疫苗苗包膜蛋白包膜蛋白核心蛋白核心蛋白病毒病毒DNA乙肝病毒乙肝病毒 用基因工程方法制备乙用基因工程方法制备乙肝表面包膜蛋白为抗原亚肝表面包膜

11、蛋白为抗原亚单位疫苗无致病力，很安单位疫苗无致病力，很安全、高效。全、高效。3、生物钢扫描电子显微镜下的蜘蛛单丝表面扫描电子显微镜观察下的蜘蛛单丝断面 蜘蛛丝被拉断时显示出的“皮”结构，也称鞘 结构（箭头所示部分）蜘蛛丝被拉断时显示出的芯结构，也称剑 结构（箭头所示部分） 目前世界范围内开发的基因工程多肽目前世界范围内开发的基因工程多肽药物、疫苗、抗体有药物、疫苗、抗体有五百五百多种多种 理论意义1、彻底填平了生物种属间不可逾越的鸿沟2、重组技术缩短了进化单位3、能按人们的意愿定向改造、培育新品种4、解决医学与生物学上长期无法解决的许多重大（如是什么基因、在什么地方、什么时间、起什么作用？如何

12、起作用？）人们预言，21世纪是生命科学的世纪，以基因工程为主导的生物技术可能对世界的重大问题饥饿、疾病、能源、污染等提出切实的解决办法，推动社会生产力的飞速发展。一、分子克隆中常用的工具酶一、分子克隆中常用的工具酶n在重组在重组DNA与基因工程中，对目的基因的分与基因工程中，对目的基因的分离、剪切和重组涉及到一系列酶催化反应，离、剪切和重组涉及到一系列酶催化反应，这些酶就像外科医生的手术刀一样，是进行这些酶就像外科医生的手术刀一样，是进行基因工程操作必不可少的工具。常分为基因工程操作必不可少的工具。常分为限制限制性 核 酸 内 切 酶性 核 酸 内 切 酶 （ r e s t r i c t

13、i o n endonuclease）、）、连接酶连接酶（ligase）和和核核酸修饰酶酸修饰酶（modifying enzyme）。）。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 n 限制性核酸内切酶是指能识别限制性核酸内切酶是指能识别DNADNA的特殊序列，并的特殊序列，并在识别位点或其周围切割双链在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一类酶。的一类酶。n 它主要来源于它主要来源于原核生物原核生物，可将侵入宿主细胞的外源，可将侵入宿主细胞的外源性性DNADNA迅速降解，而对细菌自身的迅速降解，而对细菌自身的DNADNA，则通过甲基化酶则通过甲基化酶在该种限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的在该种限制

14、酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNADNA不被不被降解。降解。n 限制性内切酶由于能限制外源限制性内切酶由于能限制外源DNADNA的的“入侵入侵”而得而得名。名。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名n 命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个有三个斜体字母斜体字母的缩写表示。的缩写表示。n第一个大写字母取自细菌第一个大写字母取自细菌属名属名的第一个字母；的第一个字母；n第二、三个小写字母取自微生物第二、三个小写字母取自微生物种名种名的头两个字母；的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的第四个字母代表该微生物同种内不同的株系株系；如果

15、；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。的先后顺序，用罗马数字表示。n 例如，从大肠杆菌（例如，从大肠杆菌（Escherichia ColiEscherichia Coli）RYRY1313株中发现分离的第一种限制酶，称为株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoEcoR R I I。限制酶的分类及特点限制酶的分类及特点 n根据限制酶的组成、辅因子及切割根据限制酶的组成、辅因子及切割DNADNA方式不方式不同，可分为同，可分为I I、IIII、IIIIII型。型。n重组重组DNADNA技术中常用的是技术中常用的是II

16、II型限制性内切酶型限制性内切酶。IIII型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链以内切方式水解双链DNADNA中的中的磷酸二酯键磷酸二酯键，产，产生的生的DNADNA片段片段5 5 端为磷酸基端为磷酸基，3 3 端为羟基端为羟基。n识别顺序一般为识别顺序一般为4 46 6个碱基，通常是回文结构个碱基，通常是回文结构（palindromepalindrome）。识别序列的大小决定其切割。识别序列的大小决定其切割DNADNA后产生的片段的长短。后产生的片段的长短。4444256256、464640964096、48486553665536 I

17、III型酶切割双链型酶切割双链DNADNA产生产生3 3种不同的切口：种不同的切口：在对称轴中心同时切割双链，产生在对称轴中心同时切割双链，产生平末端平末端或称或称钝性末端钝性末端（blint end），如），如Hpa I： 5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC3 3 CAATTG5 3 CAA TTG 5 在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5 端切割产生端切割产生5 端突出的粘性端突出的粘性末端末端，如，如EcoR I： 5 GAATT C3 EcoR I 5 G AATTC3 3 C TTAAG5 3 CTTAA G 5 从从3 端切

