第七章分子荧光法

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1、第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecularluminescenee,以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，燐光分析法和化学发光分析法。荧光分析法历史悠久。早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes

2、，就发现含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色，但未能解释这种荧光现象。直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语，他还论述了Stokes位移定律和荧光猝灭现象。到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。近十几年来，由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入，大大推动了荧光分析理论的进步，促进了诸如同步荧光测定

3、、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展，加速了各种新型荧光分析仪器的问世，进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性，解决了生产和科研中的不少难题。目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。第二节分子荧光分析法的基本原理一、荧光（燐光）光谱的产生物质受光照射时，光子的能量在一定条件下被物质的基态分子所吸收，分子中的价电子发生能级跃迁而处于电子激发态，在光致激发和

4、去激发光过程中，分子中的价电子可以处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述。一个所有电子自旋都配对的分子的电子态，称为单重态，用“S”表示；分子中的电子对的电子自旋平行的电子态，称为三重态,用“T”表示。电子自旋状态的多重态用2S+1表示，S是分子中电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对时，即S=0,多重态2S+1=1，该分子体系便处于单重态。大多数有机物分子的基态是处于单重态的，该状态用“S0”表示。倘若分子吸收能量后，电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个

5、自旋平行（不配对）的电子，即S=1，多重态2S+仁3,该分子体系便处于激态三重态。符号So、Si、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子激发单重态；Ti和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程丧失多余的能量而返回基态。辐射跃迁的去活化过程，发生光子的发射，伴随着荧光或燐光现象；无辐射跃迁的去活化过程是以热的形式辐射其多余的能量，包括内转化（ic），系间窜跃（isc）、振动弛豫（Vr）及外部转移（ec）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。假设处于基态单重态中的电

6、子吸收波长为入1和入2的辐射光之后，分别激发至第二激发单重态S2及第一激发单重态Si，图9-1示意了分子内所发生的各种光物理过程。振动弛豫它是指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式放出。发生振动弛豫的时间为1012s数量级。图9-1中各振动能级间的小箭头表示振动弛豫的情况。内转移当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低能级。图91所示，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。荧光发射处于第一激发单重态最低振动能级的电子跃回至基态各振动能级时，所产生的光辐射称为荧光发

7、射，将得到最大波长为入3的荧光。注意基态中也有振动弛豫跃迁。很明显，入3的波长较激发波长入1或入2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长入3的荧光。荧光的产生在106109S内完成。系间窜跃指不同多重态间的无辐射跃迁。如：S1T1。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移到T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1S1,然后由S1发生荧光，即产生延迟荧光。燐光发射电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动弛豫，转至其最低振动能级，由此激发态

8、跃回至基态时，便发射燐光。这个跃迁过程（T1S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10_410s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间外部转移指激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或燐光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。二、激发光谱曲线和荧光光谱曲线任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱：激发光谱和发射光谱。荧光激发光谱（或称激发光谱），就是通过测量荧光体的发光强度随激发光波长的变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。激发光谱的具体测绘办法，是通过扫描激发单色器以使不同波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光

9、通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，由检测器检测相应的荧光强度，最后通过记录仪记录荧光强对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。从理论上说，同一物质的最大激发波长应与最大吸收波长一致，这是因为物质吸收具有特定能量的光而激发，吸收强度高的波长正是激发作用强的波长。因此，荧光的强弱与吸收光的强弱相对应，激发光谱与吸收光谱的形状应相同，但由于荧光测量仪器的特性，例如光源的能量分布、单色器的透射和检测器的响应等特性都随波长而改变，使实际测量的荧光激发光谱与吸收光谱不完全一致。只有对上述仪器因素进行校正之后而获得的激发光谱，即通常所说的“校正的激发光谱”（或“真实的激发光谱”）才与吸收光谱非常近似。

10、如使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得到的谱图称为荧光发射光谱（简称荧光光谱）。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。荧光光谱可供鉴别荧光物质，并作为在荧光测定时选择适当的测定波长或滤光片的根据。和激发光谱的情况类似，在一般的荧光测定仪器上所测绘的荧光光谱，属“表现”的荧光光谱，只有对光源、单色器和检测器等元件的光谱特性加以校正以后，才能获得“校正”（或“真实”）的荧光光谱。溶液荧光光谱通常具有如下特征：1、斯托克斯位移斯托克期在18

