第二十三章DNA的复制和修复

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1、DNA 的复制和修复生物体的遗传信息储存在DNA 中，并通过DNA 的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自 DNA 转录给 RNA ，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。1958年，F.Crick提出中心法则：（ 1）以原 DNA 分子为模板，合成出相同 DNA 分子的过程。（ 2）以某一段DNA 分子为模板，合成出与其序列对应的 RNA 分子的过程。（ 3）以 mRNA 为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。图DNA 生物合成有两种方式： DNA 复制和反转录DNA 体内复制涉及：原核、真核生物

2、的染色体、细菌质粒（环状，双链） 、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体） 、病毒（双链，环状）DNA 的体外复制：分子克隆。第一节DNA 的复制一、 DNA 半保留复制1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测 DNA可能按照半保留机制进 行自我复制。P321图191 Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代DNA 与亲代DNA 分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA 分子中有一条链完全来自亲代DNA ，另一条是新合成的。1958年，Meselson和Stah

3、l用15N标记E.coli. DNA ,证明了 DNA的复制是半保留复制。P322 图 19-2 DNA 的半保留复制。1963 年， Cairns 用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的 E. coli. 染色体 DNA。P323 图 19-33H-脱氧胸音标记E.coli. DNA，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli. DNA转 至膜上，干燥，压感光胶片，3H放出B粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了 大肠杆菌染色体DNA 是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。DNA 的半保留复制可以说明 DNA 在代谢上的稳定性。 经过多代复制， DNA

4、 的多核苷酸链仍 可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。复制起点、单位和方向DNA 的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成 复制。1、 复制起点复制起点是以一条链为模板起始 DNA 合成的一段序列。 有时， 两条链的复制起点并不总是在同一点上（如 D 环复制） 。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点， 都是 DNA 呼吸作用强烈 （甲醛变性实验） 的区段， 即经常开放的区段， 富含 A.T 。环状 DNA 复制起点的确定方法P325 图 19-6复制起点的克隆和功能分析重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点 o

5、riC 区 1Kb 的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样， 受到严密控制，每个细胞只有1-2 个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC 克隆片段的大小，最后得到 245bp 的基本功能区， 携带它的质粒依然能够自我复制， 拷贝数可以增加到 20 以上， 这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp 的 DNA 片段上，与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序

6、列。2、 复制单位复制子（Replicon） ： Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA 都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制） 。环状DNA的复制眼象8 ,称8形复制。真核生物的染色体DNA 是线形双链分子， 含有许多复制起点， 因此是多复制子， 每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。病毒 DNA 多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。

7、3、 复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行） ，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。用放射自显影实验判断DNA勺复制方向及速度低放射性3H-脱氧胸昔高放射性3H-脱氧胸音a.单向 、b.双向等速1三种结果图形c.双向异速E.coli.的一巾度敏感株，在42c时，能使DNA在完成复制后，不再开始新的复制过程， 而在25c时复制功又能能恢复。4、 DNA的几种复制方式5、 )、直线双向复制单点，双向，T7多点，双向，真核染色体DNA6、 )、 0型复制：环状双链 DNA,单向或双向(E.coli.)7、 )、滚环复制：环状单链 DNA, 0x1748、 )、D环

8、复制：线粒体、叶绿体 DNA9、 )、多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。10、 coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA 的复制最快可达50Kb/min, 完全复制需40min,富营养时，20min分裂。而真核染色体要6-8小时。三、与DNA复制有关的酶及蛋白质因子目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制(一) DNA的聚合反应和聚合酶DNA生物合成5 -3,化学合成3 一51 、DNA聚合反应必备的条件DNA聚合酶DNA模板(反转录时用RNA模板)引物 (DNA、RNA或蛋白质)4 4) 4 种 dNTP Mg2+2、聚合反应过程及

9、特点总反应式：nidATPDNA pol .n2dGTP +DNAn3dCTPMg2+dAMPdGMPdCMPdTMPDNA+ (n1+n2+n3+n4) PPiP329 图 19-10P330 陆 19-11n4dTTP在链的延长过程中，链的游离3二羟基，对进入的脱氧核糖核甘三磷酸a磷原子发生亲核攻击, 生成3二5 -磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。DNA聚合酶的反应特点：(1)以4种dNTP为底物反应需要接受模板的指导，不能催化游离的 dNTP的聚合。反应需有引物3-羟基存在链生长方向5 3产物DNA的性质与模板相同3、由DNA聚合酶催化的几种 DNA聚合类型P331 图 19-12(1)发荚环