18、割产生端切割产生3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端。如。如Pst I： 5 C TGCAG3 Pst I 5 CTGCA G3 3 GACGT C5 3 G ACGTC 5 同工同工异源酶异源酶1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶或多种限制酶 2. 特点：特点：1）识别相同顺序）识别相同顺序 2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnI GGTAC C SstI CCGC GG Asp718 G GTACC SacI CCGC GG同尾酶有些限制酶识别序列不同，但产生相同的粘性末端，称这些酶为同尾酶。如：BamH I (G GATCC)和

19、Sau3A I (N GATCN)由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性5 GAATT C3 5 NAATT N 3 星号活力星号活力 EcoR I * 星号活力：星号活力： 限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异性识别顺序类似的序列，这种现割一些与其特异性识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力。象称星号活力。诱发星号活力常见原因：诱发星号活力常见原因： 1、高甘油含量（、高甘油含量（5%，V/V） 2、内切酶用量过大，内切酶用量过大， （100U/gDNA） 3、低离子强度：低离子强度：8 5、含有机溶剂：

20、二甲基亚砜、乙醇、乙烯二乙醇等含有机溶剂：二甲基亚砜、乙醇、乙烯二乙醇等 6 、有、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非等非Mg2+的二价阳离子。的二价阳离子。 。应用在分子生物学和基因工程中具有举足轻重的地位。其主要胜用途：1、改造及组建质粒2、组建基因组DNA物理图谱3、基因组DNA同源性研究4、DNA重组克隆及亚克隆5、DNA杂交与序列分析注意事项注意事项1.酶切底物酶切底物DNA要纯，抽提时酚氯仿要去除干净。要纯，抽提时酚氯仿要去除干净。2.所加酶量不应超过所加酶量不应超过10（RE保存在保存在50的甘油中的甘油中20度较稳度较稳定）。定）。3.取酶时量要准，最后加酶，最好在冰

21、箱里加。取酶时量要准，最后加酶，最好在冰箱里加。4.酶切反应酶切反应2小时左右，可延长，节约酶量。小时左右，可延长，节约酶量。5.两种酶有相同的缓冲液，可双酶切；不同，先用需低盐缓冲液两种酶有相同的缓冲液，可双酶切；不同，先用需低盐缓冲液的限制酶消化，再用需高盐缓冲液的酶消化。的限制酶消化，再用需高盐缓冲液的酶消化。DNADNA连接酶连接酶n 连接酶可催化连接酶可催化DNADNA分子中相邻分子中相邻5 5 磷酸基磷酸基和和3 3 羟羟基基末端之间形成末端之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键，使，使DNADNA切口封合或使两切口封合或使两个个DNADNA分子或片段连接。常用的有分子或片段连接。常用的有T

22、 T4 4（噬菌体）噬菌体）DNADNA连接酶和连接酶和E E. .ColiColi DNA DNA连接酶。连接酶。DNADNA聚合酶聚合酶 n 重组重组DNADNA技术中，聚合酶（技术中，聚合酶（polymerasepolymerase）的最重要作用的最重要作用是以是以DNADNA或或RNARNA为模板在体外合成为模板在体外合成DNADNA或或RNARNA。可分为可分为DNADNA聚合聚合酶和酶和RNARNA聚合酶两大类。聚合酶两大类。n RNARNA聚合酶聚合酶以以DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA。常用于离体条件下，常用于离体条件下，合成单链合成单链RNARNA作为杂交探针。作

23、为杂交探针。 n 常用常用的的DNADNA聚合酶有聚合酶有大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I大片段大片段( (klenowklenow) ) 以以DNADNA为模板，催化为模板，催化5 3 5 3 核酸链的延长，另有核酸链的延长，另有3 5 3 5 的外切酶活性。常用于的外切酶活性。常用于DNA 3 DNA 3 末端的标记和填充；末端的标记和填充；cDNAcDNA第第二链的合成，二链的合成，DNADNA测序。测序。 磷酸酶磷酸酶 n牛小肠碱性磷酸酶（牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal calf intestinal alkaline alkaline phosphat

24、asephosphatase, CIP, CIP），），催化催化DNADNA或或RNARNA的的5 5 磷酸基水解。磷酸基水解。n常用于去除线状载体常用于去除线状载体DNADNA两端的两端的5 5 磷酸基团，磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用防止载体自身连接环化；也用于用3232P P标记标记DNADNA的的5 5 末端之前除去原来的末端之前除去原来的5 5 磷酸基。磷酸基。逆转录酶逆转录酶 n以以RNARNA为模板，合成为模板，合成cDNAcDNA链（链（5 35 3），另有），另有RNARNA酶酶H H活性。活性。常用于常用于cDNAcDNA第一，二链的合成及反转录第一，二链的合成及

