IL基因真核表达载体的构建及其对OVCAR细胞生物学机制的分析

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1、英文缩写英文缩写IL8Interleukin8白细胞介素8 MMPMatrix Metallo Proteinases基质金属蛋白酶 VEGFvascular endothelial血管内皮(细胞)growth factor生长因子PBMCPeripheral Blood外周血单个核细Mononuclear Cell胞MTTMethyl Thiazolyl Tetrazoliu四甲基偶氮唑蓝 LPALysophosphatidic Acid溶血磷脂酸 ImPCRreverse transcription逆转录聚合polymersechain reaction酶链式反应 PBSphosphate

2、 buffered saline磷酸盐缓冲液 FCMflow cytometry流式细胞仪 CXCRchemoattractant cytokine趋化因子受体rec印torPIProliferation index增殖指数ELISAEnzyme linked酶联免疫吸附Immunosorbent试验bFGFbasic fibroblast基本的成纤维growth factor 细胞生长因子 TNF tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 INF Interferon 干扰素TGFtumor growth factor肿瘤生长因子河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承

3、诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。 河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学 位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材 料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则， 承担相应的法律责任。研究生签名：磊嘲导师签名榴学院领导签名：诱幸弓月形日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导。F进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，

4、 文责自负。研究生躲参晴导师躲徽D 8年弓。月彩日中文摘要IL8基因真核表达载体的构建及其对OVCAR3 细胞生物学机制的研究摘要目的：卵巢癌是威胁妇女健康常见的妇科肿瘤，因其早 期发现较难，肿瘤类型多，组织结构复杂并各具不同的生物 学特性，一直是妇科肿瘤领域研究的热点。上皮性癌其恶性 程度比间质性肿瘤高，治疗效果远不如生殖细胞癌，此种肿 瘤发展迅速，不易早期诊断，死亡率高，是该领域中最有待 研究的一种肿瘤，因此一种新的治疗方法亟待需要。基因的 异常表达及其与卵巢肿瘤的发生发展关系的研究己成为分 子生物学研究的热点。卵巢癌的发生和发展是一个复杂、多步骤的过程，与许多基因和蛋白的表达密切相关。白

5、细胞介素8(interleukin 8，IL8)，是Yoshimur于1987 年发现的第一个趋化性细胞因子，属于CXC家族，在炎症 和免疫过程中起重要的调节作用。近来作为恶性肿瘤相关分 子越来越多地引起了研究者的关注。目前已知多种肿瘤细胞 均可分泌IL8，实体肿瘤组织IL8过表达与肿瘤生长侵袭转 移密切相关，而其促进肿瘤发生发展的机制尚不完全清楚。近年重组技术的建立与发展在理论和实践上为卵巢癌 治疗提供了新的策略基因治疗有望成为卵巢癌治疗的 新途径。理想的治疗基因应有效的抑制肿瘤细胞生长，而对正常组织、细胞无明显抑制作用。本研究将人IL8基因克隆 到真核表达载体pcDNA31(十)中，在脂质

6、体作用下瞬时转染 低表达IL-8基因的上皮性卵巢癌细胞株OVCAR3中，探讨中文摘要该基因诱导的上皮性卵巢癌细胞功能的改变及其生物学机 制，为迸一步研究IL8基因治疗上皮性卵巢癌的提供了可行 性。方法：1构建IL8基因真核表达载体提取健康志愿 者外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA，通过RT-PCR扩 增IL8编码序列基因片段，并将其克隆至PMD18T载体构 成PMD18TIL8，BamHI和XhoI双酶切后，与经相同双酶 切后的真核pCDNA31(+)表达载体连接，构建成 pcDNA3I(+)IL8重组质粒。2瞬时转染人卵巢癌细胞OVCAR3以脂质体介导法将pcDNA3I(+)IL8重组质

