2015初始污染菌实验方法验证

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1、 . 初始污染菌实验方法验证方案产品名称：一次性包皮环切缝合器 日期： 日期： 日期：狼和医疗器械股份限目录初始污染菌实验方法验证方案1概述2验证目的3职责与验证申请4验证依据5验证计划6验证容初始污染菌实验方法验证方案1.概述：初始污染菌的数量可以反映出车间环境卫生的清洁度，与产品灭菌工艺、成品热原及毒素有直接关系，故而要对其检测方法进展验证，确认其有效性及检测准确性，从而优化产品灭菌工艺及控制产品热原及毒素，确保产品的平安性。2.目的： 通过实验验证检测方法的适用性及计数用培养基的适用性。3.职责与验证申请：3.1质量管理部提供检测项目方案、接收标准、评价等级及相关实验。3.2生产技术部负

2、责按验证方案生产相关样品初始污染菌实验方法验证申请表验证组职务单位黄燕组长质量管理部经理狼和医疗器械股份龙章宏组员化验员俊组员化验员胡梓鹏组员化验员批 准经研究：同意以上成员组成验证小组，按照此方案对本公司的产品的初始污染菌实验方法进展验证。批准人： 年 月 日4.依据：中国药典2015版5.验证计划：5.1实验操作人员确认；5.2实验室实验设备及器材确实认；5.3产品取样及方法确认。6.验证容：6.1菌种和菌液制备 试验用菌株的传代次数不得超过5 代从菌种保藏中心获得的枯燥菌种为第0 代，并采用适宜的菌种保藏技术进展保存，以保证试验菌株的生物学特性。接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌

3、的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养2-3天，上述培养后的新鲜培养物用PH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml菌数小于100cfu(菌落形成的菌悬液。接种黑曲霉的培养物至沙氏葡萄糖琼脂面培养基上，2025培养57天，加人35 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管，用0.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0无菌

4、化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml孢子数量小于100cfu的孢子悬液。菌悬液假设在室温下放置，应在2小时使用；假设保存在28 在24h 使用。黑曲霉孢子悬液存在28，在验证过的贮存期用。6.2计数培养基适用性检查分别取1ml的金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌悬液，接种至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板。金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌在30-35，培养不超过3天；白色念珠菌、黑曲霉在20-25，培养不超过5天。每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进展上述试验。分别取1ml的白色念珠

5、菌、黑曲霉各菌悬液，接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基。在20-25，培养不超过5天。每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进展上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 围，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比拟，试验菌应生长良好。6.3计数方法验证洗脱液用0.9%的灭菌生理盐水，检品液制备在10000级环境中进展。按以下要求进展供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进

6、展计数方法适用性试验。1试验组 取上述制备好的供试液，参加试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。2供试品对照组 取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。3菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作参加试验菌液并进展微生物回收试验。假设因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进展方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进展进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再参加试验菌悬液进展方法适应性试验。供试液接种后，按以下“微生物回收

7、规定的方法进展微生物计数。假设试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%，可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。 增加稀释液或培养基体积。 参加适宜的中和剂或灭活剂。按照6.2的计数培养基所用的试验菌逐一进展微生物回收试验，回收试验采用平皿法和薄膜过滤法。取6个直径90mm 的无菌平皿。2个分别注入照上述“试验组制备的供试液1ml；2个分别注入照上述“供试品对照组制备的供试液1ml；2个分别注入照上述“菌液对照组制备的供试液1ml。每个平皿注入1520ml 温度不超过45熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。计算各试验组的平均菌落数。薄膜过滤法

8、所采用的滤膜孔径应不大于 0.45m,直径一般为50mm,假设采用其他直径的滤膜,冲洗量应进展相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。供试液经薄膜过滤后,假设需要用冲洗液冲洗滤膜,每滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以防止滤膜上的微生物受损伤。取照上述 “试验组、“供试品对照组和“菌液对照组制备的供试液适量一般取相当于1g、1ml 或10cm2 的供试品, 假设供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量，加至适量的稀释液中,混匀,过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。

9、每株试验菌每种培养基至少制备一滤膜。假设测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；假设测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。初始污染菌实验方法验证报告报告编号：报告时间：目录初始污染菌实验方法验证报告1、目的2、概述3、测试方法与试验结果4、结论5、重新验证条件1.目的：参照中国药典2015版，通过实验验证检测方法的适用性及计数用培养基的适用性，从而验证现在使用初始污染菌实验方法是否准确合格。2.概述：产品型号为26型：批号为：201501013.测试方法及检验结果：3.1实验设备及器材：该实验使用仪器及器具主要有：灭菌移液管及移液枪吸嘴、无

10、菌小泵管、培养皿、小型蠕动泵、薄膜过滤器、灭菌锅、百级工作台、生物平安柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。设备名称是否校量是否在有效期结论灭菌锅已校量在有效期符合要求百级工作台已校量在有效期符合要求生物平安柜已校量在有效期符合要求电子天平已校量在有效期符合要求电热恒温培养箱已校量在有效期符合要求霉菌培养箱已校量在有效期符合要求确认人/日期： 审核/日期：3.2使用材料及菌种：胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培对照养基、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌种购置单位均