25、反转录PCRPCR（RT-PCRRT-PCR）。）。 名称名称 功能及应用功能及应用大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 以以DNA为为模板，催化模板，催化5 3 核酸链的延长，另有核酸链的延长，另有3 5 的外的外切酶切酶 大片段大片段 （klenow） 活性。常用于活性。常用于DNA 3 末端的标记和填充、末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、第二链的合成、 DNA测序。测序。Taq DNA聚合酶聚合酶 以以DNA为模板，催化为模板，催化5 3核酸链的延长，另有弱的核酸链的延长，另有弱的5 3的外切的外切 酶活性，耐高温。常用于酶活性，耐高温。常用于PCR及及DNA测序。测序。末端转移酶

26、末端转移酶 催化催化NTP中的中的NMP通过其磷酸基与通过其磷酸基与DNA 3 -OH连接而使连接而使DNA链链 延长，延长，无需模板无需模板。常用于。常用于3 端标记或形成端标记或形成DNA共聚尾巴。共聚尾巴。逆转录酶逆转录酶 以以RNA为模板，合成为模板，合成cDNA链（链（5 3），另有），另有RNA酶酶H活性。活性。常常 用于用于cDNA第一、二链的合成及反转录第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。）。RNA聚合酶聚合酶 以以DNA为模板合成为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链常用于离体条件下，合成单链RNA作为作为 杂交探针。杂交探针。二、分子克隆中常用的载体二、分

27、子克隆中常用的载体n 基因工程载体（基因工程载体（vectorvector）是供插入目的基因并将其导入是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的宿主细胞内表达或复制的运载工具运载工具。什么样的载体才是较为。什么样的载体才是较为理想的呢？其基本条件是：理想的呢？其基本条件是：能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。具有适当的限制性酶切位点，以便目的基因的插入。具有适当的限制性酶切位点，以便目的基因的插入。载体分子大小合适，太大不易复制；太小不易容纳较大目的载体分子大小合适，太大不易复制；太小不易容纳较大目的基因。基因。具有合适的筛选标记（如抗药性

28、基因，酶基因等），以便筛具有合适的筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以便筛选阳性克隆。选阳性克隆。如作为表达载体，要配备适当的调控元件，如启动子、增强如作为表达载体，要配备适当的调控元件，如启动子、增强子等。子等。载体的分类载体的分类n 一般常用的载体按来源分有一般常用的载体按来源分有质粒（质粒（plasmid）、）、噬菌体噬菌体（phage）和病毒（和病毒（virus）。天然的质粒、噬菌体、病毒都天然的质粒、噬菌体、病毒都需经过人工改造才能成为合乎要求的基因工程载体。需经过人工改造才能成为合乎要求的基因工程载体。n质粒和噬菌体常用于以原核细胞为宿主的分子克隆；质粒和噬菌体常用于以原核细胞为

29、宿主的分子克隆； 动物病毒常用于以真核细胞为宿主的分子克隆。动物病毒常用于以真核细胞为宿主的分子克隆。n 载体按得到的产物分类：载体按得到的产物分类： 克隆载体克隆载体（cloning vector）主要用于主要用于DNA大量扩增，大量扩增，并不需要得到目的基因所编码的蛋白质。并不需要得到目的基因所编码的蛋白质。表达载体表达载体（expression vector），），使插入的目的基因使插入的目的基因可转录、进而翻译成多肽链而设计的载体，具有表达外源基可转录、进而翻译成多肽链而设计的载体，具有表达外源基因的能力。因的能力。质粒载体染色体质粒 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链质粒是存在于

30、细菌染色体外的小型环状双链DNADNA分子，能在宿主细分子，能在宿主细胞独立自主地进行胞独立自主地进行复制复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。 质粒带有某些质粒带有某些遗传信息遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状，如质粒携，会赋予宿主细胞新的遗传性状，如质粒携带的氨苄青霉素抗性基因使宿主细胞对氨苄青霉素产生抗性，从而轻易带的氨苄青霉素抗性基因使宿主细胞对氨苄青霉素产生抗性，从而轻易地筛选出成功转化了质粒的细菌。地筛选出成功转化了质粒的细菌。 载体质粒上往往还引入了载体质粒上往往还引入了“多克隆位点（多克隆位点（multiple cloning m

31、ultiple cloning sitessites）”，即一段人工合成的即一段人工合成的DNADNA序列，上面含有密集的多种限制性酶序列，上面含有密集的多种限制性酶切位点，以供插入外源基因片段。切位点，以供插入外源基因片段。 另外，较好的载体往往还引入多种用途的另外，较好的载体往往还引入多种用途的辅助序列辅助序列，如供蓝白斑筛，如供蓝白斑筛选的选的 LacZLacZ 基因。基因。 pBR322 质粒图谱氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素抗四环素抗性基因性基因多克隆位点多克隆位点pUCpUC 质质粒图谱粒图谱突变型突变型lac- E.coli表达表达-半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的 片段片段

32、。 如果插入的外源基因如果插入的外源基因是在是在lacZ基因内，就会基因内，就会影响影响lacZ的表达，利用的表达，利用lac - E.coli为为转染或感转染或感染细胞，在含染细胞，在含X-gal的的培养基上生长时会出现培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌因插入，则出现蓝色菌落。落。多克隆位点多克隆位点编码编码-半乳半乳糖苷酶的糖苷酶的片段片段 - - 互 补 ：互 补 ： （ a l p h a a l p h a complementationcomplementation） pUCpUC质粒带有质粒带有大肠杆菌大肠杆菌- -半乳糖苷酶基因的一