11、52年首次观察到荧光波长总是大于激发光波长，这种波长移动的现象称为斯托克斯位移。2、荧光发射光谱的形状与激发光波长无关分子的电子吸收光谱可能含有几个吸收带，而其荧光光谱却只含一个发射带。激发光波长改变，可能将分子激发到高于Si的电子能级，但很快经过内转移和振动弛豫跃迁到Si态的最低振动能级，然后产生荧光。由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与荧光体被激发到哪一个电子态无关，所以荧光光谱的形状通常与激发光波长无关。3、荧光光谱与吸收光谱的镜像关系基态分子通常处于最低振动能，受激时可以跃迁到不同的电子激发态，会产生多个吸收带，其中第一吸收带的形成是由于基态分子被激发到第一电子激发单重

12、态的各不同振动能级所引起的，因而第一吸收带的形状与的形状与第一电子激发单重态中振动能级的分布情况有关；荧光光谱的形成是激发分子从第一电子激发单重态的最低振动能级辐射跃迁至基态的各个不同振动能级所引起的，所以荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布情况（即能量间隔情况）有关。一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振动能级的分布情况是相似的，且荧光带的强弱与吸收带强弱相对应，因此，荧光光谱和吸收光谱的形状相似。另外，在第一吸收带中，Si态的振动能级越高，与So态间的能量差越大，吸收峰的波长越短；相反，荧光光谱中So态的振动能级越高，与Si态间的能量差越小，发射荧光的波长越长。所以，荧光光谱和吸收光谱的

13、形状虽相似，却呈镜像对称关系。图92是蒽分子的吸收光谱和荧光光谱。不同的荧光物质结构不同，So与Si态间的能量差不一样，基态中各振动能级的分布情况也不一样，所以有着不同形状的荧光光谱，据此可以进行定性分析。三、荧光的影响因素1、荧光的影响因素荧光量子产率（），定义为荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值，即半_发射的光子数i吸收的光子数或发射荧光的分子数旦一激发分子总数荧光量子产率有时也叫荧光效率，:反映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质的荧光越强。前面已经提到，在产生荧光过程中，涉及到辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量

14、子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。若用数学式来表达这些关系，得到kfkfZKi式中kf为荧光发射过程的速度常数，xKi为其它有关过程的速率常数的总和。显然，凡是能使kf值升高而使其它k值降低的因素，都可增强荧光。假如非辐射跃迁的速度远小于辐射跃迁的速度，即xKikf，荧光量子产率的数值便接近于1。在通常情况下，的数值总是小于1。不发荧光的物质，其荧光量子产率的数值为零或非常接近于零。一般说来，kf主要取决于化学结构，而aKi则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。2、荧光与化合物结构的关系了解荧光与分子结构的关系，可以预示分子能否发光，在什么条件下发光，以及发射的荧光将具有什么特征

15、，以便更好地运用荧光分析技术，把非荧光体变为荧光体，把弱荧光体变为强荧光体。但由于至今对激发态分子的性质了解不深，还无法对荧光与分子结构之间的关系进行定量描述。（1）有机物的荧光 共轭效应具有共轭双键体系的芳环或杂环化合物，其电子共轭程度越大，越容易产生荧光；环越多，发光峰红移程度越大，发光也往往越强。如表91所示，苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区，丁省位绿区，戊省位于红区，且均比苯的量子产率高。表9-1几种多环芳烃的荧光化合物半F入e/hem(nm)苯00.11205/278o0.29286/321o0.46365/400丁省c)0.60390/480戊心、10.52580/640同一共轭