7、粒转染低表达该目的基因的 OVCAR3细胞，经RT-PCR、ELISA、Westemblot法检测转 染细胞中IL8的表达情况。3检测细胞增殖情况MTT法检测转染pcDNA31(+) IL8组与未转染组细胞的生长增殖能力，绘制生长增殖曲线。 4检测各组细胞的细胞周期变化用流式细胞仪(FCM) 检测3组细胞，即转染pcDNA3I(+)IL8重组质粒组、转染 pcDNA31(+)空载体组和未转染组OVCAR3细胞周期变化。 5测定各组细胞的Bax、Bcl2、VEGF和MMP9四种 蛋白的表达情况采用FCM检测转染pcDNA3I(+)IL一8重 组质粒组、转染pcDNA31(+)空载体组和未转染组3

8、组细胞的Bax、Bcl2、VEGF和MMP9四种蛋白的表达变化。结果：1经PCR扩增、双酶切及DNA测序鉴定，证实 pcDNA3I(+)IL8构建成功。2 RT-PCR法检测到瞬时转染的OVCAR3细胞中有大量IL一8的表达，转染pcDNA31(+)IL8后IL8基因的扩中文摘要增片段灰度值为22688547，与相应3-actin灰度值之比 155；未转染组的IL8基因相应位置的灰度值12038672，与相应13-actin灰度值之比O82，增殖率为18902； ELISA法检测结果，转染pcDNA31(+)IL8质粒6h、48h 后细胞上清和细胞裂解液中IL8表达量分别为3694-037、

9、1967O24、1110114，而未转染组和转空载体粒组仅 检测到极少量，后两者与前者比较有统计学意义(PO05)， 转染3天后，两种细胞的光吸收值在统计学上具有显著差 异(PO05)，且细胞的增殖率随着时间的延长呈现上升趋 势。4流式细胞周期结果表明转染pcDNA3I(+)IL8与转染 pcDNA31(+)、未转染组三组细胞进入S期数分别为：5518298、39724-416、31364-146，前者进入S期数明显增多，且与后两者比较有统计学意义(PO05)；三者增殖指 数分别为：58834-285、4432+420、35314-156，转染 pcDNA31(+)IL8组PI值明显增加，且与

10、后两者比较具有统计学意义(PO05)。5 FCM检测转染pcDNA31(+)IL8、转染pcDNA31(+) 和未转染三组细胞蛋白结果表明，与细胞增殖相关细胞因3中文摘要子VEGF和MMP9表达量分别为：430442170、358701777、335521968；356152270、279372748、283562667，转染pcDNA3I(+)IL8组与后两者比较有 统计学意义(pO05)；三组凋亡抑制因子Bcl2结果分别 为380861527、319151789、305042890；凋亡因 子Bax分别为343122610、416272545、42013 2365，前者与后两者比较有统计学

11、意义(pO05)。结论：目的基因IL8可以在脂质体介导下有效的转染人卵巢癌细胞株OVCAR3，其通过提高进入细胞S期数明 显促进卵巢癌细胞的生长，且其机制与促血管生成因子和凋 亡相关因子密切相关，这为进一步研究IL8在卵巢肿瘤中 的作用机制提供了基础。关键词：IL8；OVCAR-3；细胞转染；细胞周期； VEGFMMP9细胞增殖；BaxBcl2凋亡4英文摘要Study on the construction of IL一8 gene eukaryotic expression vector and the cytobiology mechanism of OVCAR-3 cellsABSTRA

12、CTobjective：Being one of department of gynecology tumor, ovarian cancer which iS seriously attacking womenS health has driven professorS attention which iS hard tO search out in early stageThere are varieties of tumor of the ovary whose organism construction are complicated and owe different bionomi

13、csThe malignant degree of epithelium tissue cancer is higher thaninterstitial substance cancel While its therapeutic efficacy cannot reach the germinocarcinomaAnd this tumor which grows very fast，cant be diagnosed easily in the early stage and its death rate is very high is eager to be researched in