33、半乳糖苷酶基因的一个片段个片段LacZLacZ基因基因，它编码，它编码- -半乳半乳糖苷酶的一个片段，而宿主细胞能糖苷酶的一个片段，而宿主细胞能编码与这个片段互补的编码与这个片段互补的- -半乳糖半乳糖苷酶的另一部分，实现苷酶的另一部分，实现互补互补，形成形成完整的完整的- -半乳糖苷酶，此酶能分半乳糖苷酶，此酶能分解发色底物解发色底物X-galX-gal，形成形成蓝色菌落蓝色菌落。当外源基因插入后，当外源基因插入后，LacZLacZ基因被破基因被破坏，不能合成完整的坏，不能合成完整的- -半乳糖苷半乳糖苷酶，因此不能分解底物酶，因此不能分解底物X-galX-gal，菌菌落成白色落成白色。 因

34、此通过蓝白斑筛选可因此通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组体与非重以筛选、鉴定重组体与非重组体载体。组体载体。噬菌体载体噬菌体载体 是一种细菌病毒，可作为克隆载体。其优点是是一种细菌病毒，可作为克隆载体。其优点是可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。 目前使用的噬菌体载体主要有目前使用的噬菌体载体主要有噬菌体衍生物载噬菌体衍生物载体体、粘粒载体粘粒载体和和单链单链M13噬菌体载体噬菌体载体等。除等。除M13噬菌噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源即可插入较大的外源DNA片段（

35、如片段（如20kb以上）。以上）。噬 菌 体头部尾部尾丝噬菌体感染细菌示意图M M1313噬菌体噬菌体 n 目前常用的单链载体是经改建的目前常用的单链载体是经改建的M M13mP13mP系列。其中引入了系列。其中引入了lacZlacZ基因一部分和多克隆位点，因此也可用蓝白斑筛选重组基因一部分和多克隆位点，因此也可用蓝白斑筛选重组DNADNA。n M M1313噬菌体基因组是单链环状噬菌体基因组是单链环状DNADNA，当它侵犯宿主菌后，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链在细菌胞内酶的作用下，单链DNADNA转变成复制型双链转变成复制型双链DNADNA，可可提取出来做基因重组提取出来做基

36、因重组。n 双链双链DNADNA在大肠杆菌中复制在大肠杆菌中复制100-200100-200拷贝后，拷贝后，M M1313的合成的合成转变成不对称地合成双链中的一条，产生大量单链转变成不对称地合成双链中的一条，产生大量单链DNADNA，并并包装成成熟的噬菌体颗粒，透出菌壁，释放到培养基中。因包装成成熟的噬菌体颗粒，透出菌壁，释放到培养基中。因此可以从大肠杆菌培养基中分离此可以从大肠杆菌培养基中分离单链单链DNADNA。n M M1313噬菌体的最大特噬菌体的最大特点就是能产生单链点就是能产生单链DNADNA，这是独一无二的。这是独一无二的。n 因此从培养基上收因此从培养基上收获到的含目的基因的

37、获到的含目的基因的M M1313单链单链DNADNA可直接作为模板可直接作为模板进行双脱氧链终止法进行双脱氧链终止法测测序序和寡核苷酸和寡核苷酸定点突变定点突变。噬菌体噬菌体（lambdlalambdla bacteriophagebacteriophage） n 噬菌体是一种大肠杆菌病毒，为线性双链噬菌体是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNADNA，它的两它的两端各有端各有1212个碱基的互补粘性末端，称个碱基的互补粘性末端，称COSCOS位点。当噬菌体侵位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。n 噬菌体侵入细菌后，即可噬

38、菌体侵入细菌后，即可裂解生长裂解生长（环状（环状DNADNA在细菌在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以裂解宿主菌），又可以溶源生长溶源生长（噬菌体噬菌体DNADNA整合到细胞整合到细胞染色体基因组染色体基因组DNADNA中，与染色体中，与染色体DNADNA一起复制，并遗传给子代一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。细胞，宿主细胞不被裂解）。n 噬菌体基因组噬菌体基因组中功能相关基因集中中功能相关基因集中分布。分布。n 包装限制性。重包装限制性。重组子大小在组子大小在7575105105，

39、可被包装成为成，可被包装成为成熟颗粒。熟颗粒。 n DNADNA在体外可包装在体外可包装成病毒颗粒（将重组成病毒颗粒（将重组DNADNA包装进入头部或尾包装进入头部或尾部蛋白中），并高效部蛋白中），并高效感染大肠杆菌。感染大肠杆菌。粘粒载体粘粒载体（cosmidcosmid vector vector，又又称柯斯质粒载体）称柯斯质粒载体） n 粘粒载体由粘粒载体由质粒质粒DNADNA和和噬菌体噬菌体DNADNA两部分组成。两部分组成。n 粘粒具有质粒的特性，在宿主细胞中能自主复制，粘粒具有质粒的特性，在宿主细胞中能自主复制，有克隆位点，也有抗药性基因。有克隆位点，也有抗药性基因。n 同时粘粒又

