第八章杂环类药物的分析报告

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1、 . . . 第八章 杂环类药物的分析 教学目的和要求一、掌握吡啶类、喹啉类、托烷类、吩噻嗪类苯并二氮杂卓类药物的鉴别和含量测定的基本原理与方法。二、本类药物中典型药物国外药典收载的鉴别和含量测定方法。三、了解本类药物的体分析方法。四、通过几章具体药物的学习及各类药物分析方法的熟悉,逐渐理解并学会药物质量标准制定方法。本章讨论化学合成的杂环类药物,选择应用比较广泛的五类杂环药物中的几个典型药物予以重点介绍：即吡啶类中的尼可刹米、异烟肼、异烟腙和丙硫异烟胺等；喹啉类中的硫酸奎宁和硫酸奎尼丁等；托烷类药物中的硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱等；吩噻嗪类中的氯丙嗪、异丙嗪、奋乃静和癸氟奋乃静等；苯骈二氮杂

2、卓类中的地西泮、阿普唑仑和氯氮卓等。第一节吡啶类药物的分析一、结构与性质 典型药物的结构 尼可刹米 异烟肼 异烟腙 丙硫异烟胺 主要化学性质 1.弱碱性本类药物母核吡啶环上的氮原子为碱性氮原子,吡啶环的pKb值为8.8水中。尼可刹米分子结构中,除了吡啶环上氮原子外,吡啶环位上被酰氨基取代,虽然酰氨基的化学性质不甚活泼,但遇碱水解后,释放出具有碱性的二乙胺,故可以此进行鉴别。2.吡啶环的特性本类药物分子结构中均含有吡啶环,可发生开环反应特性反应。尼可刹米、异烟肼和异烟腙的吡啶环、位未取代,而或位被羧基衍生物所取代,丙硫异烟胺的吡啶环位被丙基取代,而位被硫代甲酰氨基所取代。3.还原性异烟肼吡啶环位

3、上被酰肼取代,酰肼基具有较强的还原性,并可与某些含羰基的试剂发生缩合反应。除此之外,各药物具有不同的取代基团,具有不同的化学性质。二、鉴别试验 吡啶环的开环反应 1.戊烯二醛反应Konig反应当溴化氰与芳香第一胺作用于吡啶环,可形成戊烯二醛的有色喜夫氏碱类聚甲炔染料。这一反应不能由吡啶环单独发生,而是在溴化氰加到吡啶环,使环上氮原子由3价转变成5价时,吡啶环水解,形成戊烯二醛后再与芳香第一胺缩合而成。本反应适用于吡啶环、位未取代,以及或位为烷基或羧基的衍生物。异烟肼和尼可刹米均具有此反应,而中国药典只用于尼可刹米的鉴别,所用芳香第一胺为苯胺。方法 取本品1滴,加水50ml,摇匀,分取2ml,加

4、溴化氰试液2ml与2. 5 苯胺溶液3ml,摇匀,溶液渐显黄色。用于异烟肼鉴别时,应先用高锰酸钾或溴水氧化为异烟酸,再与溴化氰作用,然后再与芳香第一胺缩合形成有色的戊烯二醛衍生物。戊烯二醛衍生物的颜色随所用芳香第一胺不同而有所不同,如与苯胺缩合形成黄至黄棕色；与联苯胺则形成淡红至红色。2.二硝基氯苯反应Vongerichten反应在无水条件下,将吡啶及其某些衍生物与2, 4-二硝基氯苯混合,加热或使其热至熔融,冷却后,加醇制氢氧化钾溶液将残渣溶解,溶液呈紫红色。尼可刹米、异烟肼和异烟腙等,需经适当处理,即将酰肼氧化成羧基或将酰胺水解为羧基后才有此反应。中国药典已用于异烟腙的鉴别。用于异烟肼鉴别

5、时,可取其乙醇溶液加入硼砂及52, 4-二硝基氯苯乙醇溶液,蒸干,继续加热10min,残渣加甲醇搅拌后,即显紫红色。 形成沉淀的反应 本类药物具有吡啶环的结构,可与重金属盐类如氯化汞、硫酸铜、碘化铋钾及苦味酸等试剂形成沉淀。如尼可刹米可与硫酸铜及硫氰酸铵作用生成草绿色配位化合物沉淀。异烟肼、尼可刹米可与氯化汞形成白色沉淀。酰肼基团的反应1.还原反应银镜反应：方法取异烟肼约10mg,置试管中,加水2ml溶解后,加氨制硝酸银试液1ml,即发生气泡与黑色浑浊,并在试管壁上生成银镜。反应式如下：2.缩合反应酰肼基与芳醛缩合形成腙,析出结晶,可测定其熔点。最常用的芳醛为香草醛,其次是对二甲氨基苯甲醛、水

6、醛等与1,2萘醌4磺酸在碱性介质中可缩合显红色,凡具有NH2或活性CH2基者均有此反应。 分解产物的反应 尼可刹米+氢氧化钠试液加热二乙胺臭味,红色石蕊试纸变蓝； 丙硫异烟胺加盐酸加热硫化氢气体,醋酸铅试纸显黑色。 紫外吸收光谱特征 本类药物的紫外特征吸收鉴别方法见表。三、有关物质的检查 异烟肼中游离肼的检查 异烟肼是一种不稳定的药物,其中的游离肼是由制备时原料引入,或在贮存过程中降解而产生。而肼又是一种诱变剂和致癌物质,因此国外药典多数规定了异烟肼原料药及其制剂中游离肼的限量检查。常用的方法有薄层色谱法,比浊法和差示分光光度法。1.薄层色谱法 中国药典对异烟肼原料和注射用异烟肼中游离肼的检查

7、均采用此法。检查方法取本品,加水制成每1ml中含50mg的溶液,作为供试品溶液。 另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg相当于游离肼50g的溶液,作为对照溶液。吸取供试液10l 与对照溶液2l,分别点于同一硅胶薄层板用羧甲基纤维素钠溶液制备上,以异丙醇丙酮3:2为展开剂,展开后,晾干,喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液,15min后检视,在供试品主斑点前方与硫酸肼斑点相应的位置上,不得显黄色斑点。异烟肼斑点呈棕橙色的清晰斑点,Rf值约为0.21。游离肼斑点呈鲜黄色,Rf值约为0.3。检出限量约为0.02。本法检出肼的灵敏度为0.1g。BP亦采用本法检查游离肼及有关物质,其检查方法如下：2比浊法