14、 the region 6f woman tumorSo a new therapy should be foundRecentl弘the research that specialists try to find out the cause and developing relationship of some uncommon genes and ovarian cancer is hitting at the district of boss molecular biology research Ovarian cancerS cause and developing relations

15、hip is a complex and mixed-step process which involves quantities genes andproteinsexpressionIL一8 which is found by Yoshimur at 1 9 87 is the first chematropism cell factor belonging CXC family that plays an important role in the contribution of inflammation and英文摘要immunologic processRecently，it has

16、 drawn more and more attention of researchers as malignant tumor correlative molecule Nowadays，it is known that many tumor cell can secrete IL8， IL-8 overexpression relates to tumorous growth and metastasis but it iS not clear that the mechanism of encouraging tumor appearance and developmentRecent

17、years，the construction and development of recombi nation technology can provide new strategy for ovarian cancer in theory and practicegene therapy can be expected to becomenewchannelofovariancancertherapyIdealtherapeutic gene can inhibit tumor cellS growth effectively without inhibitory action to no

18、rmal tissue and cellIn this research，we clone the human IL一8 gene into eukaryoticexpression vector pcDNA31(+)，with the act of liposome，transient transfection OVCAR一3 which is epithelial ovarian cancer cells expressing little IL一8The functional change and biology mechanism are investigated induced by

19、 IL一8，and provide a feasibility to IL一8 gene therapy ovarian cancerMethod：1 Construct the eukaryotic expression vector ofIL-8 gene Total RNA was isolated from PBMC of healthy volunteers，IL一8 gene encoding fragment was amplified byImPCR and cloned into the vector PMD1 8TBamHI)moIdouble digested produ

20、ct of PMD1 8TIL8 was connected with the vector pcDNA31(+)which was digested by BamHIXhoI2 Transient transfect into OVCAR3 cells The recombinant plasmid pcDNA3I(+)IL-8 was transfected into OVCAR36英文摘要cells which express IL一8 a little with Lipofectamine2000The expression of lL一8 was tested in OVCAR一3

21、cells by RT-PCR、ELISA and Western blot assay3 Detect cell proliferationDetect these cellsreproductive activities by MTT and draw growth curve4 Detect the cell cycle The cell cycle was detected by Using flow cytometry(FCM)on three group cells： pcDNA31(+)IL一8 transfection group、pcDNA31(+)group and OVC

22、AR一3 none transfection group5 Measure Bax、Bcl一2、VEGF and MMP一9 expressionanalysis The expression of Bax、Bcl-2、VEGF and MMP一9 were detected by using FCM on three group cells the same as method4Results：1 After PCR amplification，BamHIXhoI digestion and DNA sequencing confirmation，the eukaryotic express

23、ion vector pcDNA31(+)IIL一8 was constructed successfully2 The IL一8S expressions in quantity were founded in the cells of transient transfection when detected by the Wav of RT-PCRThe gray scale value of pcDNA31(+)IL一8 transfection group which was 22688+547 correspondingly against 13-actin was 155，whil

24、e OVCAR一3 none transfection group which was 1 2038672 correspondingly against3-actin was O82The growth rate was 1 8902：The IL一8S expressions in cell sap and the cells after transfecting pcDNA31(+)IL一8 6h and 48h were respectively 369+037、 19674-024、 1 110 114 by using ELISA，while the others were a l

25、ittle，P005)，while pcDNA31(+)IL一8 transfection group was obviously more active after 3 days(P005)，and the formerS increasing rate presents an evident tendency of going up along with the timeS extension4ThecellularSstageinpcDNA3I(+)IL一8、 pcDNA31(+)and OVCAR一3 cells were respectively 5 51 8 298、3972416