40、具有同时粘粒又具有噬菌体的特性。在噬菌体的特性。在DNADNA中主要中主要是是DNADNA的粘性末端的粘性末端COSCOS位点及其与包装有关的短片段。位点及其与包装有关的短片段。能按能按噬菌体噬菌体DNADNA分子的同样方式环化起来，克隆外源分子的同样方式环化起来，克隆外源DNADNA后，经体外包装能高效进入大肠杆菌细胞。后，经体外包装能高效进入大肠杆菌细胞。n 粘粒的一大特点是能容纳长达粘粒的一大特点是能容纳长达353545kb45kb的的大片段大片段外源外源DNADNA，因此常用作大片段外源因此常用作大片段外源DNADNA的克隆。的克隆。 外源基因插入到两个线状粘粒之间 噬菌体的噬菌体的A

41、 A蛋白蛋白切下切下COSCOS位点以外部位点以外部分，中间部分包装到分，中间部分包装到外壳蛋白中，组成成外壳蛋白中，组成成熟的噬菌体颗粒。熟的噬菌体颗粒。 重组子与噬菌体噬菌体DNADNA体外包装系混合体外包装系混合真核细胞用载体真核细胞用载体 n 真核细胞用作克隆基因的表达具有很多优点，如它能识别真核细胞用作克隆基因的表达具有很多优点，如它能识别和剪切外源基因中的内含子并加工成成熟的和剪切外源基因中的内含子并加工成成熟的mRNAmRNA，对表达的蛋对表达的蛋白质进行翻译后加工和修饰（如糖基化）等，这些都是原核细白质进行翻译后加工和修饰（如糖基化）等，这些都是原核细胞办不到的。胞办不到的。n

42、 目前所用的真核载体大多是所谓目前所用的真核载体大多是所谓穿梭载体穿梭载体（shuttle shuttle vectorvector），），它既含有原核细胞的复制原件，又含有真核细胞的它既含有原核细胞的复制原件，又含有真核细胞的复制原件，因此它既可以在原核细胞中复制扩增，也可以在真复制原件，因此它既可以在原核细胞中复制扩增，也可以在真核细胞中扩增、表达。由于在原核体系中基因工程的重组、扩核细胞中扩增、表达。由于在原核体系中基因工程的重组、扩增、测序等易于进行，所以利用穿梭载体，首先把要表达的基增、测序等易于进行，所以利用穿梭载体，首先把要表达的基因装配好后再转到真核细胞中表达，这为真核细胞基因

43、工程操因装配好后再转到真核细胞中表达，这为真核细胞基因工程操作提供了很大的方便。作提供了很大的方便。n 真核细胞载体又可分为真核细胞载体又可分为哺乳动物细胞载体哺乳动物细胞载体，酵母细胞载体酵母细胞载体和和昆虫细胞载体昆虫细胞载体。哺乳动物细胞载体通常是用能在真核细胞中。哺乳动物细胞载体通常是用能在真核细胞中复制的复制的DNADNA或或RNARNA病毒来构建，如腺病毒载体、逆转录病毒载体病毒来构建，如腺病毒载体、逆转录病毒载体等。等。人工染色体人工染色体 n 前面我们提到过用粘粒载体可以克隆长达前面我们提到过用粘粒载体可以克隆长达353545kb45kb的外的外源基因片段，但是还有许多基因过于

44、庞大，不能作为单一片源基因片段，但是还有许多基因过于庞大，不能作为单一片段克隆于这些载体中。段克隆于这些载体中。n 人类基因组、水稻基因组工程的工作需要能容纳更长人类基因组、水稻基因组工程的工作需要能容纳更长DNADNA片段的载体，这就使人们组建了一系列人工染色体来满足克片段的载体，这就使人们组建了一系列人工染色体来满足克隆更长外源隆更长外源DNADNA片段的需要。片段的需要。n 如如酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosomeyeast artificial chromosome，YACYAC），），这是由酵母染色体基因组的基本功能单位和这是由酵母染色

45、体基因组的基本功能单位和pBR322pBR322构构成的，能自我复制的线性克隆载体。另外还有成的，能自我复制的线性克隆载体。另外还有细菌人工染色细菌人工染色体体（bacterial artificial chromosomebacterial artificial chromosome，BACBAC），），以及还在以及还在研究之中的研究之中的哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体（mammalian artificial mammalian artificial chromosomechromosome，MACMAC）。）。三、目的基因的分离与合成三、目的基因的分离与合成n目的基因目的基因（ta