8、JP13检查方法灵敏度法反应原理游离肼+水醛水醛腙优点：不用对照品,价廉、简单易行缺点：准确度差3差示分光光度法利用游离肼与对-二甲氨基苯甲醛可形成黄色缩合产物,于456nm波长处有最大吸收；而异烟肼与上述试剂形成的缩合产物在此波长处无吸收;根据这一性质,同时运用差示分光光度法,在参比溶液中加3%的丙酮,可与肼生成无色的二甲基甲酮连氮,在456nm波长处无吸收; 而异烟肼生成的缩合物在456nm波长处的吸收度与供试溶液的吸收度相等,即A456nm为零,对游离肼测定无干扰。进而,可在456nm波长处测定并计算二者的差示吸收度A456nm,同时以对照品比较法计算游离肼含量。参比溶液中丙酮含量在3%

9、时,异烟肼生成的缩合物在456nm波长处的吸收度与供试溶液的吸收度相等,即A456nm为零,对游离肼测定无干扰。若添加的丙酮量高于或低于3%时,均不能使异烟肼的A456nm为零。测定方法如下：对照品溶液的制备与测定供试品溶液的制备与测定 尼可刹米中有关物质检查-TLC高低浓度对照法练习题99：79. 下列药物中,哪一个药物加氨制硝酸银能产生银镜反应CA. 地西泮B. 阿司匹林C. 异烟肼D. 苯佐卡因E. 苯巴比妥97：132用于吡啶类药物鉴别的开环反应有B,EA. 茚三酮反应B戊烯二醛反应C坂口反应D. 硫色素反应E二硝基氯苯反应例1. ChP2000异烟肼的测定方法为AA. 溴酸钾滴定法B

10、. 溴量法C. TCLD. NaNO2E. 比色法例2. 能和2,4一二硝基氯苯发生呈色反应的药物是AA. 异烟腙B. 硫酸奎宁C. 阿莫西林D. 四环素E. 炔孕酮例3. 能和硫酸铜及硫氰酸铵反应,生成草绿色沉淀的药物为CA. 对乙酰氨基酚B. 异烟肼C. 尼可刹米D. 地西泮E.维生素E 例4. 经高锰酸钾或溴水氧化后,可发生开环形成戊烯二醛反应的药物为EA. 葡萄糖B. 皮质酮C. 维生素CD. 土酶素E. 异烟肼例5. 溴酸钾法测定异烟肼含量的方法是A,B,D,E A. 属于氧化还原滴定法 B. lmol溴酸钾相当于3/2mol的异烟肼 C. 采用永停滴定法指示终点 D. 在HCl酸性

11、条件下进行滴定 E. 还可以用于异烟肼制剂的含量测定例6. 异烟肼可由原料反应不完全或贮藏中的降解反应而引入哪种杂质DA. 间氨基酚B. 水酸C. 对氨基苯甲酸D. 游离肼E. 其他甾体例7. 可用于异烟肼鉴别的反应有A,B,EA. 与氨制硝酸银的反应B. 戊烯二醛反应C. 坂口反应D. 硫色素反应E. 二硝基氯苯反应第二节 喹啉类药物一、基本结构与化学性质1典型药物的结构 硫酸奎宁 硫酸奎尼丁 盐酸环丙沙星2主要化学性质1碱性2旋光性 硫酸奎宁为左旋体,其比旋度为-237至-244；硫酸奎尼丁为右旋体,其比旋度为+275至+290；而盐酸环丙沙星无旋光性。3荧光特性 硫酸奎宁和硫酸奎尼丁在稀

12、硫酸溶液中均显蓝色荧光,而盐酸环丙沙星则无荧光。二、鉴别试验1绿奎宁反应Thalleioquin奎宁和奎尼丁为6位含氧喹啉衍生物,可以发生绿奎宁反应。以6-羟基喹啉为例,经氯水的氯化反应,再以氨水处理,生成绿色的二醌基吲胺的铵盐,即为绿奎宁反应的基本机制。2光谱特征1紫外吸收光谱特征 中国药典采用本法鉴别盐酸环丙沙星。2荧光光谱特征 利用硫酸奎宁和硫酸奎尼丁,在稀硫酸溶液中均显蓝色荧光,而盐酸环丙沙星则无荧光的特性,可用于本类药物的鉴别或区别。3红外吸收光谱特征 硫酸奎宁和盐酸环丙沙星在中国药典在均采用红外光谱的方法进行鉴别,而硫酸奎尼丁未采用此法。3无机酸盐利用硫酸奎宁和硫酸奎尼丁中的硫酸根

13、,在酸性条件下与氯化钡反应生成白色的沉淀,即显硫酸盐的鉴别反应进行鉴别；盐酸环丙沙星中具有盐酸根,在酸性条件下与硝酸银反应生成白色的沉淀进行鉴别。三、特殊杂质检查1硫酸奎宁中特殊杂质检查根据硫酸奎宁的合成工艺,产品中特殊杂质主要是合成中产生的中间体以及副反应产物,通过检查酸度、氯仿-乙醇中不溶物和其他金鸡纳碱等加以控制。2盐酸环丙沙星中特殊杂质的检查盐酸环丙沙星在生产和贮藏过程中引入的特殊杂质,通过酸度、溶液的澄清度与颜色、有关物质等项目的检查进行控制。第三节 托烷类药物一、基本结构与化学性质1 典型药物的结构 硫酸阿托品 氢溴酸东莨菪碱2主要化学性质1水解性 阿托品和东莨菪碱分子结构中,具有

14、酯的结构,易水解。以阿托品为例,水解生成莨菪醇和莨菪酸,其反应式见教材。2碱性 阿托品和东莨菪碱的分子结构中,五元脂环上含有叔胺氮原子,因此,具有较强的碱性,易与酸成盐。如阿托品的pKb1为4.35。3旋光性 氢溴酸东莨菪碱分子结构中含有不对称碳原子,呈左旋体,比旋度为-24至-27,而阿托品结构中虽然也含有不对称碳原子,但因外消旋化而为消旋体,无旋光性。利用此性质可区别阿托品与东莨菪碱。二、鉴别试验1托烷生物碱一般鉴别试验本类药物为酯类生物碱,水解后生成的莨菪酸,经发烟硝酸加热处理,转变为三硝基衍生物,再与氢氧化钾醇溶液和固体氢氧化钾作用,则转成有色的醌型产物,开始呈深紫色。以阿托品为例,其