10、结构：加入单链DNA作为模板和引物，3羟基端回折成引物链。(2)末端延伸聚合：加入双链 DNA作为模板和引物，3末端突出作为模板。(3)分枝型和切口平移型聚合：加入双链 DNA,聚合发生在切口或末端单链区(4)环形聚合：加入带引物的环形 DNA作为模板。4、E.coli DNA 聚合酶(6)、E.coli. DNA pol.I (Kornberg 酶，400 copy/cell )单体酶，分子量109Kd,含一个Zn2+,每个细胞中含400个DNA pol. I催化活性：5 一 3聚合活性6 一 5外切活性7 一 3外切活性用蛋白水解酶将DNA pol. I部分水解可得：大片段(Klenow)

11、, 75Kd,活性：5 一 3聚合活性、3 一 5外切活性。小片段，36Kd,活性：5 - 3外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复)Klenow 片段的用途：a 补齐 DNA 3， 隐缩未端b. 标记 DNA 片段未端c cDNA 合成第二链d d DNA 测序(7)、E.coli. DNA Pol. H (100 copy/cell )单体酶，分子量120Kd催化活性：5 - 3聚合(活性很低)3 - 5外切可能在 DNA 的修复中起某中作用。(8)、 E.coli.DNA pol. m (复制酶，10-20 copy/cell )寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，a、e

12、和8三种亚基组成核心酶。P334 表 10-3DNA pol.田是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)Pol. m的5 -3,外切酶活性只作用于单链 DNA OP334 表 19-2 E.coli 三种 DNA 聚合酶的性质比较 DNA 聚合酶有6 个结合位点 模板 DNA 结合位点 引物结合位点 引物 3， -OH 位点、反应位点 底物 dNTP 结合位点5 - 3外切位点(pol. II没有)3 - 5外切位点(校正)5、 真核生物 DNA 聚合酶P334 表 19-4 真核生物 DNA 聚合酶真核 DNA 聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA 复制中起校正

13、功能。(1) DNA聚合酶a,多亚基，功能与 E.coli. pol.田类似，是真核 DNA复制酶。DNA聚合酶B ,主要在DNA损伤的修复中起作用。DNA聚合酶丫，从线粒体得到，可能与线粒体 DNA的复制有关。DNA聚合酶6 ,特点：有35外切活力。引物酶或 RNA 聚合酶（引发酶）细胞内， DNA 的复制需要引物（DNA 或 RNA）， 引物酶或 RNA 聚合酶可合成6-10个碱基的RNA 引物。 DNAfi制为什么要用RN闻|物？（为什么DN咪合酶要用引物，RN臊合酶不需要引物？） P338从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核甘酸，没有与模板形成

14、稳定双链，DNA聚合酶的5,-3,对对功能难发挥作用。（三） 解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶I、H、田与 rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5 -3方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另 一条模板链上沿3 -5方向移动。DNA 旋转酶属DNA拓扑异构酶H,可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类： I 和 II ，广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶I 使 DNA 的一条链发生断裂和再连接， 反应无须供给能量， 主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶R使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供

15、给能量。 分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。（五） 单链 DNA 结合蛋白（ SSB ）复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA 前进，产生单链区，大量的单链DNA 结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA 不被核酸酶降解。（六） DNA 连接酶（ligase ）连接双链 DNA 上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA 缺口。T4DNA ligase 即可连接粘性末端的DNA ，又可连接平齐末端的双链DNA 。E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体 DNA ligase以ATP为能（七）DNA 复制的拓扑结构P338-339四、 DNA

16、的半不连续复制P336 图 19-15 DNA 的半不连续复制DNA聚合酶催化的方向是5-3，。前导链：滞后链：1968 年，发现冈崎片段。长度：细菌： 1Kb-2Kb ，相当于一个顺反子的大小。真核：100-200bp,约等于一个核小体DNA的长度。五、 DNA 复制过程（ E.coli. ）P342 图 19-17 大肠杆菌的复制体结构示意图1、 复制的起始引发：当 DNA 的双螺旋解开后，合成RNA 引物的过程。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、n，n- I）构成的复合体，负责 RNA 引物的合成。引发体沿着模板链5 -3方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，