46、rget gene）又称又称外外源基因源基因，即我们所要研究的感兴趣，即我们所要研究的感兴趣的基因。从生物材料中制备出包含的基因。从生物材料中制备出包含有目的基因在内的有目的基因在内的DNA片段，往片段，往往是分子克隆最重要的一步。往是分子克隆最重要的一步。限制性内切酶直接分离获得限制性内切酶直接分离获得 n 直接分离法用于一些物理图谱（物理图谱直接分离法用于一些物理图谱（物理图谱是指标明限制性核酸内切酶在是指标明限制性核酸内切酶在DNADNA分子上的限分子上的限制位点数目、限制片段大小及其排列顺序的图制位点数目、限制片段大小及其排列顺序的图谱）已确立，背景资料比较清楚的谱）已确立，背景资料比

47、较清楚的原核生物基原核生物基因因的制备。的制备。n 从原核生物中提取纯化从原核生物中提取纯化DNADNA后，根据它的后，根据它的限制酶物理图谱进行基因定位，用适当的限制限制酶物理图谱进行基因定位，用适当的限制性内切酶将巨大的基因组性内切酶将巨大的基因组DNADNA分子切成多数片分子切成多数片段，然后进行分子克隆。段，然后进行分子克隆。 从基因组文库中筛选从基因组文库中筛选 n 分离组织或细胞分离组织或细胞染色体染色体DNADNA，利用限制性内切酶将染色体利用限制性内切酶将染色体DNADNA切割切割成基因水平的成基因水平的许多片段许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。，其中即含有我们感兴趣的

48、基因片段。n 将这些片段将这些片段随机地随机地同适合的同适合的克隆载体克隆载体拼接成重组拼接成重组DNADNA分子，继而分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNADNA分子的多个拷贝。分子的多个拷贝。n 不同细菌所包含的重组不同细菌所包含的重组DNADNA分子内可能存在不同的染色体片段，分子内可能存在不同的染色体片段，这样生长的这样生长的全部细菌全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组DNADNA的所有序列。的所有序列。n 与一般图书馆不同的是：基因组与一般图书馆不同的是：基因组DNADN

49、A文库没有图书目录，建立基文库没有图书目录，建立基因组文库后，需结合适当因组文库后，需结合适当筛选方法筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组基因的菌落，再进行扩增，将重组DNADNA分离、回收，以获得目的基因。分离、回收，以获得目的基因。 n 结合适当结合适当筛选方法筛选方法从众多从众多转化子菌落中选出含有某一基转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重因的菌落，再进行扩增，将重组组DNADNA分离、回收，以获得目分离、回收，以获得目的基因。的基因。 n 存在于转化细菌内，由存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因克隆载

50、体所携带的所有基因组组DNADNA的集合称的集合称基因组基因组DNA文文库库（genomic DNA librarygenomic DNA library）。）。如人的基因组文库包括了单如人的基因组文库包括了单倍体倍体2323条染色体中所有的条染色体中所有的DNADNA。基因组基因组DNADNA文库就像图书馆库文库就像图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。们感兴趣的基因。逆转录制备逆转录制备cDNAcDNA或从或从cDNAcDNA文库中筛选文库中筛选n 尽管同一生物体中不同组织细胞的基因组尽管同一生物体中不同组织

51、细胞的基因组是相同的，但各种类型细胞之间以及同一细胞是相同的，但各种类型细胞之间以及同一细胞在不同的发育时期所表达的基因是各不相同的。在不同的发育时期所表达的基因是各不相同的。n 大多数基因都会在相应的细胞中特异性地大多数基因都会在相应的细胞中特异性地转录，如网织红细胞阶段，有丰富的珠蛋白转录，如网织红细胞阶段，有丰富的珠蛋白mRNAmRNA。因此由这些高丰度因此由这些高丰度mRNAmRNA经过逆转录得到经过逆转录得到与与mRNAmRNA互补的互补的cDNAcDNA（complementary DNAcomplementary DNA，cDNAcDNA），），可直接进行克隆。可直接进行克隆。

52、对于低丰富对于低丰富mRNA的的cDNA克隆，通常是建成克隆，通常是建成cDNA文库文库（cDNA library）。）。即把细胞总即把细胞总mRNA通过逆转录合成总通过逆转录合成总cDNA，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物体种生物体全部全部cDNA集合集合。 它的特点是它只包括已经被转录成它的特点是它只包括已经被转录成mRNA的那些基因序的那些基因序列，且不包括内含子及调控序列，所以列，且不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的文库的复杂性复杂性要比基因组文库低的多要比基因组文库低的多。 但由于不同的但由于不同的细胞类型细胞类型

53、、发育阶段发育阶段以及以及细胞所处的特定细胞所处的特定状态状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类种类就不同，由此产生的就不同，由此产生的cDNA又是独特又是独特的。的。 与基因组与基因组DNA文库类似，由总文库类似，由总mRNA制作的制作的cDNA文库文库包含了细胞表达的各种包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣信息，自然也含有我们感兴趣的编码的编码cDNA。然后用适当的方法从然后用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的文库中筛选出目的cDNA。 cDNAcDNA文库文库cDNAcDNA文库构建过程文库构建过程化学合成法化学合