15、反应式见教材。2氧化反应本类药物水解后,生成的莨菪酸,可与硫酸和重铬酸钾在加热的条件下,发生氧化反应,生成苯甲醛,而逸出类似苦杏仁的臭味。其反应式见教材。3沉淀反应 本类药物具有碱性,可与生物碱沉淀剂生成沉淀。如阿托品与氯化汞醇试液反应,则生成黄色沉淀,而东莨菪碱与氯化汞醇试液反应,则生成白色复盐沉淀。4硫酸盐与溴化物反应硫酸阿托品的水溶液,加氯化钡试液,即生成白色沉淀,沉淀在盐酸或硝酸中均不溶解；加醋酸铅试液,也生成白色沉淀,但沉淀在醋酸铵或氢氧化钠试液中溶解。氢溴酸东莨菪碱的水溶液,加硝酸银试液,即生成淡黄色凝乳沉淀,沉淀能在氨试液中微溶,但在硝酸中几乎不溶；滴加氯试液,溴即游离,加氯仿振

16、摇,氯仿层显黄色或红棕色。三、氢溴酸东莨菪中特殊杂质检查氢溴酸东莨菪碱是从茄科植物颠茄、白曼陀罗、莨菪等中提取得到的莨菪碱的氢溴酸盐。我国是从茄科植物白曼陀罗的干燥品洋金花中提取东莨菪碱,然后制成氢溴酸盐。根据其制备工艺,本品在生产和贮藏过程中可能引入的特殊杂质,通过酸度、其他生物碱和易氧化物检查进行控制。第四节吩噻嗪类药物的分析一、基本结构与化学性质结构特点与典型药物 吩噻嗪类药物分子结构中具有共同的硫氮杂蒽母核,基本结构如下：结构差异：母核2位上的R取代基,通常为H、Cl、CF3、COCH3、SCH2CH3等；10位上的R取代基,则为具有2-3个碳链的二甲或二乙胺基,或为含氮杂环如哌嗪和哌

17、啶的衍生物等。临床上使用的本类药物多为其盐酸盐.奋乃静 癸氟奋乃静盐酸氟奋乃静 盐酸三氟拉嗪 盐酸二氧丙嗪 主要化学性质 1.具有紫外和红外吸收光谱特征本类药物的紫外特征吸收,主要由母核三环的系统所产生。一般具有三个峰值,即在204nm209nm205nm附近、250nm265nm254nm附近、和300nm325nm300nm附近。 最强峰多在250nm265nm为2.51043104；两个最小吸收峰则在220nm及280nm附近。2位上的取代基R不同,会引起吸收峰发生位移。例如2位上卤素的取代Cl及CF3可使吸收峰向红移2nm4nm,同时会使250nm265nm区段的峰强度增大。R 引起吸

18、收峰位移,可能是通过对位效应影响三环系统的S,而间位效应又影响三环系统的N所发生的。因此,利用其紫外特征吸收可进行本类药物的鉴别。本类药物母核的硫为二价,易氧化,其氧化产物为亚砜及砜,与未取代的吩噻嗪母核的吸收光谱有明显不同,它们具有四个峰值见图7-3 中 2,3。因此,可以利用紫外吸收光谱的这些特征测定药物中杂质氧化物存在的量；同时也可在药物含量测定时对氧化产物的干扰进行校正。 吩噻嗪类药物取代基R和R的不同,产生不同的红外吸收光谱,国外药典已用于本类药物较多品种的鉴别。2.易氧化呈色 吩噻嗪类药物遇不同氧化剂例如硫酸、硝酸、三氯化铁试液及过氧化氢等,其母核易被氧化成自由基型产物和非离子型产

19、物砜、亚砜、3羟基吩噻嗪等不同产物,随着取代基的不同,而呈不同的颜色。可用于鉴别3.与金属离子络合呈色母核中未被氧化的S原子,可与金属离子如Pd2+形成有色络合物,其氧化产物砜和亚砜则无此反应。利用此性质可进行鉴别和含量测定,并具有专属性,可排除氧化产物的干扰。二、鉴别试验紫外特征吸收和红外吸收光谱 国外药典中常利用本类药物紫外吸收光谱中的max、min进行鉴别；以及同时利用最大吸收的吸收度或百分吸收系数进行鉴别。表7-3列出我国药典中吩噻嗪类药物的紫外特征吸收数据。中国药典用IR鉴别的有：奋乃静、癸奋乃静、盐酸三氟拉嗪和盐酸二氧丙嗪等药物。显色反应 1.氧化剂氧化显色吩噻嗪类药物可被不同氧化

20、剂如硫酸、硝酸、过氧化氢等氧化而呈色,反应情况列于表。2.与钯离子络合显色吩噻嗪类药物分子结构中的未被氧化的二价能与金属钯离子络合形成有色络合物,如与癸氟奋氖静形成红色的络合物。分解产物的反应 三、有关物质检查盐酸异丙嗪合成工艺与杂质的来源1.合成工艺2.杂质的来源异丙嗪合成过程中易产生以下副反应：中间体1-二甲氨基-2-氯丙烷在强碱性条件下,能形成中间体季铵离子,由于亲核性进攻,转位成2-二甲氨基碳正离子,水解为2-二甲基-1-丙醇。异构体盐酸盐在丙酮中溶解度大,多留存在母液中,虽经丙酮精制步骤的处理,但也难以除掉,加上吩噻嗪母体,均可带入成品药物中。此外,异丙嗪不太稳定、易氧化,因其贮存不

21、当或存放时间过长,可能会产生分解产物。因此,采用薄层色谱法高低浓度对比法检查,上述异构体、吩噻嗪母体及分解产物等杂质均能检出,检出灵敏度为0.5g。检查方法 取本品,加二氯甲烷制成每1ml中含10mg的溶液,作为供试品溶液；精密量取适量,加二氯甲烷制成每1ml中含0.15mg和0.05mg的溶液,作为对照溶液和。吸取上述三种溶液各10l,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以己烷-丙酮-二乙胺为展开剂,展开后,晾干,置紫外光灯下检视,供试品溶液如显杂质斑点,不得多于3个；其杂质斑点与对照溶液的主斑点比较,不得更深；如有一点超过,应不得深于对照溶液的主斑点。注意点：异丙嗪遇光不稳定,上述检查应在

22、避光条件下操作;溶液应临用时配制,否则杂质斑点增多。练习题95：131盐酸氯丙嗪的含量测定方法有B,C,EA. 中和法B. 非水滴定法C. 紫外法D. 旋光法E. 铈量法99x：87. 中国药典1995年版对盐酸异丙嗪注射液的含量测定,选用299nm波长处测定,其原因是C A. 299nm处是它的最大吸收波长 B. 为了排除其氧化产物的干扰 C. 为了排除抗氧剂的干扰 D在299nm处,它的吸收系数最大 E. 在其他波长处,因其无明显吸收99x：78. 有氧化产物存在时,吩噻嗪类药物的鉴别或含量测定方法为DA. 非水溶液滴定法B. 紫外分光光度法C. 荧光分光光度法D. 钯离子比色法E. pH