17、而与复制叉移动的 方向相同） ，移到一定位置上即可引发 RNA 引物的合成。E.coli.DNA复制原点ori C,由245bp组成，三组13bp重复序列（近5端处），四组9 bp重 复序列（另一端处） 。图大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：DNaADNaBDNaCHu引物酶（ DNaG）SSBRNA 聚合酶旋转酶在原点处打开双螺旋使 DNA 解旋DNaB 结合在原点所需刺激起始合成 RNA 引物结合单链 DNA促进 DNaA 活性松驰 DNA 扭曲应力20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物 三组 13bp 重复区依次变性，产生开放型复合物。DnaB （在

18、DnaC 协助下）与开放复合物结合，进一步解链。2、 DNA 链的延长反应前导链只需要一个RNA 引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA 引物，链的延长反应由DNA pol.田催化。复制体：在DNA 合成的生长点 （既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子， 它们在 DNA 的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA 。3、 RNA 引物的切除及缺口补齐DNA pol I的5 - 3外切活力，切除RNA引物。DNApol I的5 f 3合成活性补齐缺口。4、 DNA 切口的连接DNA ligase,动物、真核由ATP供能，

19、原核由NAD供能5、 DNA 合成的终止环状 DNA 、线性DNA ，复制叉相遇即终止。小结： DNA 解螺旋酶解开双链DNA 。 SSB 结合于 DNA 单链。 DNA 旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 DNA 引物酶（在引发体中）合成RNA 引物。DNA pol.田在两条新生链上合成 DNA。（6） DNA pol I切除RNA引物，并补上 DNA。 DNA ligase 连接一个冈崎片段。DNA 复制过程中，聚合酶对dTTP 和 dUTP 的分辨能力高 ,有少量 dUTP 掺入 DNA 链中，此时，U-糖甘酶、AP内切酶、DNA poll、DNA ligase共同作用

20、，切除尿喀呢，接上正确的碱基。六、 真核生物 DNA 的复制 P3431、 复制起点和单位真核生物染色体DNA 是多复制子， 有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。 每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体 DNA （单复制子）小得多。试验证据： 5- 氟脱氧胞苷标记真核生物 DNA 复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟 1-3Kb，细菌每分钟 5Kb 。真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离

21、为7.9kb,而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb,成体细胞只利用一部分复制起点。2、 复制过程中组蛋白的装配核小体的结构（ 200bp 左右）在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA 的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此， DNA 的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察3、 真核生物 DNA 复制的终止端粒：一段DNA 序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。功能：保证线性DNA 的完整复制保护染色体末端决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细

22、胞不表达端粒酶。端粒（telomeres）分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约100bp的重复序列，形式为：5（TxGy） n3， （AxCy） n ， x 和 y 一般为1 4。端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerasR将其加到染色体末端。端粒酶含有RNA和蛋白质（起DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约159b,含有多 个 CyAx 重复序列， RNA 分子用作端粒TxGy 链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的 RNA 模板互补的 DNA 片段。人类体细胞的端粒长度， 随个体年龄增加而逐渐缩短。 细胞每分裂一次， 端粒缩短 50-200bp， 短至 1-4K

23、bp 时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表 达多。杂交 图聚合 图转位再杂交图进一步聚合图非标准 GG 配对图七、 DNA 复制的调控八、 DNA 复制的真实性杨岐生 P144生物体 DNA 复制具有高度真实性，复制107-1011碱基对,只有一个错误碱基。碱基对的自由能通常在4-13KJ/mol,这样的自由能相当于平均参入 100个核甘酸就可能出现 一次错配，仅靠 Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2。1、 DNA 聚合酶对碱基的选择作用酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的 dNTP 能长时间停留，而参与聚合

24、。 DNA 聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的 dNTP 掺入引物末端。酶积极参与理论： DNA 聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA 引物端的速度也不同。动力学校正阅读： 在新的磷酸二酯键未形成时， dNTP 结合在酶与模板引物复合物的聚合位 点上， DNA 聚合酶能识别正确与错误的 dNTP。DNA 聚合酶对底物的识别作用， DNA 聚合酶有两种底物，一种是DNA 模板引物，另一种是 dNTP。DNA 聚合酶先识别 DNA 模板和引物的3， 未端， 再识别底物 dNTP， 是一种有序的识别过程。2、3 -5,外切活性的校正阅读E. coli. DNA pol.