11、为微生物种质资源库。3.3菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养2-3天，上述培养后的新鲜培养物用PH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml菌数小于100cfu(菌落形成的菌悬液。接种黑曲霉的培养物至沙氏葡萄糖琼脂面培养基上，2025培养57天，加人35 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法

12、吸出孢子悬液至无菌试管，用0.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml孢子数量小于100cfu的孢子悬液。菌悬液假设在室温下放置，应在2小时使用；假设保存在28 在24h 使用。黑曲霉孢子悬液存在28，在验证过的贮存期用。3.4培养基适用性检查3.4.1需氧菌的计数分别取1ml的金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌悬液，接种至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板。金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌在30-35，培养不超过3天；白色念珠菌、黑曲霉在20-25，培养不超过5天。每一试验菌株平行

13、制备2 管或2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进展上述试验。分别取1ml的白色念珠菌、黑曲霉各菌悬液，接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基。在20-25，培养不超过5天。每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进展上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 围，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比拟，试验菌应生长良好。表1参加菌种培养条件培养基菌落数cfu结论胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨琼脂对照培养基胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨琼脂对照培养基铜绿假单胞菌33,48小

14、时菌落形态大小于对照培养基上的菌落一致平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌23,72小时平均值黑曲霉平均值参加菌种培养条件培养基菌落数cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基/沙氏葡萄糖琼脂对照培养基结论沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂对照培养基白色念珠菌23,72小时菌落形态大小于对照培养基上的菌落一致平均值黑曲霉平均值结论：从以上检测结果可知，上述批号的培养基适用性检查符合要求，可用于日常产品检测中的计数。 验证人/日期： 审核/日期：3.5计数方法验证洗脱液用0.9%的灭菌生理盐水，检品液制备在10000级环境中进展。按以下要求进展供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液。所

15、加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进展计数方法适用性试验。1试验组 取上述制备好的供试液，参加试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。2供试品对照组 取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。3菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作参加试验菌液并进展微生物回收试验。假设因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进展方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进展进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供

16、试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再参加试验菌悬液进展方法适应性试验。供试液接种后，按以下“微生物回收规定的方法进展微生物计数。假设试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%，可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。 增加稀释液或培养基体积。 参加适宜的中和剂或灭活剂。按照6.2的计数培养基所用的试验菌逐一进展微生物回收试验，回收试验采用平皿法和薄膜过滤法。取6个直径90mm 的无菌平皿。2个分别注入照上述“试验组制备的供试液1ml；2个分别注入照上述“供试品对照组制备的供试液1ml；2个分别注入照上述“菌液对照组制备的供试液1ml。每个平皿注入1520ml 温度不超过4

17、5熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。表2一次性包皮环切缝合器样品1一次性包皮环切缝合器样品1一次性包皮环切缝合器样品1冲洗一次263025冲洗二次 042冲洗三次 000冲洗四次 000回收率 100%88.3%92.6%平均回收率93.7%修正系数1.07结论：以上产品各做三套平均回收率达80%以上，一次回收率到达要求。正常试验中可采用冲洗一次后*回收系数进展估算。试验人/日期： 审核/日期薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45m,直径一般为50mm,假设采用其他直径的滤膜,冲洗量应进展相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截

18、留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。供试液经薄膜过滤后,假设需要用冲洗液冲洗滤膜,每滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以防止滤膜上的微生物受损伤。取照上述 “试验组、“供试品对照组和“菌液对照组制备的供试液适量一般取相当于1g、1ml 或10cm2 的供试品, 假设供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量，加至适量的稀释液中,混匀,过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。每株试验菌每种培养基至少制备一滤膜。假设测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；假设测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂

19、培养基平板上。4.验证结论从以上检测结果可知，上述培养基适用性检测符合规定，采用的薄膜过滤法计数方法符合规定，产品初始污染菌一次冲洗回收率符合规定，上述方法适用于产品的日常检测。5.再验证周期5.1当培养基批号改变时须对计数培养基进展适用性检查5.2产品生产环境或原料发生改变时须进展计数方法的验证5.3当检测环境发生改变时须重新验证表3 产品名称实验组 一次性包皮环切缝合器菌液组菌数供试液+1ml大肠埃希菌691ml大肠埃希菌8572806583菌落回收率81.85/供试液+1ml金黄色葡萄球菌721ml金黄色葡萄球菌9076897392菌落回收率80.44/供试液+1ml枯草芽孢杆菌751ml枯草芽孢杆菌9070826879菌落回收率83.67/供试液+1ml白色念珠菌521ml白色念珠菌6456625865菌落回收率86.39/供试液+1m黑曲霉731ml黑曲霉8972907587菌落回收率82.33/供试品对照组菌落数细菌霉菌/01/20/10/结论：由上表可知个供试品实验条件下各试验菌的回收率均70，此试验计数方法有效，可用于产品初始污染菌的检测。实验人/日期 审核/日期13 / 13