23、指示剂吸收度比值法例1. 中国药典中地西泮原料药中2-甲氨基-5-氯二苯酮的检查法为A. TLCB. HPLCC. GCD. 沉淀法E. 显色法例2. 检查盐酸氯丙嗪中有关物质时,采用的对照溶液为A. 杂质的标准溶液B. 标准有关物质溶液C. 供试品溶液D. 供试液的稀释溶液E. 对照溶液例3. 某药物于酸性溶液中,加硫酸铈试液则产生红色,继续滴加硫酸铈试液,红色由浅变深,继由深又变浅直至红色消失,该药物应为A. 雌二醇B. 氯丙嗪C. 诺氟沙星D. 硫酸镁E. 苯巴比妥钠例4. 吩噻嗪类药物与钯离子反应,需在以下哪种酸性条件下进行CA. pH4B. pH33.5C. pH20.1D. pH1

24、E. pH5 第五节苯骈二氮杂卓类药物一、结构特征与典型药物苯骈二氮杂卓类药物为含氮杂原子、六元和七元环并合而成的有机化合物,其中1,4-苯骈二氮杂卓类药物是目前临床应用最广泛的镇静剂。因此,本节主要介绍该类药物的分析。中国药典收载的品种有安定、硝基安定、艾司唑仑和氯氮卓。95年版又增加了阿普唑仑、三唑仑、盐酸氟西泮、氯硝西泮和奥沙西泮等药物,并将安定和硝基安定更名为地西泮和硝西泮。上述药物除了氯氮卓外,均为地西泮的衍生物。从药品质量控制方法具有代表性出发,以下重点阐述地西泮、阿普唑仑和氯氮卓等药物的分析。典型药物的结构为: 环庚三烯 卓地西泮 阿普唑仑 氯氮卓本类药物结构中,二氮杂卓七元环上

25、氮原子具有强的碱性,苯基并合后使碱性降低,致使含量测定需用非水溶液滴定法。本类药物的pKa值与其在不同pH介质中形成不同的分子形式有关,而分子形式影响其光谱特性,可利用此特性进行鉴别或含量测定。本类药物结构中的环在强酸性溶液中可水解,形成相应的二苯甲酮衍生物,其水解产物所呈现的某些特性也可供鉴别或含量测定之用。二、鉴别试验 化学反应 1. 沉淀反应氯氮卓 ChP2000鉴别2取本品约10mg,加盐酸溶液9100010ml 溶解后,加碘化铋钾试液 1 滴,即生成橙红色沉淀。阿普唑仑 ChP2000鉴别 1取本品约 5mg,加盐酸溶液910002ml 溶解后,分为两份：一份加硅钨酸试液 1 滴,即

26、生成白色沉淀；另一份加碘化铋钾试液 1 滴,即生成橙红色沉淀。2. 水解后重氮化-偶合反应氯氮卓、艾司唑仑和奥沙西泮的盐酸溶液,缓缓加热煮沸,放冷,加亚硝酸钠和碱性-萘酚试液,生成橙红沉淀,而后者放置色渐变暗。氯氮卓 ChP2000鉴别 1取本品约 10mg,加盐酸溶液1215ml,缓缓煮沸 15 分钟,放冷,溶液显芳香第一胺类的鉴别反应附录。3. 硫酸-荧光反应苯骈二氮杂卓类药物溶于硫酸后,在紫外光下,呈现不同颜色的荧光。如地西泮为黄绿色；氯氮卓为黄色；艾司唑仑呈现亮绿色；硝西泮则显淡蓝色。若在稀硫酸中反应,其荧光颜色略有差别。4. 分解产物的反应 上述列举的本类药物均为有机氯化合物,用氧瓶

27、燃烧法破坏,生成氯化氢,以5%氢氧化钠溶液吸收,加硝酸酸化,显氯化物反应。中国药典仅用于地西泮和三唑仑药物的鉴别。 紫外和红外吸收光谱 薄层色谱法 苯骈二氮杂卓类药物发展很快,目前临床应用的品种不断增多。由于本类药物结构相似,不易分离、鉴别,因此薄层色谱法常被用于本类药物的系统鉴别。1. 常用的五种苯骈二氮杂卓类药物的TLC法 按常规法点样10l于硅胶G薄层板上,以苯-丙酮展开剂,饱和15min,用上行法展开15cm,挥散溶剂,用稀硫酸喷雾,于105干燥30min,置紫外灯下检视荧光斑点,结果见表。2. 酸水解产物的TLC法利用苯并二氮杂桌类药物经酸水解产生的二苯甲酮衍生物进行鉴别。由于不同的

28、苯骈二氮杂桌类药物水解后可能会获得相同的二苯甲酮衍生物,因此本法的专属性较差。但有的如三唑仑、阿普唑仑等,经酸水解后不产生二苯甲酮的衍生物。利用这特点,本法可用于体液中本类药物的鉴别。三、有关物质和降解产物的检查苯骈二氮杂卓类药物由于生产工艺过程或贮藏期间出现分解,致使药物中存在中间体、副产物等杂质和降解产物。目前国外药典多采用薄层色谱法进行有关物质和降解产物的检查。而用高效液相色谱法,检查本类药物质量的报道,也在逐年增多。第六节 含量测定本节选择上述常用的五类杂环药物中的典型药物,从其化学结构、理化特性等方面,讨论药物结构与含量测定的关系。简介常用含量测定方法的原理、条件及其应用特点。一非水

29、溶液滴定法1基本原理采用非水溶液滴定法测定本类药物时,上述所列药物除了尼可刹米、地西泮和氯氮卓等,以游离碱的形式供分析外,多数为盐酸盐和硫酸盐。这些盐类的滴定过程,实际上是一个置换滴定,即强酸滴定液置换出与游离碱结合的较弱的酸。其反应原理可用下列通式表示：式中BH+A-表示游离碱类盐；HA表示被置换出的弱酸。由于被置换出的HA的酸性强弱不同,因而对滴定反应的影响也不同。当HA酸性较强时,反应不能定量完成,根据化学反应平衡的原理,必须采取措施,除去或降低滴定反应产生的HA的酸性,使反应顺利地完成。因此,必须根据不同情况采用相应的测定条件。2一般方法取经适当方法干燥的供试品适量其量一般以消耗标准液