54、成法 n 如果已知某种基因的如果已知某种基因的核苷酸序列核苷酸序列，或根据，或根据某种基因产物的某种基因产物的氨基酸序列氨基酸序列推导出编码该多肽推导出编码该多肽链的核苷酸序列，再利用链的核苷酸序列，再利用DNADNA合成仪合成仪通过化学通过化学合成原理合成目的基因。合成原理合成目的基因。n 利用该法合成的基因有：人生长激素释放利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。 聚合酶链反应聚合酶链反应 n 聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerase chain reactionpolymerase chain reac

55、tion，PCRPCR）是一种体外快速的特定是一种体外快速的特定DNADNA片段扩增技术。片段扩增技术。PCRPCR技术。可以从一个细胞、一滴血液、一根毛发技术。可以从一个细胞、一滴血液、一根毛发中，经过中，经过3030次左右的循环扩增，使目的基因扩增上次左右的循环扩增，使目的基因扩增上百万倍。百万倍。n 应用时，常常在目的应用时，常常在目的基因基因5 5 端和端和3 3 端端分别设分别设计引物，引物中又分别引入合适的限制性内切酶切计引物，引物中又分别引入合适的限制性内切酶切位点，以带有位点，以带有目的基因的载体或细胞基因组目的基因的载体或细胞基因组DNADNA为为模板扩增模板扩增，限制性内切

56、酶酶切后，限制性内切酶酶切后，PCRPCR产物两端易产物两端易形成粘性末端而利于进一步克隆。形成粘性末端而利于进一步克隆。逆转录逆转录PCRPCR（reverse transcription PCRreverse transcription PCR，RTRTPCRPCR）技术，使得人们可以从技术，使得人们可以从mRNAmRNA入手，通过入手，通过逆转录得到逆转录得到 cDNAcDNA，在适当引物存在下，经在适当引物存在下，经PCRPCR扩增扩增目的基因。所得到的目的基因无内含子、无调控序目的基因。所得到的目的基因无内含子、无调控序列，而获得连续编码的序列。列，而获得连续编码的序列。 以上几种获

57、取目的基因的方法多用与编码序列以上几种获取目的基因的方法多用与编码序列已知的基因，目前人体已知基因只有已知的基因，目前人体已知基因只有1 11010左右，左右，所以获取大量未知基因则更为诱人和富于挑战性，所以获取大量未知基因则更为诱人和富于挑战性，所涉及的方法更多，如基因芯片技术、酵母双杂交所涉及的方法更多，如基因芯片技术、酵母双杂交技术以及噬菌体、细菌展示技术等等，这些都有待技术以及噬菌体、细菌展示技术等等，这些都有待我们去进一步学习和研究。我们去进一步学习和研究。四、四、DNA分子的体外连接分子的体外连接n 通过不同途径获取含目的基因的外源通过不同途径获取含目的基因的外源DNADNA，选择

58、或改建适当的克隆载体后，下一步工作选择或改建适当的克隆载体后，下一步工作是如何将外源是如何将外源DNADNA与载体与载体DNADNA连接在一起，即连接在一起，即DNADNA的体外重组。的体外重组。n 这种人工这种人工DNADNA重组是靠重组是靠DNADNA连接酶连接酶催化两催化两个双链个双链DNADNA片段相邻的片段相邻的5 5 端磷酸与端磷酸与3 3 端羟基端羟基之间形成磷酸二酯键。通常所用的连接酶是之间形成磷酸二酯键。通常所用的连接酶是T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶和和大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶。 质粒载体质粒载体 外源外源DNA 抗生素抗生素抗性基因抗性基

59、因EcoR I 含重组质含重组质粒的克隆粒的克隆转化进抗生素敏感转化进抗生素敏感的受体细胞的受体细胞涂布含抗生素的涂布含抗生素的琼脂平板琼脂平板连接连接 EcoR I 外源外源DNA 含抗生素的琼含抗生素的琼脂平板脂平板粘性末端连接碱性磷酸酶碱性磷酸酶处理载体分处理载体分子后连接子后连接 如果是构建表达型重组体，如果是构建表达型重组体，因为启动子启动转录以及转录因为启动子启动转录以及转录后翻译阅读都是有方向的，因后翻译阅读都是有方向的，因此插入的目的基因也应注意方此插入的目的基因也应注意方向。一般采用向。一般采用两种限制酶两种限制酶消化，消化，由于粘性末端不同，载体分子由于粘性末端不同，载体分

60、子和外源和外源DNADNA片段只能按一种方向片段只能按一种方向形成重组分子，实现形成重组分子，实现定向克隆定向克隆定向克隆定向克隆连接效果与载体和目的片段质量有关3：1 10l连接反应一般约4-5小时，室温，20度左右平端连接平端连接 n 因载体分子和目的因载体分子和目的DNADNA分子之间并不一定分子之间并不一定都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切成平端。有时所需用的两种限制性内切酶能切成平端。有时所需用的两种限制性内切酶切割后形成非互补的粘性末端，此时需设法使切割后形成非互补的粘性末端，此时需设法使之变成平端，如用之变成平端，如用S S1 1

