自己总结透彻易懂PCRRT-PCR原理

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1、PCR原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特别DNA复制。PCR这项技术，被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于推断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定。DNA 变性DNA denaturation : 加热或用碱处理双链DNA，使氢链断裂，结果DNA变成为单链，此称为DNA的变性。发生这种变化时的温度称为融解温度，鸟嘌呤和胞嘧啶含量高的DNA融解温度也高。由于变性的结果DNA的紫外线吸取增加，比旋光度和粘度降低，密度也增加。如果在加热后渐渐冷

2、却，则DNA可以再次恢复成双螺旋结构。另外，外部压力也能使DNA变性.PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（常常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延长温度之间很好地进行掌握。引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延长的动身点而起作用的多核苷酸链，在引物的3-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合

3、成，因此引物的3-OH，必须是游离的。DNA聚合酶（DNApolymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开头复制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。dNTP: deoxy-ribonucleoside triphosphate（三磷酸脱氧核糖核苷）的缩写。是dATP, dGTP, dTTP, dCTP的统称。在生物DNA合成，以及PCR聚合酶链反应中起原料作用。由等摩尔数的dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合而成。PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的

4、重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参加下，依据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化掌握DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。DNA的复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为 退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其

5、它因素的影响。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和进展。发现耐热DNA聚合酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得特别简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。寡核苷酸: 是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，常常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。寡核苷酸

6、合成的DNA（脱氧核糖核酸）可以用于链聚合反应，能放大确定几乎全部DNA的片段，在这个过程中寡核苷酸是作为引物，和DNA 中标的的互补片段结合，作成DNA的复制品。调控寡核苷酸用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在制止癌细胞活动方面能起肯定的作用。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延长三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右肯定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作筹备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性

7、成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延长：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延长三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。碱基互补配对原则 the principle of complementary base pairing在DNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不

8、变，使得碱基配对必须遵循肯定的规律，这就是Adenine（A，腺嘌呤）肯定与Thymine（T，胸腺嘧啶）配对，Guanine（G，鸟嘌呤）肯定与Cytosine（C，胞嘧啶）配对，反之亦然。碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。DNA 半保留复制是：DNA 在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA分子。 子代DNA分子其中的一条链来自亲代DNA ，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。摘要： 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引 物. PC

9、R由变性-退火-延长三个基本反应步骤构成. PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性-退火-延长三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右肯定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作筹备；模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延长：DNA模板-引物结合 物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合

10、成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延长三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需 24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝.PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%, 但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR

11、产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即消失“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情 况下,平台期的到来是不行避开的.PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3端开头延长,其5端是固定的,3端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.进入其次周期后,引物除与原始

12、模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合.引物在与新链结合时,由于新链模板的5端序列是固定的,这就等于这次延长的片段3端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短全都的 “短产物片段”.这段话没看懂。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽视不计, 这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用. 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+

13、 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.RT-PCR技术概述RT-PCR为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚

14、合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。1 逆转录PCR由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依靠RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依靠DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。cDNA是互补脱氧核糖核酸，是与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行肯定条件下合成的。DNA(Deoxyribonucleic acid)

15、，中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。Messenger RNA (mRNA）信使核糖核酸: 携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的RNA。从脱氧核糖核酸（DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸（RNA）。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列挨次。mRNA存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。cDNA互补脱氧核糖核酸: 为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形

16、成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依靠RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依靠DNA的DNA聚合酶或依靠RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomicDNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRN

17、A结构。cDNA同样可以被克隆。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反转录酶。RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-ti

18、me PCR)。为了与逆转录PCR相区分，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。2 实时PCR实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以肯定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。ds-cDNA是基因文库技术中，通过mRNA反转录所获得的cDNA（第一链），依靠DNA聚合酶，在肯定条件下所延长的与cDNA相互补的其次条cDNA链的英文简称。通过ds-cDNA的合成，可以得到源mRNA的双链cDNA模板，用于后续的酶切处理和基因文库的建立。探针是一小段单

19、链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，依据探针的种类，可进行放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来推断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种

20、是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭基团则在3末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团放射的荧光信号被淬灭基团吸取；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光

21、基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。这里没看懂啊。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭剂则在3末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团放射的荧光信号被淬灭基团吸取；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变