30、约8ml为度,加冰醋酸10ml30ml必要时可温热使溶解,放冷。若供试品为氢卤酸盐,应再加5%醋酸汞的冰醋酸溶液3ml5ml,用高氯酸滴定液0.1mol/L滴定至终点,并将滴定结果用空白试验校正。3问题讨论1适用围 本法主要用于Kb10-8的有机碱盐,如有机酸盐、氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐及有机酸碱金属盐类的含量测定。2酸根的影响 本类药物盐中被置换出的无机酸类,在醋酸介质中的酸性以下列排序递减：高氯酸氢溴酸硫酸盐酸硝酸若在滴定过程中被置换出的HA,其酸性较强,则反应将不能进行到底,如测定杂环类药物氢卤酸盐时,由于被置换出的氢卤酸的酸性相当强,影响滴定终点,不能直接滴定,需要进行处理。一

31、般处理方法是加入定量的醋酸汞冰醋酸溶液,使其生成在醋酸中难解离的卤化汞,以消除氢卤酸对滴定的干扰与不良影响：2BHX + Hg2 2BHAc + HgX2当醋酸汞加入量不足时,可影响滴定终点,而使测定结果偏低,但过量的醋酸汞并不影响测定结果。3滴定剂的稳定性 本类药物的非水溶液滴定法所用的溶剂为醋酸,具有挥发性,且膨胀系数较大,因此温度和贮存条件都影响滴定剂的浓度。若滴定样品时与标定高氯酸溶液时的温度不一致,而且温差未超过10时,应将高氯酸滴定液的浓度用下列公式加以校正：式中：0.0011为冰醋酸的体积膨胀系数,t0为标定时的温度,t1为滴定时的温度,N0为t0时高氯酸滴定液的浓度,N1为t1

32、时高氯酸滴定液的浓度。若滴定样品时与标定高氯酸溶液时的温差超过10时,则应重新标定。4终点指示方法 非水溶液滴定法的终点确定,常用电位法和指示剂法。中国药典收载的本类药物大多采用结晶紫指示剂指示终点,少数采用电位法指示终点。4应用实例1游离弱碱性药物测定 吡啶类、苯并二氮杂卓类药物,临床上多以游离碱状态作为药用,如异烟肼、尼可刹米、地西泮及氯氮卓等。基于这些药物分子结构中氮原子的弱碱性,可用非水溶液滴定法直接测定其含量。由于这些药物的碱性强弱不同,因此测定时所采用的溶剂、指示剂及其指示终点的方法也不尽相同。其测定方法及其主要条件见表8-7。2氢卤酸盐类药物测定 吩噻嗪类药物,临床上使用的多为其

33、盐酸盐,如盐酸氯丙嗪、盐酸异丙嗪、盐酸氟奋乃静、盐酸硫利达嗪等。喹啉和托烷类药物,临床上使用的也有其盐酸盐和氢溴酸盐,如盐酸环丙沙星、氢溴酸东莨菪碱等。当这些药物溶于冰醋酸时,由于氢卤酸在冰醋酸中酸性较强,对测定有干扰,必须先加入过量的醋酸汞冰醋酸溶液,使其形成难以电离的卤化汞,而氢卤酸盐药物,则转变成可测定的醋酸盐。然后再用高氯酸滴定液滴定,并可获得满意的结果。本类药物的测定方法见表8-8。3硫酸盐类药物测定 硫酸是二元酸,在水溶液中能完成二级解离,生成SO42-,但在非水介质中,只显示一元酸解离为HSO4-,即只供给一个H+,所以硫酸盐类药物在冰醋酸中,只能滴定至硫酸氢盐,因此可以用高氯酸

34、滴定液直接滴定。采用非水溶液滴定法,以高氯酸滴定液直接滴定硫酸盐类药物时,需注意本类药物的化学结构,正确判断反应的摩尔比,才能准确地计算出试验结果。现以硫酸阿托品和硫酸奎宁为例,简述其测定方法的基本原理与操作。1硫酸阿托品测定：阿托品为碱性较强的一元碱药物,因而硫酸阿托品的化学结构式可以简写为2SO42 -,用高氯酸直接滴定时的反应式为：2SO42- + HClO4 ClO4- + HSO4-因此,可根据1mol的硫酸阿托品消耗1mol高氯酸的关系计算其含量。2硫酸奎宁测定：奎宁为二元碱,其中喹核碱的碱性较强,可与硫酸生成盐；而喹啉环的碱性极弱,不能与硫酸成盐,而保持游离状态。当用高氯酸直接滴

35、定硫酸奎宁时,1mol的硫酸奎宁消耗3mol的高氯酸。其反应式如下：2SO4 + 3HClO42ClO4- +HSO4-ClO4-中国药典和USP都采用此法测定硫酸奎宁和硫酸奎尼丁的含量。3硫酸奎宁片的测定：硫酸奎宁片剂碱化处理,生成奎宁游离碱,然后再用高氯酸标准溶液直接滴定。此时1摩尔的硫酸奎宁可消耗4摩尔的高氯酸,因此片剂分析的滴定度与原料药分析的滴定度不同。4硝酸盐的测定 硝酸在冰醋酸介质中酸性不强,滴定反应可以进行完全。但是硝酸具有氧化性可以破坏指示剂使其变色,使指示剂无法指示终点。因此采用非水溶液滴定法测定硝酸盐时,一般不用指示剂法而用电位法指示终点。5磷酸盐与有机酸盐 磷酸与有机酸

36、在冰醋酸介质中酸性极弱,不影响滴定反应的定量完成,可以按常规方法直接滴定。二铈量法铈量法是药物分析中常用的氧化还原方法之一,但上述所列各类药物中,仅有硝苯地平和吩噻嗪类药物可采用此法进行含量测定。基于这些药物具有还原性,在酸性介质中可以用硫酸铈滴定液直接滴定。前者用邻二氮菲指示剂指示终点；后者利用药物自身的颜色变化指示终点。1硝苯地平的测定基本原理 硝苯地平的测定原理,可用下列反应式表示：终点时,微过量的的Ce4+将指示剂中的Fe2+氧化成Fe3+,使橙红色配合物离子呈淡蓝色或无色配位化合物离子,以指示终点的到达。2吩噻嗪类药物的测定基本原理是利用吩噻嗪类药物被硫酸铈滴定时,先失去一个电子形成