26、、3136146 by FCMThe former was much higher than the others，P005These proliferation index were 5883285、4432420、35-3 1156The former P1 wasmuch higher and the comparison between them has statisticalsignificance(PO05)5 The expression of VEGF and MMP一9 in pcDNA31(+)IL-8、pcDNA31(+)and OVCAR一3 cells were re

27、spectively 430442170、358701777、335521968 and 356152270、279372748、283562667；while Bcl2 and Bax in these cells were respectively 380861527、319158英文摘要1789、305042890 and 343122610、4162725。45、4201 32365There was statistical significance against pcDNA31(+)transfection group and OVCAR一3 none transfection g

28、roup(pOD260OD28018时，说明 提取的总RNA纯度合格。根据OD260的值按以下公式计算 出RNA的浓度(注：OD260值为1时，RNA浓度为4099m1)。RNA浓度=40OD260稀释倍数。22目的基因IL8的RT-PCR反应221逆转录合成cDNA第一链(RT反应)(1)以l gg总RNA为模板，建立如下逆转录反应体系(2091)： mRNA(1 gglal)109l5Buffer209ldNTP(10mM)201alOligo(dT)15109lRnasinO59lMMLV109lDEPC水1259l(2)逆转录反应条件：2510min，4260min，995min，41

29、0min。222PCR扩增及其DNA的质量鉴定2221PCR引物设计 根据美国生物技术信，g,qu心(NCBI)公布的人类白细胞介素8基因序列(编号：NM 000956)，借助primer50，设计引 物为：PI(上游)5 一TA鱼鱼3里ATGACTTCCAAGCTGGCCGT-3 P2(下游)5 -GCC!QQTTATGAATTCTCAGCCCT-3研究论文分别在Pl和P2的5端添加BamH I、Xho I酶切位点， 下划线分别表示酶切位点。引物由上海生物工程技术服务有 限公司合成。扩增的目的基因约为300bp，编码100个氨基 酸，为IL8蛋白表达基因序列。2222PCR扩增 (1)以合成

30、的cDNA为模板，用引物P1、P2进行扩增，PCR 反应体系(20“1)如下：合成的第一链cDNA3肚l引物(1009molL)各lpl10 X Buffer25肛ldNTP(1 0mmolL)O59l。Taq酶(su4d)061tl 无菌水899l(2)PCR反应条件： 94预变性5min，循环参数：9430s，5630s，7245s，共循环30次，72延伸10min 2223目的基因的鉴定反应产物进行l琼脂糖凝胶电泳鉴定。l g琼脂糖加到 100ml TAE应用液中，加热溶解，待温度降至60时，加 Goldview 5111混匀，倒入插有2mm梳子的电泳槽内，厚度约 为04cm，凝固后使用

31、。每孔加5斗l PCR产物，采用80V恒压， 电泳缓冲液1TAE，电泳30min后在紫外透射仪下观察结 果，照相记录实验结果。23pMDl8IL8过度载体的构建231DNA的纯化回收 按照北京TIANGEN生物DNA胶回收试剂盒操研究论文 作步骤：(1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量 切除多余的部分)放入干净的EP管中，称重量；(2)向胶块中加入3倍体积的溶胶液PN(如凝胶重019， 其体积可视为1009l，依此类推)；(3)50水浴放置10分钟，其间不断温和的上下翻转离 心管，以确保胶块充分溶解；(4)将上步所得的溶液加入一个吸附柱CA2中，(吸附柱 放入收集管中)13000

32、 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放入收集管中；(5)向吸附柱中加入7001al漂洗液PW(使用前检查是否 已加入无水乙醇)13000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附 柱重新放入收集管中；(6)向吸附柱中加入5009l漂洗液PW，13000 rpm离心 30秒，倒掉废液；(7)将离心柱加入收集管中，13000 rpm离心2分钟； (8)将吸附柱置于室温或50温箱数分钟，彻底晾干； (9)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加适量(5091)双重水(PH7o85之间)，室温 放置2分钟；(10)1 3000 rpm离1分钟，收集DNA溶液。 232目的基

