ELISA双抗夹心法检测抗原PPT学习教案

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1、会计学1ELISA双抗夹心法检测抗原双抗夹心法检测抗原第一页，编辑于星期六：八点 五十七分。 ELISA-测抗原（Ag）或抗体（Ab）三要素o抗原或抗体的固相化：已知的Ag/Ab结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；o抗原或抗体的酶标记：酶标Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；o底物显色：底物被酶催化成为有色产物定性和定量 放大免疫反应的信号第1页/共42页第二页，编辑于星期六：八点 五十七分。高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性， pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值基本特点第2页/共42页第三页，编辑于星期六：八点 五十七分。 抗体测定法

2、 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第3页/共42页第四页，编辑于星期六：八点 五十七分。 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第4页/共42页第五页，编辑于星期六：八点 五十七分。包被已知抗原与待测抗体孵育与酶标抗体孵育加入底物包被已知抗原第5页/共42页第六页，编辑于星期六：八点 五十七分。优点:只要变换包被抗原就可利用同一

3、酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法操作简单迅捷缺点： 可重复性差 通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断第6页/共42页第七页，编辑于星期六：八点 五十七分。 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第7页/共42页第八页，编辑于星期六：八点 五十七分。原理：待检抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合；待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。第8页/共42页第九页，编辑于星期六：八点 五十七分。优点：待检抗原只需要一个抗原决定簇，适

4、合小分子抗原，如，激素，药物等；操作步骤简单快捷，只需要一个保温洗涤过程缺点：酶标记抗体用量大；定量检测的灵敏度和重复性存在不足。第9页/共42页第十页，编辑于星期六：八点 五十七分。 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第10页/共42页第十一页，编辑于星期六：八点 五十七分。改良双抗夹心法双抗夹心法第11页/共42页第十二页，编辑于星期六：八点 五十七分。优点：待测抗原需要2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；由于增加了

5、一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建立此法；重复性较好；缺点： 操作复杂，费时费力第12页/共42页第十三页，编辑于星期六：八点 五十七分。 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第13页/共42页第十四页，编辑于星期六：八点 五十七分。第14页/共42页第十五页，编辑于星期六：八点 五十七分。BA-ELISA原理 BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上

6、，结合生物素(B，biotin)与亲和素(A，avidin)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素是动植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H；亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对生物素有非常高的亲和力；（链酶亲和素是从链霉菌中提取，对载体吸附性比前者低）亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂；结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。第15页/共42页第十六页，编辑于星期六：

7、八点 五十七分。小鼠INF-检测试剂盒的组成：Capture Ab：purified anti-mouse IFN-Detection Ab ：biotin-conjugate-anti-mouse IFN-Avidin-conjugate-HRP Standard：recombinant mouse IFN- （定量测定）Coating buffer5Assay diluent TMB solution待测样品- 经ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清第16页/共42页第十七页，编辑于星期六：八点 五十七分。ELISA 操作要点p样品的保存p试剂的准备p固相载体p包被p加样p孵育(温育）p洗涤

8、p显色和比色第17页/共42页第十八页，编辑于星期六：八点 五十七分。样本的制备与保存：血清样品和细胞培养上清：5天内测定，可以放置于4，超过一周，-80保存；ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清： 分别于活化后不同时间点收集培养的细胞，2000rpm，4离心分离上清，冰上放置，分装第18页/共42页第十九页，编辑于星期六：八点 五十七分。试剂的准备ELISA 中用的蒸馏水或者去离子水，包括用于配置coating buffer，稀释Assay buffer，洗涤的，应为新鲜的和高质量的；从冰箱中取出的试剂应该平衡至室温后使用；试剂最好现配先用第19页/共42页第二十页，编辑于星期六：八点 五十七

9、分。固相载体最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性能；国际上标准的是微量滴定板812的96孔板式；已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-8）干燥的条件下一般可以保存6个月。第20页/共42页第二十一页，编辑于星期六：八点 五十七分。包被定义：将抗原或者抗体固定在固相载体的过程称为包被；物理吸附：两者的疏水基团通过疏水键的作用抗体或者蛋白质抗原一般采用的碳酸盐缓冲液作为稀释液（即本次实验用的coating buffer）4-8包被过夜(有利于蛋白活性的保持），与37孵育2小时被认为具有相等的包被效果包被的最适当浓度随着载体和包被物的性质和酶结合物的浓度调定第21页/共42页第二十二页，编

10、辑于星期六：八点 五十七分。封闭定义：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程；目的：抗原或抗体包被时所用的浓度比较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量的不相关蛋白质填充这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附；常用封闭液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脱脂奶粉； 本实验用封闭液：1Assay buffer。第22页/共42页第二十三页，编辑于星期六：八点 五十七分。加样ELISA中一般有3次加样步骤，即，加样本（和/或标准品），加酶结合物，加底物；加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以溅出,不可以

11、产生气泡；多道加液器的使用第23页/共42页第二十四页，编辑于星期六：八点 五十七分。孵育(温育）在ELISA中抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温的过程称为孵育；常用温度：43，37，室温，4等孵育时为了避免蒸发，可以用塑料封口胶或者保鲜膜封板第24页/共42页第二十五页，编辑于星期六：八点 五十七分。洗涤 洗涤在ELISA中虽然不是一个反应步骤，但决定了实验的成败聚苯乙烯等塑料对蛋白的吸附是普遍的，洗涤可以清除在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质洗涤可以清除残留在板孔中没有能够与固相抗原或者抗体结合的物质常加入非离子表面活性剂（含有疏水基团+亲水基团），以抑制蛋白质吸

