蛋白质的分离和纯化学习教案

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1、会计学1蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化第一页，编辑于星期三：点 四十五分。一、蛋白质的分离一、蛋白质的分离根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和大分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的蛋的蛋白质。白质。Q:Q:下列蛋白质如何提取？下列蛋白质如何提取？酸性蛋白质；酸性蛋白质； 水溶性蛋白质；水溶性蛋白质； 脂溶性蛋白质；脂溶性蛋白质； 偏偏碱性溶液碱性溶液 透析液（中性缓冲液）透析液（中性缓冲液） 有机溶剂有

2、机溶剂原理原理 1.1.根据细胞的结构特点，选择不同的破碎细胞根据细胞的结构特点，选择不同的破碎细胞的方法（的方法（如研磨法、超声波法、酶解法等如研磨法、超声波法、酶解法等），使各），使各种蛋白质释放出来。种蛋白质释放出来。第1页/共42页第二页，编辑于星期三：点 四十五分。1.1.抽提方法：抽提方法：（1 1）酸性蛋白质）酸性蛋白质： （2 2）水溶性蛋白质）水溶性蛋白质： （3 3）脂溶性蛋白质）脂溶性蛋白质：第2页/共42页第三页，编辑于星期三：点 四十五分。降降法法2.薄膜薄膜透析法透析法第3页/共42页第四页，编辑于星期三：点 四十五分。 1 1. .离心沉降法离心沉降法 原理：通过

3、控制原理：通过控制离心速离心速率率，使得，使得分子大小、分子大小、密度不同密度不同的的物质物质发生发生分层沉降，从而分层沉降，从而分离出分离出不同种类蛋白质不同种类蛋白质。离心时相对分子质量离心时相对分子质量大大的物的物质先沉淀。质先沉淀。第4页/共42页第五页，编辑于星期三：点 四十五分。第5页/共42页第六页，编辑于星期三：点 四十五分。 小分子杂质（无机盐、单糖、二糖及小分子杂质（无机盐、单糖、二糖及氨基酸等）从透析袋中出来，而蛋白氨基酸等）从透析袋中出来，而蛋白质留在袋内。质留在袋内。第6页/共42页第七页，编辑于星期三：点 四十五分。（1 1）透析法）透析法第7页/共42页第八页，编

4、辑于星期三：点 四十五分。(1)(1)凝胶：凝胶：由多糖类由多糖类化合物（如葡聚糖、琼脂糖）化合物（如葡聚糖、琼脂糖）构成构成的的多多孔球体孔球体，内含许多贯穿的通道内含许多贯穿的通道(2)原理：原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。胶颗粒内部，路程长，流动慢。( (3 3) )作用作用：使样品中使样品中分子大小不同分子大小不同的蛋白的蛋白质按顺序分离出来质按顺序分离出来第8页/共42页第九页，编辑于星期三：点 四十五分。下图中最早洗脱下来的是什么？为什么？下图中最早洗脱下来

5、的是什么？为什么？第9页/共42页第十页，编辑于星期三：点 四十五分。第10页/共42页第十一页，编辑于星期三：点 四十五分。D第11页/共42页第十二页，编辑于星期三：点 四十五分。B第12页/共42页第十三页，编辑于星期三：点 四十五分。 (1) (1)概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 方向：向着与其所带电荷相反的电极移动。方向：向着与其所带电荷相反的电极移动。 (2) (2)泳动速度和方向：泳动速度和方向： 速度：速度：带电分子的迁移速度跟各种带电分子的迁移速度跟各种分子带电性质分子带电性质的的差异以及分子本身的差异以及分子本身的大小大小

6、, ,形状形状有关。有关。 一般来说，一般来说，带电颗粒带电颗粒所带净电荷越多所带净电荷越多，直直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。度越快；反之，则越慢。 电泳分离时，电荷量相差越大的物质相距越远。电泳分离时，电荷量相差越大的物质相距越远。第13页/共42页第十四页，编辑于星期三：点 四十五分。醋酸纤维醋酸纤维薄膜电泳薄膜电泳琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳SDSSDS聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳：测定蛋白质相对分子质量。凝胶电泳：测定蛋白质相对分子质量。 SDSSDS能使蛋白质完全变性，能使蛋白质完全变性，SDSSDS所带电荷大

7、大超过了蛋白所带电荷大大超过了蛋白质原有电荷。质原有电荷。 迁移率取决于分子大小迁移率取决于分子大小。(3)(3)类型（载体）类型（载体）: :第14页/共42页第十五页，编辑于星期三：点 四十五分。使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异第15页/共42页第十六页，编辑于星期三：点 四十五分。D第16页/共42页第十七页，编辑于星期三：点 四十五分。第17页/共42页第十八页，编