37、一种红色的自由离子,达到化学计量点时,溶液中的吩噻嗪类药物均失去两个电子,而红色消褪,借以指示终点。此法也可采用电位法或永停法指示终点。其反应简式如下：三比色法1酸性染料比色法1基本原理 在适当的介质中,碱性药物B可与氢离子结合成阳离子BH+,而一些酸性染料,如溴百里酚蓝、溴酚蓝、溴甲酚紫和溴甲酚绿等,可解离成阴离子In -。上述的阳离子与阴离子定量地结合成有色络合物BH+In -离子对,可以定量地被有机溶剂提取,在一定波长处测定该溶液有色离子对的吸收度,即可以计算出碱性药物的含量。其反应平衡简式如下：也可将呈色的有机溶剂经碱化如加入醇制氢氧化钠,使与有机碱结合的酸性染料释放出来,测定其吸收度

38、,再计算出碱性药物的含量。2影响因素 酸性染料比色法的影响因素较多,如水相的pH,酸性染料的种类和有机溶剂的种类与性质都影响测定结果。现分别简单讨论之。1水相最佳pH值的选择：本法中水相的pH选择极为重要,只有选择合适的pH使有机碱性药物均成阳离子BH+,而同一pH条件下,酸性染料电离足够的阴离子In -,阴阳离子才能定量生成离子对,并完全溶于有机溶剂中,而过量的染料完全保留在水相中,才能保证定量的测定。从上述平衡简式可知,如pH过低,抑制了酸性染料解离,使In-浓度太低,而影响离子对的形成；如pH过高,有机碱药物呈游离状态,使离子对的浓度也很低。因此,选择一个最佳pH值应使有机碱药物和酸性染

39、料全部以BH+和In-状态存在,是酸性染料比色法至关重要的试验条件。其选择方法一般根据有机药物和酸性染料的pK值,以两相中分配系数而定。2酸性染料及其浓度：可用于本法的酸性染料较多,而所选用的酸性染料,不但能与有机碱药物定量地结合,而且生成的离子对在有机相中溶解度大,染料在有机溶剂中不溶或很少溶解；同时要求生成的离子对,于其最大吸收波长处有较高的吸收度。常用的酸性染料有溴麝香草酚蓝、甲基橙、溴甲酚绿等。中国药典中,托烷类药物含量测定,所选用的酸性染料为溴甲酚绿。酸性染料的浓度,一般认为对测定结果影响不大,只要有足够量即可。增加酸性染料的浓度 可以提高测定的灵敏度。但如果浓度太高,则易产生严重的

40、乳化层,且不易去除,往往影响测定结果。3有机溶剂的选择：应选择对有机碱药物与酸性染料形成的离子对提取率高,不与或极少与水混溶,或能与离子对形成氢键的有机溶剂作为溶剂。常用的有机溶剂有氯仿、二氯甲烷、二氯乙烯、苯、甲苯、四氯化碳等。其中以氯仿最为常用,是理想的溶剂。氯仿能与离子对形成氢键,提取率较高,选择性好,在水中溶解度小,且混溶的微量水分易于除去。其次是二氯甲烷、二氯乙烯、苯等。4水分的影响：在提取过程中,严防水分混入有机溶剂中,一则水相中有过量的有色酸性染料,而影响测定结果；二则水分的混入使氯仿混浊,而影响比色测定。一般多采用加入脱水剂,或经滤纸过滤的方法,除去混入的水分。另外,酸性染料中

41、有杂质混入提取的有机相中,使测定结果受到干扰。为了获得准确结果,可在加入供试品之前,将缓冲液与酸性染料的混合液先用所选用的有机溶剂提取,以便除去酸性染料中的有色杂质。3应用示例 中国药典用本法测定含量的药物有硫酸阿托品片、氢溴酸东莨菪碱片和氢溴酸山莨菪碱片等。现仅介绍氢溴酸东莨菪碱片的含量测定。2钯离子比色法基本原理是利用吩噻嗪类药物,在适当pH值溶液中可与金属钯离子形成有色络合物反应式见本章第四节的鉴别试验,借以进行比色测定。如丙嗪、氯丙嗪、异丙嗪,在pH20.1的缓冲溶液中,可与钯离子Pd2+形成红色络合物。10min后呈色完全,呈色可稳定2h左右,并在500nm波长附近具有最大吸收,最适

42、宜的测定围为50-250g。本法可选择性地用于未被氧化的吩噻嗪类药物的测定。因为钯离子只与未被氧化的硫共价,当硫原子已被氧化为亚砜或砜时,则不与钯离子呈色,因此可利用空白试验对照的方法,消除本类药物中的氧化物的干扰。三紫外分光光度法本章所列举的五类药物,原料药仅奥沙西泮采用本法,而其他药物的制剂或片剂均匀度与溶出度的测定均采用本法。其测定原理是基于这些药物具有紫外特征吸收光谱,在其最大吸收波长处测定吸收度,利用百分吸收系数计算；或与对照品溶液同时测定,计算含量。现介绍几种不同类型的应用实例。1直接分光光度法供试品不需要提取分离,溶于适当的溶剂中即可进行含量测定。1奥沙西泮的测定 取本品约15m

43、g,精密称定,置200ml量瓶中,加乙醇150ml,于温水浴中加热,并时时振摇,使奥沙西泮溶解,放冷,用乙醇稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置100ml量瓶中,用乙醇稀释至刻度,摇匀,在229nm的波长处测定吸收度；另精密称取奥沙西泮对照品约15mg,同法操作并测定；计算,即得。2盐酸异丙嗪片的测定 取本品10片,除去糖衣后,精密称定,研细,精密称取适量约相当于盐酸异丙嗪12.5mg,置200ml量瓶中,加盐酸溶液91000适量,振摇15min使盐酸异丙嗪溶解,再用盐酸溶液91000稀释至刻度,摇匀,在249nm的波长处测定吸收度,按C17H20N2SHCl的吸收系数为910计算,即得。3盐

44、酸异丙嗪注射液的测定1测定波长的选择：盐酸异丙嗪注射液处方加有维生素C作抗氧剂,可还原异丙嗪红色自由基氧化产物,从而防止异丙嗪氧化变色,其反应机理如下：采用紫外分光光度法测定时,因维生素C在盐酸异丙嗪最大吸收波长249nm处有吸收,干扰注射液的测定。因此,不能选用249nm作为盐酸异丙嗪注射液的测定波长。而选用299nm波长测定盐酸异丙嗪注射液的含量时,维生素C在此波长处则不产生干扰。2测定方法：精密量取本品2ml,置100ml量瓶中,用盐酸溶液91000稀释至刻度,摇匀,精密量取10ml,置另一100ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,于1cm吸收池中,在299nm的波长处测定吸收度,按C17