25、 I和pol.m有3 -5,外切活性，可删除错误插入的核甘酸。缺失3 -5外切活性的E. coli. DNA pol. I ,催化DNA合成时，出现错误的几率增高 5-50 倍。因此，3-5,外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2个数量级。图3、 影响 DNA 合成真实性的因素高浓度 NMP(如 3 -AMP, 5 -GMP)NMP竞争酶的dNTP结合位点，抑制3 -5外切活性。某一种 dNTP 浓度银高,可使引物3， 末端离开外切活性中心。dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价 阳离子（如Mn2+）代替Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合

26、活性和3-3外切活性。4、 为什么用 RNA 引物从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核甘酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5 -3对对功能难发 挥作用。第二节 DNA 的损伤及修复DNA 的损伤， 罗纪盛 P428一些物理化学因子如紫外线、 电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA 损伤， 破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。紫外线可使DNA 分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（ TT ） ，两个 T以共价键形成环丁烷结构。CT、 CC 间也可形成少量二聚体（ CT、 CC） ，使复制、转录受阻。P34

27、6 图 19-22细胞内具有一系列起修复作用的酶系统， 可以除去 DNA 上的损伤， 恢复 DNA 的双螺旋结构。目前已知有4 种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、 SOS 反应诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。一、 光复活1949年已发现光复活现象，可见光（最有效 400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外 线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。P347 图 19-23 紫外线损伤的光复活过程A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位C 酶被可见光激活D. 修复后释放酶二、 切除修复P348 图 19-24 DNA 损伤的切除修复过程在一系列酶的作用下， 将 DN

28、A 分子中受损伤部分切除， 并以完整的那一条链为模板， 合成出切去部分， DNA 恢复正常结构。I 、结构缺陷的修复：（ 1）核酸内切酶识别 DNA 损伤部位，在其附近将其切开。（ 2）核酸外切酶切除损伤的DNA 。（ 3） DNA 聚合酶修复。（ 4） DNA 连接酶连接。 图II、无喋吟无喀呢一一碱基缺陷或错配一一脱碱基（N-糖甘酶）：甲基磺酸甲酯可使鸟喋吟第 7位氮原子烷基化，活化B一糖甘键，造成脱喋吟作用；酸也能 使 DNA 脱嘌呤。DNA 复制时， DNA 聚合酶对 dTTP 和 dUTP 分辨力不高，有少量dUTP 掺入 DNA 链。细胞中的尿喀呢-N-糖甘酶可以切掉尿喀呢。腺喋吟

29、脱氨形成次黄喋吟时也可以被次黄喋吟-N-糖甘酶切掉次黄嘌呤。对于无嘌呤无嘧啶的损伤有两种修复方法：（ 1） AP 核酸内切酶切开，核酸外切酶切除， DNA 聚合酶修复， DNA 连接酶连接。（ 2） 插入酶插入正确碱基三、 重组修复P349 图 19 25重组修复的过程切除修复发生在DNA 复制之前，而当 DNA 发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。在重组修复过程中， DNA 链的损伤并未除去。重组修复至少需要 4 种酶组分。重组基因 recA 编码一种分子量为 40000 的蛋白质， 它具有交换DNA 链的活力。 RecA 蛋白被认为在 DNA 重组和重组修复中均起关键作用

30、。recB、recC基因分别编码核酸外切酶 V的两个亚基。此外，修复合成还需要DNA 聚合酶和连接酶。四、 诱导修复和应急反应（ SOS 反应）诱导修复是细胞DNA 受到严重损伤或DNA 复制系统受到抑制的紧急情况下， 为求得生存而出现的一系列诱导性修复。SOS 反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（无差错修复）和倾向差错的修复。避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。倾向差错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的 DNA聚合酶，它能在DNA损伤部 位进行复制而避免了死亡，可是却带来