16、环数的芳族化合物，线性环结构的荧光波长比非线性者要长。例如：蒽和菲的荧光波长分别为400nm和350nm；丁省和苯a蒽的荧光峰分别为480nm和380nm。 刚性结构和共平面效应一般说来，荧光物质的刚性和共平面性增强，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小，即使外转移能量损失减小，从而有利于荧光的发射。例如：芴与联二苯的荧光效率分别约为1.0和0.2。这主要是由于亚甲基使芴的刚性和共平面性增大的缘故。芴联二苯CH2如果分子内取代基之间形成氢键，加强了分子的刚性结构，其荧光强度将增强。例如:如果分子内取代基之间形成氢键，加强了分子的刚性结构，其荧光强度将增强。例如:水杨酸的水溶液，由于分子内

17、氢键的生成，其荧光强度比对（或间）oH羟基苯甲酸大。某些荧光体的立体异构现象对它的荧光强度也有显著影响，例如:1.2一二苯乙烯CCHCCHH其分子结构为反式者，分子空间处于同一平面，顺式者则不处于同一平面，因而反式者呈强荧光，顺式者不发荧光。 取代基的类型和位置取代基对荧光体的影响分为加强荧光的、减弱荧光的和影响不明显的三种类型。力口强荧光的取代基有一OH，OR，NH2，CN，NHR，NR2，OCH3，OC2H5等给电子取代基，由于它们n电子的电子云几乎与芳环上的n轨道平行，因而共享了共轭n电子结构，同时扩大了共轭双键体系。这类荧光体的跃迁特性接近于nfn跃迁，而不同于一般的nfn跃迁。减弱荧

18、光的有C=O，COOH，COr，C0，NO2,NO,SH等得电子取代基，它们n电子的电子云并不与芳环上n电子共平面。另外，减弱荧光的还有卤素取代，芳烃被F、Cl、Br、和I原子取代之后，使系间窜越加强，其荧光强度随卤素原子量的增加而减弱，燐光相应加强，这种效应称为重原子效应。双取代和多取代基的影响较难预测，取代基之间如果能形成氢键增加分子的平面性，则荧光增强。影响不明显的取代基有一NH3+，R，SQH等。除一CN夕卜，取代基的位置对芳烃荧光的影响通常为：邻、对位取代增强荧光，间位取代减弱荧光，且随着共轭体系的增大，影响相应减小。一CN取代的芳烃一般都有荧光。 电子跃迁类型含有氮、氧、硫杂原子的

19、有机物，如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的n电子，电子跃迁多为nn*型，系间窜越强烈，荧光很弱或不发荧光，易与溶剂生成氢键或质子化，从而强烈地影响它们的发光特征收。不含氮、氧、硫杂原子的有机荧光体多发生nfn类型的跃迁，这是电子自旋允许的跃迁，摩尔吸收系数大（约为104），荧光辐射强。（2）金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯事物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定。 螯合物中配位体的发光不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子不处于同一平面，因而不发

20、生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构增大，常会发出荧光。例如：2,2二羟基偶氮苯本身不发生荧光，但与Al3+形成反磁性的螯合物后，便能发出荧光：Al又如8羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。这也是由于刚性和其共平面性增加所致。一般说来，能产生这类荧光的金属具有硬酸型结构，如Be、Mg、Al、Zr、Th等。 螯合物中金属离子的特征荧光这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的nn*跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，导致dd*或ff*跃迁，最终发射的是dd跃迁或ff跃迁光谱。例如：三价铬具有d3结构，它与乙二胺等形成螯合物后，将最终产

21、生是dd跃迁发光。二价锰具有d5结构，它与8羟基喹啉一5磺酸形成螯合物后，也将产生dd跃迁发光。3、溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都可能会有显著的差别。溶剂对荧光强度的影响比较复杂，一般来说，增大溶剂的极性，将使nn*跃迁的能量增大，nn*跃迁的能量降低，从而导致荧光增强。在含有重原子溶剂如磺乙烷和四溴化碳中，也是由于重原子效应，增加系间窜跃速度，使荧光减弱。4、荧光的熄灭荧光熄灭（fluoresceneequenching,或称荧光猝灭），广义地说，指任何可使某种荧光物质的荧光强度下降的作用或任何可使荧光量子产率降低的作用。狭义地说，荧光熄灭指荧光物质分子与溶剂