45、H20N2SHCl的吸收系数为108计算,即得。2萃取后分光光度法盐酸氯丙嗪注射液的含量测定,除了上述采用选择299nm波长直接分光光度法消除处方中维生素C的干扰外,还可以利用萃取后分光光度法进行测定。1测定原理 利于盐酸氯丙嗪在碱性介质中,氯丙嗪转化为游离碱,被有机溶剂乙醚定量提取,然后将氯丙嗪的乙醚提取液,用盐酸溶液提取,使氯丙嗪再转化为盐酸氯丙嗪,在2541nm波长处进行测定。经过两次萃取使盐酸氯丙嗪与注射液处方中其他组分得到了分离,以消除对测定的干扰,使测定结果更准确。2测定方法 精密量取本品适量约相当于盐酸氯丙嗪100mg,以盐酸液0.1mol/L稀释至500ml。分取上述溶液5ml

46、,置分液漏斗中,加水20ml,加氨水呈碱性,用乙醚振摇提取4次,每次25ml。合并乙醚液,用水洗涤2次,每次10ml,合并洗液,用乙醚20ml提取,弃去洗液。合并前后两次得到的乙醚液,分四次用盐酸液萃取,每次25ml。合并酸液,并稀释成0.0005%浓度的溶液。以盐酸液0.1mol/L作空白,用分光光度计在2541nm波长处进行测定,以盐酸氯丙嗪为915,计算供试品中盐酸氯丙嗪的量,即得。3萃取-双波长分光光度法本法是USP24收载的方法,用于盐酸氯丙嗪注射液的含量测定,主要用来校正样品中氧化物对测定的干扰。1测定原理 利用氯丙嗪的最大吸收波长为254nm,其氧化物在此波长也有吸收,同时在27

47、7nm波长处氧化物也有吸收,且其吸收度与其在254nm波长处的吸收度相等,而氯丙嗪在此波长无吸收。因此,可由两波长处测得吸收度之差计算氯丙嗪的含量。2测定方法 精密量取盐酸氯丙嗪注射液适量约相当于盐酸氯丙嗪100mg,置500ml量瓶中,加盐酸液0.1mol/L稀释至刻度,摇匀；精密量取10ml,置250ml分液漏斗中,加水20ml,用浓氨溶液碱化。用乙醚提取4次,每次25ml。合并乙醚液,用盐酸液0.1mol/L提取4次,每次25ml。合并酸提取液于250ml量瓶中,通入空气驱尽残留乙醚,加盐酸液0.1mol/L至刻度,摇匀,作为供试品溶液；另取盐酸氯丙嗪对照品适量,精密称定,用盐酸液0.1

48、mol/L溶解并稀释制成8g/ml的对照品溶液,以盐酸液0.1mol/L为空白,分别于254nm及277nm波长处同时测定上述供试品溶液与对照品溶液的吸收度,按下式计算：盐酸氯丙嗪含量mg/ml=12.5Cu/Vs式中,12.5为稀释体积及浓度单位换算因数,C为对照品溶液浓度,V为取样量ml,U表示供试品溶液,S表示对照品溶液。4二阶导数分光光度法盐酸氯丙嗪注射液中常添加亚硫酸盐和维生素C作为抗氧剂。在紫外光谱区抗氧剂的吸收谱带与盐酸氯丙嗪吸收谱带重叠,干扰测定。上述采用碱化后乙醚萃取-分光光度法、双波长分光光度法,可以消除其干扰,但操作繁琐,被测组分因经两次提取易损失,致使测定精密度不高,准

49、确度较差。采用二阶导数光谱法,不但可消除抗氧剂的干扰,而且提高了测定的精密度和灵敏度。其测定方法如下：1光谱绘制 2线性关系 3试品测定 四气相色谱法气相色谱法是一种有效的分离技术,它具有分离效果好、灵敏度高、选择性好、用样量少和分析速度快等特点,特别适合组分比较复杂的供试品中微量有机药物及其代物的分离测定。由于绝大多数药物极性较大,不易气化,或者对热不稳定,因此该法在药物分析中的应用不如高效液相色谱法多。现以硫酸阿托品片和人血浆中硝苯地平的气相色谱法为例,简述该法在杂环类药物分析中的应用。1硫酸阿托品片的含量测定硫酸阿托品是杂环类药物中的托烷类药物,其含量测定方法,USP24采用气相色谱法。

50、有些有机碱类药物,包括有机碱的游离碱及其盐,均可直接进行气相色谱分析。其盐类在约325的急速加热器中可以解离变成游离有机碱,然后进样分析。因此无论注入的是游离碱还是盐类都只能得一个游离碱的色谱峰。但应注意,生物碱盐类解离后所生成的酸对色谱柱和检测器会有不良的影响,故一般均将生物碱盐的水溶液先碱化,用有机溶剂提取游离碱后,以游离碱的形式进行分析。1测定原理 硫酸阿托品片的含量测定中,以后马托品作为标物,与供试品粉末混合,在pH9.0的条件下用二氯甲烷提取标物和阿托品,将提取液过滤、脱水和浓缩后,注入气相色谱仪。同时将硫酸阿托品溶液加标照上法处理,进气相色谱分析,通过对照品峰与供试品峰的相应值及对

51、照品的浓度,即可求得供试品中硫酸阿托品的含量。 测定方法1标溶液的制备：精密称取氢溴酸后马托品约25mg,加水溶解并稀释至50ml。此溶液应每日新配制。2供试品溶液与对照品溶液的制备：取硫酸阿托品片剂20片,精密称定,研细,精密称取约相当于1.0mg硫酸阿托品的片粉,加pH9.0的磷酸缓冲液5ml和标液2.0ml,加氢氧化钠液1mol/L调节至pH9.0,用二氯甲烷提取两次每次用10ml,合并二氯甲烷提取液,通过盛有无水硫酸钠1g的小漏斗漏斗颈有一小团棉花过滤脱水,将滤液在氮气流下蒸干,残渣用二氯甲烷2.0ml溶解作为供试品溶液。另精密称取硫酸阿托品对照品约10mg,置100ml量瓶中,加水溶

52、解并稀释至刻度,取此溶液10.0ml,从加pH9.0的磷酸缓冲液5ml开始,照上法操作,最后加二氯甲烷2.0ml溶解残渣,作为对照品溶液。3色谱系统：色谱柱为1.8m2mm的玻璃柱；担体为与碳酸钠混合于900熔融后,经酸和碱处理的硅烷化藻土；固定相为3%的OV-17即50%甲基,50%苯基的聚硅氧烷；载气为氮气,流速为25ml/min；检测器为氢火焰离子化检测器。4系统适用性试验：取对照品溶液1l,连续进样6次,记录色谱峰面积,应符合下列规定：6次所得的对照品和标峰面积之比的RSD不大于2.0%；对照品峰和标峰的分辨率Rs不小于4.0；色谱峰的拖尾因子不大于2.0。5测定方法：取供试品溶液和对