22、（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。淬灭剂指通过分子间的能量转移，迅速而有效地将激发态分子（单线态氧和三线态物质）淬灭，使转变成热能或转变成荧光或磷光，而辐射散失，回到基态的一类物质，通过这一过程，使其免遭紫外线破坏，从而达到稳定高分子材料的目的。因此，它有别于紫外线吸取剂（并不强烈吸取紫外线），且作用机理也不同于紫外线吸取剂（通过分子内的结构变化转移能量），如常用镍的有机化合物。real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为

23、“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”3 RT-PCR技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA水解酶PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子4 PCR各步骤的目的预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，削减DNA 简单结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反

24、应得以顺利进行。三种循环模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右肯定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作筹备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延长：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。延长时间缘由用PCR仪扩增时,(变性.退火,延长)循环完成后,连续72度延长了10分钟的缘由：1.延长时间取决于待扩增DN

25、A片段的长度。（当然是在反应体系肯定的条件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延长速率为1kb/min。2.依据延长速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延长时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量。3.连续72度延长了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用一般Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。DNA二级结构：1. 两条多核苷酸链以相同的旋转绕同一个公共轴形成右手双螺旋，螺旋

26、的直径2.0nm2. 两条多核苷酸链是反向平行的，一条5-3，另一条3-53. 两条多核苷酸链的糖-磷酸骨架位于双螺旋外侧，碱基平面位于链的内侧4相邻碱基对之间的轴向距离为0.34nm，每个螺旋的轴距为3.4nmDNA二级结构的稳定作用力1. 两条多核苷酸链间的互补碱基对之间的氢键2. 碱基对疏水的芳香环积累所产生的疏水作用力，以及积累的碱基对间的范德华力，3. 磷酸集团上的负电荷与介质中的阳离子化合物之间形成的盐键所谓的DNA的一级结构，就是指4种脱氧核苷酸的链接及排列挨次，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸相互连接形成长的多核苷酸链。两个核苷酸之间的连接通常是通过磷酸二酯键（phosph

27、odiester bond），该键将一个核苷酸的磷酸基团与另一个核苷酸的脱氧核糖连接。由四种脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的长链高分子多聚体为DNA分子的一级结构。DNA分子中第一个核苷酸的3-羟基与其次个核苷酸的5-磷酸基脱水形成3,5-磷酸二酯键,其次个核苷酸的3-羟基又与第三个核苷酸的磷酸基脱水形成3,5-磷酸二酯键，依此类推，形成线性多聚体。DNA分子中第一个核苷酸的5-磷酸与最末一个核苷酸的3-羟基都未参加形成3,5-磷酸二酯键，故分别称为5-磷酸端(或5-端)和3羟基端(或3-端)。DNA的三级结构：1超螺旋结构：环状分子的额外螺旋可以形成超螺旋2其他三级结构：与蛋白质结合形成复

28、合体(病毒)；核小体结构生物的绝大部分遗传信息储存于DNA序列中，核苷酸的不同排列挨次决定了生物的多样化。商量DNA的一级结构有助于了解DNA的生物学功能。PCR引物的选择对靶序列中潜在的引物位点进行分析， 这些位点应该不会形成同源多聚体机构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中供应的公式计算各引物的熔解温度。（2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相像，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。（3）对寡核苷酸的长度和

29、/或位置进行细调。使得引物的3末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条阅历性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。注意事项(1)双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。(2) 复性过程接受的温度至关重要。如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特

30、异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低35的条件下进行。（3） PCR扩增所需的循环数目决定于：反应体系中起始的模板拷贝数；引物延长和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会始终持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的抱负情况。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术.首先经反转录酶的作用从

31、RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段.RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列. 核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有亲密的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA

32、；1983年还发现了有支链的RNA分子。DNA和RNA的区分是什么? 1、 组成单位不同：DNA的组成单位是脱氧核苷酸，RNA的组成单位是核糖核苷酸， 2、 组成碱基不同：DNA的组成碱基是ATGC，RNA的组成碱基是AUGC 3、 组成五碳糖不同：DNA的组成五碳糖是脱氧核糖，RNA的组成五碳糖是核糖， 4、 空间结构不同：DNA是双螺旋结构，RNA一般是单链。 5、 功能不同：DNA是遗传物质，RNA一般在细胞中不作为遗传物质。 RNA大体可以分为三类 mRNA(信使RNA) rRNA(核糖体RNA) tRNA(转运RNA) 不同的RNA 有着不同的功能 rRNA是核糖体的组成成分，由细胞

33、核中的核仁合成，而mRNA tRNA 在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能。 mRNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁 核糖体RNA：即rRNA，是最多的一类RNA，也是3类RNA（tRNA,mRNA,rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成。rRNA占RNA总量的82%左右。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”。rRNA一般与核糖体蛋白