31、了高的突变率，这属于倾向差错的修复。SOS 反应是由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物相互作用引起的。 RecA 蛋白不仅在同源重组中起重要作用，而且它也是SOS反应的最初发动因子。在有单链 DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激 活而表现出蛋白水解酶的活力，它能分解入噬菌体的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）许多基因的阻遏物，当它被RecA 的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因uvrA、uvrB、uvrC （分别编码核酸内切酶的亚基）以及 recA和lexA基因本 身，还有单链结合蛋白基因ssb,与人口I菌体DNA整合有关的基因himA、与

32、诱变作用有关的基 因umuDC,与细胞分裂有关的基因sulA, ruv,和lon,以及一些功能不清楚的基因dinA, B, D,F 等。SOS 反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。然而癌变有可能也是通过 SOS反应造成的，因为能引起SOS反应的作用剂通常都具有致癌作 用，如X-射线，紫外线，烷化剂，黄曲霉素等，而某些不能致癌的诱变剂并不引起SOS反应，如5-澳尿喀噬。目前，有关致癌物的一些简便检测方法就是根据 SOS反应原理而设计的，既测定 细菌的 SOS 反应。第三节 RNA 指导的 DNA 合成（反转录）反转录（ reverse transc

33、ription） ：以RNA 为模板，合成DNA 。与通常转录过程中遗传信息流从 DNA 到 RNA 的方向相反。1970 年， Temin 和 Baltimore 分别从致癌RNA 病毒（劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中发现发反转录酶。致癌 RNA 病毒是一大类能引起鸟类、 哺乳类等动物白血病、 肉瘤以及其它肿瘤的病毒。 这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。放线菌素D （抑制以DNA为模板的反应，复制和转录）能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌 RNA 病毒的复制过程必然涉及DNA 。Bader 用嘌呤霉素（puromycin ）来抑

34、制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（ RSV ） ， 证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的， 而不是感染后在宿主细胞中新合成的。一、 反转录酶由一个a亚基和一个B亚基组成，含有 Zn2+,具有三种酶活力。（ 1） RNA 指导的 DNA 聚合酶活力（以 RNA 为模板，合成一条互补的 DNA ，形成RNADNA 杂种分子） 。（ 2） RNase H酶活力，水解 RNA DNA杂种分子中的 RNA ,可沿3 -5,和5 -3,两个方 向起外切酶作用。（ 3） DNA 指导的 DNA 聚合酶活力。模板： RNA 或 DNA以自身病毒类型的 RNA 为模板时， 该酶的反转录活

35、力最大， 但是带有适当引物的任何种类的 RNA 都能作为合成DNA 的模板。引物：RNA 或 DNA底物：dNTP二价阳离子：Mg2+或Mn2+真核 mRNA3 端有 polyA ，加入 oligo dT 后，可以作为反转录酶的模板，合成cDNA 。二、 病毒 RNA 的反转录过程所有已知的致癌RNA 病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒（ retrovirus） ，反转录病毒的复制需要经过一个DNA 中间体（前病毒）1、 反转录病毒的基因组结构P353 图 19-27（ 1） 反转录病毒基因组通常由两条相同的（ + ） RNA 链组成。5端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb 。（

36、 2） 每一条RNA 链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。（ 3） 5端有帽子结构，3端有polyA ，与真核 mRNA 相似。（ 4） 5端带有 1 分子的宿主tRNA ，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是 tRNAtrp,鼠类是 tRNApro2、 反转录过程。当致癌 RNA 病毒侵染宿主细胞时，病毒RNA 及反转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的反转录酶使RNA 反转录成双链DNA 。（ 1） 以病毒（ +） RNA 为模板，合成互补的（ -） DNA 。（ 2） 切除 RNA DNA 杂种分子中的 RNA 。（3）以（-）DNA链为模板，合成（+） DNA链，最后形