12、附于塑料表面，如吐温20，0.05%的浓度比较合适，浓度2%会洗脱包被在板上的抗原或者抗体第25页/共42页第二十六页，编辑于星期六：八点 五十七分。洗涤方式：甩干孔内的反应液浸泡，即将洗涤液注满板孔(约300l），静置3min，浸泡时间不可以随意缩短；甩去液体后在吸水纸上拍干重复操作2，3，洗涤次数按要求操作第26页/共42页第二十七页，编辑于星期六：八点 五十七分。显色和比色 显色是ELISA中的最后一步孵育反应，此时，酶催化无色的底物生成有色的产物；定量实验中，加入底物后的反应温度和时间应该按规定力求准确；定性测定的显色时间一般不需要严格控制和及时判断；终止反应，防止反应过度： TMB受

13、光照影响不大，经HRP作用后，40min达到高峰；终止液有多种，叠氮钠或SDS等酶抑制剂可以维持蓝色12-24h不褪色； OPD受光照会自行变色，要避光，经HRP作用后，37孵育20-30min后颜色即不再加深；常用终止液为2M H2S04； 第27页/共42页第二十八页，编辑于星期六：八点 五十七分。与HRP反应后的颜色加终止液后的颜色读数波长特 点OPD临苯二胺492nm致畸，但本底好TMB四甲基联苯胺450nm操作方便，本底较高第28页/共42页第二十九页，编辑于星期六：八点 五十七分。ELISA 数据的处理根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程将所测定样品的OD值代入方

14、程计算出相应的样品的浓度第29页/共42页第三十页，编辑于星期六：八点 五十七分。 包被：用Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab ，100ul/孔，湿盒4过夜； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，33min，控干； 封闭：加1Assay diluent 200ul/孔，37避光孵育2h； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，43min，控干；5. 加样：100ul/孔，37避光孵育1h ；6. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，43min，控干；7. Biotin-Detection Ab: 用1Assay diluent 1:1000 稀释detection Ab

15、 ，100ul/孔， 37避光孵育1h；8. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，43min，控干；9. Avidin-HRP: 用1Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ，100ul/孔， 37避光孵育45min；10. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，53min，控干；11. 显色：1TMB solution，100ul/孔，37孵育1-30min；12. 终止反应：显色完全后加 2M H2SO4 50ul/孔，终止显色反应； 于450nm处读取光密度OD值或吸光度A值；13. 绘制标准曲线，分析数据第30页/共42页第三十一页，编辑于星期六：八点 五十七分。2.洗涤 次

16、日，弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板3次（将PBST加入每孔，静置3min 后倾去），控干，洗去游离抗体。湿盒中，4过夜酶标板1.包被(Note PBST洗涤液:0.05% Tween-20 -PH 7.4 1PBS) 1Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab ， 100l/孔加入到酶标板中，封口膜(或保鲜膜等）封闭酶标板后，放入湿盒中，4过夜。 第31页/共42页第三十二页，编辑于星期六：八点 五十七分。4.洗涤 弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板4次，（将PBST加入每孔，静置3min 后倾去）；控干；37避光孵育2h3.封闭（Note 1Assay

17、diluent：用纯水将5Assay diluent 稀释至1） 以上助教老师负责完成第32页/共42页第三十三页，编辑于星期六：八点 五十七分。37避光孵育1h50ulStandard原液 1/8 1/16 1/32第33页/共42页第三十四页，编辑于星期六：八点 五十七分。待测抗原100l空白对照阳性对照每组4位同学的加样顺序：待测抗原100l待测抗原100l样本有4种，每人选一种做复孔每组做阳参2个孔每组做空白对照2个孔（加样1Assay buffer）每孔加样100l待测抗原100l第34页/共42页第三十五页，编辑于星期六：八点 五十七分。6. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，43

18、min，控干；7.Biotin-Detection Ab: 用1Assay diluent 1:1000稀释detection Ab ，100l/孔，37避光孵育1h；8. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，43min，控干；9. Avidin-HRP(HRP见光分解，之后所有步骤避光操作） 用1Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ，100l/孔， 37避光孵育45min；10. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，53min，控干；第35页/共42页第三十六页，编辑于星期六：八点 五十七分。11. 显色： 1TMB solution，100l/孔，37孵育1-30min；

19、12. 终止反应： 显色完全后加 2M H2SO4 50l/孔，终止显色反应;450nm处读取光密度0D值（或者吸光度A值）13. 绘制标准曲线，分析数据第36页/共42页第三十七页，编辑于星期六：八点 五十七分。n定性实验显色反应后，如液体颜色变成蓝色则为阳性；仍为无色液体，则待测样品为阴性第37页/共42页第三十八页，编辑于星期六：八点 五十七分。n定量实验 1. 标准品和待测样品的OD450值减去空白孔的OD450值 2. 绘制标准曲线，计算出待测样品浓度 根据绘制的标准曲线以及待测样品的OD450值可计算出待测样品中IFN-含量；实验报告结果分析要求：绘制标准曲线，计算出待测样品浓度？

20、标准品（原液）浓度为2000pg/ml第38页/共42页第三十九页，编辑于星期六：八点 五十七分。读板结果我通过EXCELL上传到公用邮箱，请大家记住自己的样本所在的编号，以方便查询第39页/共42页第四十页，编辑于星期六：八点 五十七分。注意事项u加样：悬空加样，Tips不可以接触酶标板，及时更换Tips;将所加物加在ELISA板孔的底部，并注意不可溅出，不可产生气泡。u洗板：每次洗液加入后，应静置3分min使清洗更加彻底。末次洗板尽量将水甩干。u液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。u底物有毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，尽量避免接触。第40页/共42页第四十一页，编辑于星期六：八点 五十七分。Thanks for your attention!第41页/共42页第四十二页，编辑于星期六：八点 五十七分。