22、分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。下面讨论导致荧光熄灭作用的几种主要类型。碰撞熄灭碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。它是指处于激发单重态的荧光分子M与熄灭剂Q发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。这一过程可用下列反应式表示：相对速率M+fhiM*（激发）一M*M+fh2（发生荧光）kiM*M*+QM+Q+热（熄灭）k2M*Q式中ki、k2为相应的反应速率常数。很明显，荧光熄灭程度取决ki和k2的相对大小及熄灭剂的浓度。碰撞熄灭还与溶液的粘度有关。在粘度大的溶剂中，熄灭作用较小。另外，碰撞熄灭随温度升高而增加。 能

23、量转移这种熄灭作用产生于熄灭剂与处于激发单重态的荧光分子作用后，发生能量转移，使熄灭剂得到激发，其反应如下：*M+QM+Q（激发）如果溶液中熄灭剂浓度足够大，可能引起荧光物质的荧光光谱发生畸变和造成荧光强度测定的误差。 电荷转移这种熄灭作用产生于熄灭剂与处于激发态分子间发生电荷转移而引起的。由于激发态分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，因此，荧光物质的激发态分子比其基态分子更容易与其它物质的分子发生电荷转移作用。如甲基蓝分子（以M表示）可被Fe2+离子熄灭。2+3+M*+Fe2+M+Fe3+所生成的M离子进一步发生下列反应而成为无色染料M+H+MH（半醌）2MHM+MH2（无色染料） 转

24、入三重态熄灭由于内部能量转移，发生由激发单重态到三重态的系间窜跃，多余的振动能在碰撞中损失掉而使荧光熄灭。如二苯甲酮，其最低激发单重态是（n,n*）态，由于nn*跃迁是部分禁阻的，因而n*n跃迁也是部分禁阻的，处于（n,n*）态的最低激发单重态的寿命要比处于（n，n*）态的长，从而转化为三重态的几率也就比较大。此外,（n，n*）态的Si和Ti之间的能量间隙通常比较小，有利于加速SiTi系间窜跃过程的速度。 光化学反应熄灭由光致激发态分子所发生的化学反应称为光化学反应，它可以是单分子也可以是双分子反应。荧光分析中因发生光化学反应导致熄灭现象经常遇到，其中，影响较大的是光解反应和光氧化还原反应。某

25、些光敏物质在紫外或可见光照射下很容易发生预离解跃迁，（分子在接受能量跃迁过程中，使某些键能低于电子激发能的化学键发生断裂的这种跃迁）表现在荧光测定过程中荧光强度随光照时间而减弱。 自熄灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发生自熄灭现象，使荧光强度降低。这可能是由于激发态分子之间的碰撞引起能量损失。当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被溶液中处于基态的分子吸收，称为自吸收。四、荧光强度与荧光物质浓度的关系假如以每秒钟每平方厘米的光强度为I0的入射光，照射到一个吸光截面积为A的盛有荧光物质的液池，荧光强度为F（图9-3）。设在dx薄层所吸收的光能量为dl，发射的荧光强度为dF,则dF

26、=Kdl（9-1）被dx薄层所吸收的能量为dl,dI=IoI=Aloe皿-Aloec(x-dx)=Aloecx（1_exac）（9-2）因为dx、ac数值很小，所以dl=AloaceEdx（9-3）将式（9-3）代入式（9-1），得dF二KAloacecxdx（9-4）求液池中溶液的荧光强度时，应对整个液池长度b进行积分，即F二AKIoac:ecxdx二AKII-ebc=AKloabc-(abc)2(abc)32!3!=AKloabc1-亟（abc）_（9-5）26若abc0.05,即对很稀的溶液，每平方厘米截面积上的荧光强度为，F二Kloabc（9-6）以摩尔吸收系数Ko代替吸收系数a，Io

27、g10代表loge标度，采用荧光量子产率代替荧光比率K，上式可改写为，F=23loKobc（9-7）当Io一定时，F=KC（9-8）由此可见，在低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系。当溶液浓度升高时，由于自熄灭和自吸收等原因，使荧光强度与分子浓度不呈线性关系，而产生如图9-4所示的曲线弯曲，随着液槽厚度的增加，弯曲情况发生在更低的浓度处。第三节荧光分析仪器荧光分析使用的仪器可分为荧光计和荧光分光光度计二种类型。它们通常均由光源、单色器（滤光片或光栅）、液槽及检测器组成。图9-5为荧光分光光度计示意图。由光源发出的激发光，经过第一单色器（激发光单色器），选择最佳波长的光去激发样品池内的荧光物