37、成两端带有 LTR （长末端重复序 列）的双链DNA 。反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA 后才能被转录， 转录产物经拼接可以产生不同的病毒mRNA 。 LTR （长末端重复序列）对前病毒DNA 整合到宿主染色体DNA 以及整合后的转录均起着重要作用。反转录病毒合成的过程：图缺口的模板（基因组）RNA在U旁生成一个正链DNA勺合成RNA勺引物，而其余的模板RNA 被降解。正链DN*成开始，复制。图3、 反转录病毒的生活周期P354 图 19-291） 病毒粒子侵染细胞，病毒 RNA 和反转录酶一起进入细胞。2） RNA 被反转录成双链DNA （前病毒） ，环化，进入细胞核。3） 反转录病毒的

38、 DNA 整合到宿主染色体 DNA 中。4） 前病毒 DNA 进行复制，转录出功能基因、基因组RNA 和病毒蛋白。5） 基因组 RNA 和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子， 转移到质膜， 通过出芽方式释放 新病毒粒子。三、反转录的生物学意义1 .反转录酶存在于所有致癌 RNA病毒中，它的存在与RNA病毒引起细胞恶性转化有关。2 .艾滋病毒（AIDS）人类免疫缺陷病毒（HIV）,也是一种反转录病毒，主要感染 T4淋巴细胞和B淋巴细胞。病 毒粒子直径100nm,球状，粒子外包被两层脂质质膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41）,另有两层 衣壳蛋白p24、p18。HIV基因组由两条单链正链 RNA组

39、成，每个链长9.7kb, RNA 5端有帽子结构，3端有PolyA, 链上结合有反转录酶。3 .乙肝病毒广 大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原）核心抗原双链环状DNAL乙肝病毒与反转录病毒的区别：P3554、真核生物正常细胞内也存在反转录过程真核生物的谈色体基因组中存在为数众多的逆假基因和逆基因。逆假基因：无启动子和内含子，但有 polyA的残基，推测是由mRNA反转录后整合到基因组 中去的。逆基因：具有启动子和转录功能，无内含子。可能是由于 mRNA反转录后刚好整合到启动子 的下游处，或者是带启动子的 RNA序列反转录后整合到基因组中第四节 DNA合成技术一cDNA合成1、cDNA文库的构建c

40、DNA:以mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除 mRNA,合成的第二链。cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法，成熟的 mRNA无内含子。（9）、真核mRNA的分离纯化特点：含量少，不均一，表达具有发育阶段性和组织特异性。总 RNA:rRNA8085%mRNA15%tRNA及其它小分子 RNA 1015% 不均一：在 15%的 mRNA 中，有 10000 30000种 mRNA。 分离、纯化：用 Oligo dT 纤维素柱（亲和层析法） ，加入总 RNA ，高盐洗脱，先流出非mRNA ，降低盐浓度，加入 Oligo dA 竞争，可洗出 mRNA 混合物。免疫法可分离特定的 mRNA

41、。（ 10 ）、cDNA 合成（反转录酶）A. 自身引物法（ S1 核酸酶降解法）图Oligo（dT）15-18 个核苷酸mRNA5 端序列有丢失。B. 取代合成法（较常用）图Oliyo （dT）与mRNA3端AAA杂交作为引物，合成第一条 DNA链 RNaseH在mRNA上产生多个切口。DNA pol. I切口平移，DNA ligase连接，合成出第二条 DNA链。T4DNA pol.切去端头的RNA-DNA 杂交链。C. 引物合成法可以合成全长cDNA ， mRNA 的 5端不丢失。图11）、cDNA与载体连接12 ）、重组体的转化13 ）、扩增、保存2、 获取特定 mRNA 的 cDNA

42、（ 1）免疫法分离特定的 mRNA（ 2） PCR 法二、 PCR 技术（聚合酶链式反应）Polymerase chain Reaction以目的基因或DNA 片段为模板，在引物介导及Taq DNA 聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA 片段。它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA 片段。1、 反应物（ 1）模板单、双链 DNA 或 cDNA 都可以作为 PCR 的模板，若以 RNA 为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA 后才能用于PCR。（2） Taq DNA 聚合酶DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键，从水生栖热菌（Thermus aquaticns VT-6分离出来。Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性，925c处理130min,仍保留50%的酶活性，在74c活性 最高，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。（ 3）引物引物是决定PCR结果的关键，它由寡核甘酸组成，15-30个b（ 4）核苷酸dNTPdNTP 的浓度50-200umul/L 。（ 5）镁离子Mg2+2、PCR 原理图变性95复性55延伸72