61、核酸酶消化或用核酸酶消化或用KlenowKlenow片片段和段和dNTPdNTP补平补平3 3 端，成为平末端。端，成为平末端。n 平末端仍用平末端仍用T T4 4DNADNA连接酶连接，只是效率连接酶连接，只是效率低，需要的低，需要的DNADNA浓度更高。浓度更高。 人工接头连接人工接头连接 n 连接子（连接子（linkerlinker）是指人工合成的一段是指人工合成的一段双链寡核苷酸双链寡核苷酸，其中包含一个（或两个）其中包含一个（或两个）酶切位点酶切位点。首先将接头与目的。首先将接头与目的DNADNA片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶

62、将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。加插头连接加插头连接 n 插头（插头（adaptoradaptor，又叫又叫适配子适配子）与接头的区别在于）与接头的区别在于其一侧末端是一个粘性末端（内含限制性内切酶位其一侧末端是一个粘性末端（内含限制性内切酶位点），而另一侧为平末端，也可以是粘末端。将其与点），而另一侧为平末端，也可以是粘末端。将其与目的目的DNADNA片段进行平端或粘端连接后，即可直接与载体片段进行平端或粘端连接后，即可直接与载体连接。连接。通过通过PCRPCR获得粘末端获得粘末端 n PCRPCR技术的出现大大方便了基因的克隆。技

63、术的出现大大方便了基因的克隆。在进行在进行PCRPCR时，可根据载体上的克隆位点设时，可根据载体上的克隆位点设计计PCRPCR引物，使引物，使引物引物上带有与载体克隆位点上带有与载体克隆位点相匹配的相匹配的限制性内切酶识别序列限制性内切酶识别序列，通过，通过PCRPCR或或RTPCRRTPCR直接产生可用于重组的外源基因直接产生可用于重组的外源基因片段。片段。T-A克隆克隆TaqDNATaqDNA聚合酶扩增聚合酶扩增目的目的DNADNA同时，在其同时，在其末端加两个游离的末端加两个游离的“A”A”只要载体切口处人只要载体切口处人工加上游离的工加上游离的“T”T”，PCRPCR产物即可与载体产物

64、即可与载体连接。连接。五、重组五、重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞 n 目的基因与载体在体外重组后应导入受体细胞中才能扩增并目的基因与载体在体外重组后应导入受体细胞中才能扩增并进一步筛选。进一步筛选。转化转化（transformationtransformation）将质粒或以它为载体构建的重组分子）将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程。导入受体细胞的过程。感染感染（infectioninfection）以噬菌体粘性质粒和真核病毒作载体构建的）以噬菌体粘性质粒和真核病毒作载体构建的重组分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或嗜菌体颗粒，重组分子，在体外经过包装成具有感染

65、能力的病毒或嗜菌体颗粒，感染适当细胞并在细胞内扩增的过程。感染适当细胞并在细胞内扩增的过程。 还有一个易混淆的名称是还有一个易混淆的名称是转导转导（transductiontransduction），），它是指细它是指细菌基因被一个噬菌体从一个细菌转移到另一个细菌的过程。菌基因被一个噬菌体从一个细菌转移到另一个细菌的过程。转染转染（transfectiontransfection ）是由转化和感染两个词构成的新词，指）是由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源真核细胞主动摄取或被动导入外源DNADNA片段而获得新的表型的过片段而获得新的表型的过程。程。 n n 基因工程中

66、的受体细胞又叫宿主细胞，分为两类：基因工程中的受体细胞又叫宿主细胞，分为两类：原核细原核细胞胞（如大肠杆菌、枯草杆菌等）和（如大肠杆菌、枯草杆菌等）和真核细胞真核细胞（如酵母细胞、哺（如酵母细胞、哺乳动物细胞及昆虫细胞等）。乳动物细胞及昆虫细胞等）。n 1 1、容易接纳重组分子。、容易接纳重组分子。n 2 2、对载体的复制扩增无严格限制。、对载体的复制扩增无严格限制。n 3 3、不存在特异的内切酶降解外源、不存在特异的内切酶降解外源DNADNA。n 4 4、不对外源不对外源DNADNA进行修饰。进行修饰。n 5 5、还需、还需根据选用的载体及其所具备的筛选标记。根据选用的载体及其所具备的筛选标记。 如质粒如质粒pBR322pBR322用氨苄青霉素抗性基因（用氨苄青霉素抗性基因（AmpAmpr r）和四环素抗和四环素抗性基因（性基因（TetTetr r）作筛选标记，受体细胞则用对）作筛选标记，受体细胞则用对AmpAmp和和TetTet敏感的敏感的大肠杆菌大肠杆菌HB101HB101细胞。细胞。 将外源将外源DNADNA导入靶细胞的方法很多，应根据实验目的、受体导入靶细胞的方法很多，应根据