28、质。荧光物质被激发后，将向四面八方发射荧光。但为了消除激发光及散射光的影响，荧光的测量不能直接对着激发光源，所以，荧光检测器通常是放在与激发光呈直角的方向上。否则，强烈的激发余光会透过液池干扰荧光的测定，甚至会损坏检测器。第二单色器（荧光单色器）的作用是消除荧光液池的反射光、瑞利散射光，拉曼散射光（见第四节）以及其它物质所产生的荧光的干扰，以便使待测物质的特征性荧光照射到检测器上进行光电信号转换，所得到的电信号，经放大后由记录仪记录下来。1、光源光源应具有强度大，适应波长范围宽两个特点。常用光源有高压汞灯和氙弧灯。高压汞灯的平均寿命约为15003000h,荧光分析中常用的是365、405、43

29、6nm三条谱线。氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强度大，可用于200700nm波长范围。在300400nm波段内,光谱强度几乎相等。此外，高功率连续可调染料激光光源是一种新型荧光激发光源。激发光源的单色性好，强度大。脉冲激光的光照时间短，并可避免感光物质的分解。2、单色器简易的荧光计一般采用滤光片作单色器，由第一滤光片分离出所需要的激发光，用第二滤光片滤去杂散光和杂质所发射的荧光。但这种仪器只能用于荧光强度的定量测定，不能给出荧光的激发与发射光谱。荧光分光光度计最常用的单色器是光栅单色器，它具有较高的分辨率，能扫描光谱；缺点是杂散光较大，有不同的次级谱线干扰，但可用合适的前置滤光片加以消除。

30、3、样品池样品池通常是石英材料的方形池，四个面都透光。放入池架中时，要用手拿着棱并规定一个插放方向，免得各透光面被指痕污染或被固定簧片擦坏。4、狭缝狭缝越小单色性越好，但光强度和灵敏度下降。当入射狭缝和出射狭缝的宽度相等时，单色器射出的单色光有75%的能量是辐射在有效的带宽内。此时，既有好的分辨率，又保证了光通量。5、检测器简易的荧光计可采用目视或硒光电池检测。但一般较精密的荧光分光光度计均采用光电倍增管检测。施加于光电倍增管的电压越高，放大倍数越大，电压每波动1V，增益就随之波动3%,所以，要获得良好的线性响应，要有稳定的高压电源。光电倍增管的响应时间很短，能检测出108和109s的脉冲光。

31、另外，荧光分光光度计使用的检测器还有光导摄象管。它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点，但其检测灵敏度不如光电倍增管。6读出装置荧光仪器的读出装置有数字电压表、记录仪和阴极示波器等几种。数字电压表用于例行定量分析，既准确、方便又便宜。记录仪多用于扫描激发光谱和发射光谱。阴极示波器显示的速度比记录仪快得多，但其价格比记录仪高得多。第四节荧光分析方法及其应用一、荧光定量分析方法1、工作曲线法这是常用的方法，即将已知量的标准物质经过与试样的相同处理后，配成一系列标准溶液并测定它们的相对荧光强度，以相对荧光强度对标准溶液的浓度绘制工作曲线，由试液的相对荧光强度对照工作曲线求出

32、试样中荧光物质的含量。2、比较法如果试样数量不多，可用比较法进行测定。取已知量的纯荧光物质配制和试液浓度Cx相近的标准溶液Cs，并在相同的条件下测得它们的荧光强度Fx和Fs,若有试剂空白Fo须扣除，然后按下式计算试液的浓度Cx：Fs-FoCxCs(9-9)3、荧光猝灭法荧光猝火剂的浓度Cq与荧光强度的关系可用SternVolmer方程表示：Fo/F=1+KCq（9-10）Fo与F分别为猝灭剂加入前与加入后试液的荧光强度。由式（9-10）可见，Fo/F与猝灭剂浓度之间有线性关系，与工作曲线法相似，对一定浓度的荧光物质体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂Q,配成一个荧光物质一猝灭剂系列，然后在相同条