33、因浓度测定用无菌去离子水将DNA稀释适当倍数，测定260nm波 长的吸光度值(OD260)，按以下公式算出DNA的浓度(注： OD260值为1时，双链DNA浓度为50 ggm1)。DNA浓度=50OD260稀释倍数。研究论文233DNA的连接PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收300bp片段，与pMDl8T Vector，连接体系如下(1091)：IL8 PCR回收产物59lpMD 18一T VectorlglTaDNA连接酶1ul10xBufferl glH2029116水浴16h。234感受态菌的制备挑取Ecoli DH 5a单个菌落，接种至3ml LB培养基中(含 1099ml四环素)I

34、D37。C、200rpm振荡培养过夜。次日，取509l菌液接种到5ml新鲜LB培养基中，继续振摇34h，使 细菌生长至对数生长期，细菌培养液的OD600一般在O2o4 之间。取3ml菌液冰浴10 min后，4000rpm离。tl,10min，弃 尽上清，用3009l Cacl2(O1 molL)悬浮沉淀，冰浴30mira 4000rpm离心10min回收细胞，弃上清，加入1009l Cacl2溶 液悬浮沉淀，冰浴10min后制成感受态菌。 235细菌的转化加入59l连接产物至上述感受态细胞，冰浴30min，42 热休克90s，再冰浴2min，加9009l LB培养基振摇1h后， 取1009l菌

35、液涂于LB琼脂平板上(平板中含10099ml羧苄青 霉素)，置于37。C培养2h，待菌液己被吸收倒置培养过夜。236pMDl8TIL8阳性克隆的鉴定2361菌落PCR鉴定阳性克隆 随机挑选20个白色菌落划线增菌，然后各取少量菌苔悬研究论文浮于509l水中，(或取20个白色菌落在含有1 0099ml羧 苄青霉素得3mlLB培养基中过夜培养，取509l菌液进 行4000rpm离心1 0min，向沉淀中加入50tl水)，煮沸 10min，12000rpm离心lmin，取59l上清液为模板，进行 PCR扩增，反应体系如下(2091)：模板59l10Bu髓r25山引物(2009molL)各2山dNTP(

36、1 0mmolL1“1Taq酶(5U91)129l灭菌水63“1PCR反应条件同2222， 将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。 2362酶切鉴定阳性克隆将提取的质粒(步骤见下37)取59l，用BamH I和Xho I进行双酶切，酶切体系如下(1091)：pMDl 8TIL一859lBamHIlglXho IliblOK Bufferlgl无菌水29l37C水浴酶切3h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。237提取pMDl 8TIL8重组质粒 挑取5个PCR鉴定为阳性的菌落用LB培养基进行增菌，21研究论文然后提取质粒。质粒DNA的提取采用碱裂解方法进行，按 北京TIANGEN生物质粒提取试

37、剂盒说明，操作步 骤如下：(1)取过夜培养菌液3ml，12000rpm离心lmin，收集菌 体；(2)倒掉上清，将沉淀(菌体)重悬于100肛1悬浮液(溶 液I)，振荡至彻底悬浮；(3)加入1509l裂解液(溶液II)，温和颠倒数次，使菌体 充分裂解，溶液逐渐变得粘稠清亮；(4)加入1509l中和液(溶液III)，温和颠倒数次，放置2min；(5)将上述混合物13000rpm离心810min，将上清液小 心加入一个新的15ml EP管中，加入04ml纯化树脂(使用 前充分混匀)，颠倒混匀3分钟；(6)将纯化树脂及上清液的混合物吸入离心纯化柱中， 13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；(