53、照品溶液各1l注入气相色谱仪,记录各色谱峰面积,用下式计算所取片粉中硫酸阿托品2H2SO4H2O的重量:2H2SO4H2O的重量=式中：694.85为含1mol结晶水的硫酸阿托品的分子量； 67683为无水的硫酸阿托品的分子量；W为配制对照品溶液中硫酸阿托品对照品的重量； Ru为供试品溶液所得的硫酸阿托品峰对标峰的峰面积比值；Rs为对照品溶液所得的硫酸阿托品峰对标峰的峰面积比值。2人血浆中硝苯地平的气相色谱法测定及药代动力学研究1测定原理 本法以地西泮作为标,用甲苯提取人血浆中的硝苯地平和标物。分离甲苯层,于60水浴上用氮气流吹干,残渣以乙酸乙酯溶解后进样分析。以硝苯地平的浓度对硝苯地平和标峰

54、面积比值进行线性回归,建立回归方程,即可以外标法测得血浆中硝苯地平的含量。2色谱条件 OV-101石英毛细管柱25m0.25mm；载气和补充气均为高纯氮气,柱前压为196kPa,补充气流速为35ml/min。操作温度,进样器为240,检测器为300,柱初始温度为150,维持80s,立即以40/min升到250,维持10min。进样方式,不分流进样,进样时间1s,进样后80s,启动分流阀。3血样前处理 精密取人血浆样品1.0ml,置具塞离心管已加标地西泮50l并于水浴上氮气吹干中,涡旋混合3min,加甲苯2ml,提取10min,离心10min3500r/min,分离甲苯层,于60水浴上用氮气流吹

55、干,残渣以乙酸乙酯50l溶解,取1l进样分析。4人血浆中硝苯地平的标准曲线 依次精密取硝苯地平标准液50.2g/ml4、8、20、60、120、180、240、300l分别置于5ml具塞离心管中,各加标液603ng/ml50l,于水浴上氮气吹干后加入1ml人血浆,混匀。按血样处理方法操作。血浆中药物浓度2ng/ml150ng/ml与硝苯地平和标峰面积比成线性关系,回归方程为；Y=0.05367 + 0.02054X,r = 0.9988n = 4,RSD = 7.12%。5精密度试验 按人血浆中硝苯地平的标准曲线方法配制4、60和120ng/ml硝苯地平血浆样品,按血样处理方法操作,分别于一天

56、和一周进样数次,求其日相对标准偏差为4.4%、5.9%、9.0%n = 4；日间相对标准偏差为5.3%、7.5%、9.1%n = 5。6稳定性试验 硝苯地平为光敏性化合物,在日光照射下易分解。本试验考察了硝苯地平在日光照射和暗室中红灯下的稳定性,日光下8小时硝苯地平浓度从59.03ng/ml降至2.03ng/ml,但在暗室红灯下则基本稳定。本实验均在暗室红灯下进行。7硝苯地平的药代动力学研究 选择男性志愿者8名,年龄21岁22岁,身高1.70m1.80m,体重60kg65kg,服药前一周及服药期间禁服任何药物；随机分为两组,进行交叉实验,分别服用自制缓释片和进口缓释片,剂量为40mg,给药后的

57、血药浓度-时间曲线符合二房室模型。应用PKBP-NI程序包微机处理,不同模型拟合结果,自制缓释片和进口缓释片均以二房室模型拟合较为理想。按二房室模型计算药代动力学参数。六高效液相色谱法高效液相色谱法,在杂环类药物的含量测定中,应用越来越广泛,其中80%以上是采用反相高效液相色谱法。利用本法可以十分有效地分离和测定本类药物及其分解产物。USP24收载的本类药物有数十个品种采用本法测定,而本章典型药物在我国药典仅用于地西泮注射液的含量测定。1反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法,是指流动相的极性大于固定相极性的色谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固定相,即在硅胶表面,利用硅醇基的活性与有机硅烷反

58、应,使硅烷基键合在硅胶表面,如键合为十八烷基时,则形成常用的十八烷基硅烷键合硅胶ODS。在硅胶表面引入硅烷基形成的固定相极性很弱,而流动相系统,多采用水-甲醇或水-乙腈系统,极性较强。在反相色谱中,极性强的组分在分离时先流出柱子,极性弱的组分后流出柱子,因此适合于共存组分极性差异较大样品的分析。用化学键合固定相分离碱性杂环类药物时,由于在硅胶表面的硅醇基受空间位阻的影响,仅有一部分的硅醇基可与硅烷化试剂作用。因此这些裸露的硅醇基与碱性药物发生吸附或离子交换作用,而使碱性药物色谱峰产生拖尾,分离效能下降,保留时间过长,甚至不能被洗脱。为解决这个问题,通常在流动相中加入碱性试剂,使流动相的pH为7

59、8左右,使碱性药物的电离受到抑制,以非电离形式存在,增加脂溶性改善分离效能。目前常用的碱性试剂有二乙胺、三乙胺等。但使用此类方法时应注意,流动相的pH值不能太高,否则可造成化学键合的固定相水解,一般化学键合固定相允许流动相的pH围为28。现以具体示例简述该法的应用。1地西泮注射液的反相HPLC法 地西泮注射液曾用萃取后分光光度法测定含量,因萃取不完全,及有关物质和分解产物等对测定有干扰,故中国药典自1995版改用HPLC法。此法操作简便,可消除干扰见色谱分离图8-7。注射液中地西泮的平均回收率为99.4%,相对标准偏差为0.8%。1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇

60、-水7030为流动相；检测波长为254nm 。理论板数按地西泮计算应不低于1500,地西泮峰和标物质峰的分离度大于1.5。2标溶液的制备：取萘50mg,置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。3测定方法：取地西泮对照品约25mg,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取该溶液与标溶液各5ml,置25ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。吸取5l10l注入液相色谱仪,记录色谱图；另取本品适量约相当于地西泮5mg,同法测定,按标法以峰面积计算,即得。2高效液相色谱法测定硫酸阿托品片的含量 7 硫酸阿托品原料药在国药典中均采用非水滴定法,其片剂在中国药典中采用酸性染料比色法测定其含量,操作十分繁琐。多