33、件下测定它们的荧光强度。以Fo与F值对Cq绘制工作曲线即可方便地进行测定。该法具有较高的灵敏度和选择性。4、多组分混合物的荧光分析如果混合物中各组分的荧光峰相互不干扰，可分别在不同波长处测定，直接求出它们的浓度。如果荧光峰互相干扰，但激发光谱有显著差别，其中一个组分在某一激发光下不会产生荧光，因而可选择不同的激发光进行测定。例如人3+和Ga3+离子的8羟基喹啉配合物的氯仿萃取液，荧光峰均在520nm,但激发峰分别为365nm和435.8nm,因此，可分别用365nm及435.8nm激发，在520nm测定。如果在同一激发光波长下荧光光谱互相严重干扰，可以利用荧光强度的加合性，在适宜的荧光波长处测

34、定，用列联立方程式的方法求结果。例如，硫胺素和吡啶硫胺素在碱性介质中经K3Fe（CN）6氧化为硫胺荧和吡啶硫胺荧之后，它们的异戊醇萃取液在紫外光照射下会发生荧光。硫胺荧的激发峰在385nm,荧光峰在435nm，吡啶硫胺荧的激发峰在410nm,荧光峰在480nm（图9-6）。用上述激发光激发，测定混合物试液在435nm和480nm的荧光强度Fem/ex，并测定它们的纯物质分别在上述激发波长和荧光波长处的相对摩尔荧光强度，然后列出两组联立方程式：f44F435/385=26339X10Ct+210X10Cp或44lF480/385=9685X10Ct+1022X10Cp或44JF435/410=6

35、419X10Ct+252X10Cp44LF480/410=2816X10Ct+1709X10CpCt、Cp分别是硫胺素和吡啶硫胺素的浓度，解上述任一方程组即可求得混合物试液中的Ct和Cp。借助于微机处理技术，可方便地对更多组分的复杂混合物进行分析。二、荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度通常用两种方法表示。1、绝对灵敏度Sa(9-11)(9-11)绝对灵敏度是用荧光物质的荧光量子产率f和摩尔吸收系数K的乘积表示的灵敏度，S=FKSa值越大，表示荧光物质越易发射荧光，灵敏度越高。2、以硫酸奎宁的检出限表示仪器的灵敏度由于实际测定时，激发光源的强度和光电倍增管的光谱特性随波长而改变，灵敏度受仪器的

36、质量（如光源的强度及其稳定性、单色器杂散光水平，光电倍增管的特性及放大器的质量等）和工作条件等诸多因素的影响，因此，同一物质在不同的条件和仪器上测定的灵敏度1不同。所以常以在特定条件下能检出硫酸奎宁（0.05molLH2SO4水溶液）的最低浓度（即检出限）为指示来表示荧光仪器的灵敏度，其值多在10_101012gmL-1之间。3、用纯水拉曼峰信噪比（S/N）表示仪器的灵敏度当激发光照射荧光体溶液时，其能量一般不足以使溶剂或其它杂质分子中的电子跃迁到电子激发态，但可能将电子激发到基态中其它较高的振动能级。倘若电子受激后能量没有损失并且在瞬间（约1012s）内又返回到原来的振动能级，便会在各个不同

37、的方向发射和激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。其强度与光波长的四次方成反比。溶剂和其它杂质的瑞利散射光会干扰荧光的测定，一般由第二单色器滤去散射光以消除其影响，所以，单色器的分辨器越高，荧光的斯托克斯位移越大，散射光的影响越小。除瑞利散射光外，被激发到基态中其它较高振动能级的电子，也可能返回到比原来的能级稍高或稍低的振动能级，便会产生波长略长或略短于激发光波长的散射光，称为拉曼光。拉曼光的波长随激发光的波长改变而改变，但与激发光之间存在一定的频率差值。一般情况下，拉曼光的强度比瑞利散射光和荧光体的荧光要弱得多。近来仪器的灵敏度趋向于用纯水的拉曼峰的信噪比（S/N）表示，以纯水的拉曼