38、7)将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600“1 80乙醇，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液； (8)重复第(7)步12次，尽可厶日匕la付,IA7杂质去除； (9)取出纯化柱，将其套入一个干净的15ml EP管中，加入50ul无菌双重水于纯化树脂上，不能粘在管壁上，室温下 放置5分钟后，13000rpm离心1分钟；(10)离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1-2p,1电泳，贮存于一20备用。238DNA序列测定与分析 将酶切鉴定为阳性的质粒pMDl8TIL8送至上海生物工研究论文程技术服务测序。测序结果在美国国家生物技术信 息中心(NCBl)网站的GeneBank中

39、检索，与已报道的IL8基 因序列进行同源性比较。 24真核表达质粒pcDNA3I(+)IL8的构建241双酶切反应将pMDl8TIL8与pcDNA31(+)质粒分别用BamH I和 Xho I进行双酶切，各取209l质粒，5pl 10K buffer，29l BamH I，29l Xho I加水至509l，置37。C水浴酶切，4h。酶切 产物进行核酸电泳分析并回收。242连接反应 酶切产物按照北京TIANGEN生物DNA胶回收试剂盒(见37)操作步骤回收后，取69l的IL8基因酶切 片段和2p1 pcDNA31(+)质粒酶切产物，加llal 10xBuffer，lgl T4 DNA连接酶(35

40、0wed)，16C水浴16h。(IL8基因酶切片 段与pcDNA31(t)酶切质粒按照说明书规定的摩尔质量比进 行估算)243感受态菌的制备 操作步骤同234244细菌的转化 取59l连接产物加入1009l感受态细胞，冰浴30rain，置42C热休克90s，再冰浴2min，加9009lLB培养基37、200rpm振摇1h后，取1009l菌液涂于LB琼脂平板上(平板 中含100rtgml羧苄青霉素)，置于37。C培养2小时，待菌液 已被吸收倒置培养过夜。245质粒的小量提取 操作步骤同237研究论文246真核表达质粒pcDNA3I(+)IL一8阳性克隆的鉴定 操作步骤同236结果1真核表达质粒p

41、cDNA3I(+)IL8构建策略(Fig1)。2细胞总RNA的鉴定从人外周血淋巴细胞中提取的总 RNA经15琼脂糖凝胶电泳，可见28S和18S清晰电泳条 带，且28S的亮度和宽度是18S的两倍，说明提取的总RNA 完整性很好，可以作为反转录模板。经紫外分光光度计测定， 其21OD260OD28018，说明提取的总RNA纯度合格(Fig2)。3 IL8基因片段的扩增将结果1取得的细胞总RNA经 RT-PCR扩增，扩增产物经15琼脂糖凝胶电泳，显示有长 约300bp的片段，与预计的IL8基因片段相符，提示从人外周血淋巴细胞中反转录扩增出特异性目的基因片断IL8(Fig3)。4重组质粒的鉴定 重组质

42、粒PMD1 8TIL8和 pcDNA31IL8的经过PCR反应可获得300bp亮带同2，两 种质粒分别用BamH I和Xho I进行双酶切，可得到3000bp 和300bp、5400bp和300bp的两组亮带；DNA测序结果显示， 构建的质粒中插入的基因片断全长为300bp，测序结果与 GeneBank网上公布的白细胞介素8的基因序列一致(Fig35)。研究论文 附图lh Tlht T 加fr IM卸718lKm TBI皿I-I TB蚰(T取oR T EcoRV BmC T加cDlTXbI r舡TITFig1 The construction of recombinant pcDNA3I(+)

43、IL一8plasmid25研究论文18SFig 2 Agarose gel electmphoretic analysis ofRNA from human peripheral blood mononuclear cells研究论文5000bp 3000bp2000bp1500bp 1000bp750bp500bD250bD100bpFig 3 Agarose gel electrophoretic analysis of amplification of the gene ofIL一8 by RT-PCR1DL 5000 Marker2IL-8 gene amplified by RT-PCR研究论文5000bp3000bp2000bp 1500bp1000bp 750bp500bp250bp 100bp2Fig 4