34、质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。tRNA的功能是携带符合要求的氨基酸，以连接成肽链，再经过加工形成蛋白质转运RNA（transfer ribonucleic acidtRNA）是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸，简称tRNA。绝大多数tRNA由七十几至九十几个核苷酸组成，分子量为2500030000，沉降常数约为4S（个别tRNA的沉降常数为3S，含63个核苷酸）。一种tRNA只能携带一种氨基酸，如丙氨酸tRNA只携带丙氨酸，但一种氨基酸可被不止一种tRNA携带。同一生物中，携带同一种氨基酸的不同tRNA称作“同

35、功受体tRNA”。组成蛋白质的氨基酸有20种，而tRNA可以有六七十种或更多。携带同一种氨基酸的细胞器tRNA与细胞质tRNA也不一样。生物体发生突变后，校正机制之一是通过校正基因合成一类校正tRNA，以维持翻译作用译码的相对正确性。可以有多种校正tRNA携带同一种氨基酸。转运RNA的功能: 主要是携带氨基酸进入核糖体，在mRNA指导下合成蛋白质。即以mRNA为模板，将其中具有密码意义的核苷酸挨次翻译成蛋白质中的氨基酸挨次（见蛋白质 的生物合成、核糖体）。tRNA与mRNA是通过反密码子与密码子相互作用而发生关系的。在肽链生成过程中，第一个进入核糖体与mRNA起始密码子结合的tRNA叫起始tR

36、NA，其余tRNA参加肽链延长，称为延长tRNA，依据mRNA上密码的排列，携带特定氨基酸的tRNA依次进入核糖体。形成肽链后，tRNA即从核糖体释放出来。整个过程叫做tRNA循环（图3）。tRNA靠反密码子与mRNA识别，但并非一种反密码子只能识别一种密码子。例如反密码子CIG（I是次黄嘌呤核苷酸）能识别三种密码子。一般反密码子中的稀有核苷酸因配对不严格而能识别多种密码子，这种现象在生物学中称为“摇摆性”.反转录：是以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录。这是DNA生物合成的一种特别方式。酶与反转录过程转录过程由反转录酶催化，该酶也称依靠RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板

37、催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。反转录的简要过程表示如下：从细胞质中获得RNA 以该RNA为模板依据碱基互补配对为原则反转录得单链的DNA 以得到的DNA为模板碱基互补配对为原则反转录得双链的DNART-PCR简介RT-PCR 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术.首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA ,再以cDNA为模

38、板,扩增合成目的片段.RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列.作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物.无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染. 用于反转录的引物可视实验的简略情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种.对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可.RT-PCR引物的选择随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA 等全部RNA的反转录反应.主要用于单一模板的RT-PCR反应. Oligo

39、dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴.）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大削减. 基因特异性引物: 与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况.天为时性引物代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性引物连用. PolyA通常指位于mRNA上的150-200个腺苷酸残基（又称为特别的帽子结构）。PolyA多聚腺苷酸 多聚腺苷酸化是指多聚腺苷酸与信使RNA（mRNA）分子的共

40、价链结。在蛋白质生物合成的过程中，这是产生筹备作翻译的成熟mRNA的方式的一部份。在真核生物中，多聚腺苷酸化是一种机制，令mRNA分子于它们的3端中断。多聚腺苷酸尾（或聚A尾）保护mRNA，免受核酸外切酶攻击，并且对转录终结、将mRNA从细胞核输出及进行翻译都十分重要。一些原核生物的mRNA都会被多聚腺苷酸化，但多聚腺苷酸尾的功能则与真核生物有所不同。当去氧核糖核酸（DNA）在细胞核内转录成核糖核酸（RNA）的过程中及完成后，多聚腺苷酸化就会消失。当转录停止后，mRNA链会由核酸外切酶及RNA聚合酶切开。切开位点的四周有着AAUAAA序列。当mRNA被切开后，会加入50-250个腺苷到切开位点的3端上。这个反应是由多聚腺苷酸聚合酶。RT-PCR影响因素 RT-PCR反应受多个因素影响,如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度,扩增的循环数等. 建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验. 对于具有较高Tm的引物,增加退火和延长时的温度对反应有利.较高的温度有利于削减非特异的引物结合,因而提高特异产物的得率. 大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到.但如果目标RNA太稀有,或者只有很少的起始材料,有必要增加扩增的次数到45-50次. 12 / 12