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1、MSP原理其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。引物设计原则标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“
2、MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物。对于BSP,引物设计的原则1:为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则:为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的
3、3端至少包含1个CpG位点,我们可以自己设定CpG的“C”距3末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。甲基化引物和非甲基化引物序列3端应处于相同的CpG位点。如果,2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受Tm值限制,由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”,导致GC含量降低,从而引起Tm降低。2套引物应有相近的Tm值,“MethPri
4、mer”中默认2套引物Tm值相差不超过5,这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行。问题解决参考引物设计步骤（以CLEC14A基因为例）：1. 找到目标基因的启动子区（promoter）序列首先打开ensembl页面：.ensembl.org/index.html 如图在搜索框第一个物种选择Human，基因填入要研究的基因名，点击Go搜索结果页面第一条下面箭头所指处Regulation，点击它（这里面主要是基因调控区域的信息）打开新的页面后，下拉至长长的表格，找到第一个promoter，长度在2000bp左右。然后点击最右侧Show旁边的+，出现的就是启动子区的序列了将序列信息复制，然后
5、就可以进入下一步2. MSP引物设计打开MSP在线引物设计工具页面：.urogene.org/methprimer/ 或者他们新开发的2.0页面.urogene.org/methprimer2/进入后我们选择第一个就好进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击submit。新生成的页面中会有CpG岛的预测，后续如果还有其他引物要设计，可能需要这些信息。将页面继续下拉即出现设计好的引物啦我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意MSP需要两对引物，分别针对被甲基化的基因序列和没有被甲基化的。将序列复制下来加入实验设计，done.当然如果第一对引物不work，建议一次把多组引物都保存下来，以备不时之需。4 / 4
甲基化特异性PCR(MSP)原理与引物设计说明