38、峰高为信号值（S），并固定发射波长，使记录仪器进行时间扫描，以求出仪器的噪声大小（N）,用S/N值作为衡量仪器灵敏度的指标，其值大多在20200之间。水的拉曼峰越高，仪器的噪声越小，S/N值就越大，仪器对荧光信号的检测就越灵敏。因此，这种方法不但简单易行，而且比较符合实际情况，被人们广泛彩。三、荧光分析法的应用荧光分析法具有灵敏度高，取样量少等优点，现已广泛应用于无机和有机物质的分析。1、无机化合物无机化合物直接能产生荧光并用于测定的为数不多，一般是与有机试剂形成发荧光的配合物后进行荧光分析，现在可以采用有机试剂以进行荧光分析的元素已近70种。其中铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及稀土元素常采用

39、荧光法进行分析。采用荧光熄灭法进行间接荧光法测定的元素有氧、硫、铁、银、钴、镍、铜、钼、钨等。可采用催化荧光法进行测定的物质有铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铝、钛、钒、锰、铒、过氧化氢和CN离子等。可在液氮温度下(196C),用低温荧光法进行分析的元素有铬、铌、铀、碲和铅等。此外，还可用固体荧光光测定铀、铈、钐、铽、锑、钒、铅、铋、铌和锰等元素。2、有机化合物脂肪族有机化合物的分子结构较为简单,产生荧光的物质不多。但也有许多脂肪族有机化合物与某些有机试剂反应后生成的产物在紫外光照射下会发生荧光,可用于荧光法来测定。例如：丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中发生反应而生成了喹啉。喹啉在浓硫酸介质中在紫外

40、光照射下会发生蓝色荧光,由喹啉的荧光强度可以间接测定丙三醇含量；丙酮在紫外光照射下所生成的自由基与荧光素钠结合形成无色衍生物,从而导致荧光素钠的荧光强度下降,以此可以测定丙酮的含量；草酸被还原为乙醛酸后可以与间苯二酚偶合形成一种有色的荧光配合物,可用来间接测定草酸含量。芳香族有机化合物因具有共轭的不饱和体系,易于吸光,其中分子庞大而结构复杂者在紫外光照射下多能发生荧光。例如：蒽、菲、芘、丁省在紫外光照射时均可发生荧光,可用荧光分析法直接测定。有时为了提高测定方法的灵敏度和选择性,常使弱荧光性的芳香族化合物经与某种有机试剂作用而获得强荧光性的产物,然后进行测定。例如：降肾上腺素经与甲醛缩合而得到

41、一种强荧光性产物,然后采用荧光显微镜法可以检测出组织切片中含量低到107g的降肾上腺素。在生命科学的研究中,荧光分析是测定蛋白质、核酸等生物大分子最重要的方法之一。酪氨酸、色氨酸能吸收270300nm的紫外光，并分别发射303nm、348nm的荧光，含有这两种氨基酸的蛋白质可以直接用荧光法测定,如用于牛乳中蛋白质的测定。某些荧光染料在与蛋白质作用之后，荧光强度显著强大，而且荧光强度的增大与溶液中蛋白质的浓度呈线性关系，由引可用于蛋白质的测定。女口8苯胺基一1萘磺酸作荧光染料可以测定1300卩g(3mL)1的蛋白质。在核酸的分析中，最重要的荧光试剂是溴乙锭，它能够嵌入到DNA双螺旋结构中的碱基对之间，而使其荧光大大增强，它不仅能检测低至0.1卩g-mL1DNA含量，而且可用于探测DNA的双螺旋结构，被广泛用于核酸的变性与复性，以及DNA分子杂交的研究中。荧光分析法，特别是新近发展起来的同步荧光法、时间分辨荧光法、相分辨荧光法，偏振荧光法等新的测定技术，都具有灵敏度高，选择性好，取样量少，简便快速等优点，已成为各领域中痕量及超痕量分析的重要工具。作业：1、现代仪器分析1998版，P294：5、10、12、132、新编仪器分析2009版，P74：4、5、6、7、18、22