8、辑于星期三：点 四十五分。第18页/共42页第十九页，编辑于星期三：点 四十五分。第19页/共42页第二十页，编辑于星期三：点 四十五分。B第20页/共42页第二十一页，编辑于星期三：点 四十五分。A第21页/共42页第二十二页，编辑于星期三：点 四十五分。A第22页/共42页第二十三页，编辑于星期三：点 四十五分。（3）分离血红蛋白溶液）分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液将搅拌好的混合溶液中速长时中速长时离心离心后，试管中的溶液分为后，试管中的溶液分为4层。层。 第一层为无色透明的第一层为无色透明的甲苯层甲苯层， 第二层为第二层为脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层， 第三层是第三层是血红

9、蛋白的水溶液血红蛋白的水溶液， 第四层是其他杂质的暗红色沉第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于层，于分液漏斗分液漏斗中静置片刻后，分出下层的中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。红色透明液体。第23页/共42页第二十四页，编辑于星期三：点 四十五分。有机溶剂有机溶剂 （无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质 （白色白色脂溶性物质沉淀层）脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 （红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）第24页/共42页第二

10、十五页，编辑于星期三：点 四十五分。 取取1mL1mL的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将透析袋放入中，将透析袋放入盛有盛有300mL300mL的物的物质的量的浓度为质的量的浓度为20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（PH=7PH=7）中中，透析，透析12h12h。透析可以。透析可以去除样品中分子量较小去除样品中分子量较小的杂质的杂质，或用于更换样品的缓冲液。或用于更换样品的缓冲液。【注】缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液【注】缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pHpH的的影响而保持影响而保持pHpH稳定。稳定。 使用使用PH=7PH=7的磷酸缓冲液，有利于维

11、持血红蛋白的磷酸缓冲液，有利于维持血红蛋白的正常特性。的正常特性。薄膜薄膜透析透析法法第25页/共42页第二十六页，编辑于星期三：点 四十五分。D第26页/共42页第二十七页，编辑于星期三：点 四十五分。子质量较小的杂质子质量较小的杂质D第27页/共42页第二十八页，编辑于星期三：点 四十五分。第28页/共42页第二十九页，编辑于星期三：点 四十五分。凝胶的前处理凝胶的前处理配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量计算并称取一定量的的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝后，配成凝胶悬浮液。胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法A A

12、、固定：将色谱柱装置、固定：将色谱柱装置固定在支架上。固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。 2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效降低分离效果。果。第29页/共42页第三十页，编辑于星期三：点 四十五分。装填完毕后，立装填

13、完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的磷的磷酸缓冲液（酸缓冲液（pHpH为）充分洗涤为）充分洗涤平衡平衡1212小时。小时。1 1、液面不要低于凝胶液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。生物大分子物质的分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干不能发生洗脱液流干，露出凝胶露出凝胶颗粒的现象颗粒的现象。第30页/共42页第三十一页，编辑于星期三：点 四十五分。样品加入与洗脱样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面

14、：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样贴着管壁环绕移动加样，同时注，同时注意意不要破坏凝胶面。不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0

15、的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 第31页/共42页第三十二页，编辑于星期三：点 四十五分。A第32页/共42页第三十三页，编辑于星期三：点 四十五分。样品加到色谱柱

16、的顶端，不要破样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面坏凝胶面A第33页/共42页第三十四页，编辑于星期三：点 四十五分。第34页/共42页第三十五页，编辑于星期三：点 四十五分。蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白包括洗涤红细胞；血红蛋白释释放放；分离分离血红蛋白溶液。血红蛋白溶液。（2）粗分离：）粗分离：薄膜薄膜透析透析法法除去分子较小的杂质除去分子较小的杂质。（3）纯化：）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。定。（以血红蛋白的分离纯化为例（以血红蛋白的分离纯化为例）三、蛋白质提取分离的程序三、蛋白质提取分离的程序第35页/共42页第三十六页，编辑于星期三：点 四十五分。A第36页/共42页第三十七页，编辑于星期三：点 四十五分。C第37页/共42页第三十八页，编辑于星期三：点 四十五分。C第38页/共42页第三十九页，编辑于星期三：点 四十五分。D第39页/共42页第四十页，编辑于星期三：点 四十五分。A第40页/共42页第四十一页，编辑于星期三：点 四十五分。D第41页/共42页第四十二页，编辑于星期三：点 四十五分。