TRIM家族蛋白：TRIM TRIM抑制流感病毒的功能和机制的初步研究

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1、五讨论34第二节TRIMl4抑制流感病毒复制35一干扰素诱导TRIMl4基因的表达二35二过表达TRIMl4抑制流感病毒37三敲除内源的TRIMl4基因流感病毒复制增强39四TRIMl4截短体抑制流感病毒的复制40五TRIMl4不是通过固有免疫途径抑制流感病毒复制41六BiLC检测TRIMl4与流感蛋白的相互作用42 七讨论44参考文献47缩略词表57致谢614万方数据摘要流感病毒(influenza virus)是一种流行广泛、传染性极强的负链病毒，可在 高危人群中造成严重疾病和死亡。每年流感在世界范围内的流行造成约300万至 500万例严重疾病和约25万至50万例死亡。流感病毒分为A、B、

2、C三型，其中 A型流感病毒(influenza A virus，IAV)致病性最强。目前治疗流感的药物有NA 的抑制剂扎那米韦、奥司米韦，及针对M2的抑制剂金刚烷胺，但是流感病毒通 常会对药物产生耐药性。虽然疫苗能够预防病毒感染，但流感病毒每年流行的毒 株都不一样而且病毒的突变性很强容易导致疫苗错配，单纯靠疫苗预防感染并不 现实。因此，有必要寻找新的抑制流感病毒的机制，为新药物的研发提供线索。在固有免疫对抗流感病毒感染过程中干扰素发挥了重要作用。干扰素能够诱 导表达1SG(interferonstimulated gene)。ISG通过改变细胞的代谢和内环境来调节 机体免疫反应或者与病毒的某些

3、组分发生直接的相互作用来抑制病毒的复制。这些ISG中包括较多的TRIM蛋白，TRIM蛋白家族是由N端到C端以RING、B-box、 Coiledcoil结构域依次排列为结构特征的一类蛋白，TRIMl4和TRIM22属于TRIM (tripartite motif)家族成员。目前已经发现一些TRIM蛋白能够抑制HBV、HIV、 IAV等多种病毒，但TRIMl4与流感病毒的关系还不清楚。本研究以TRIM22为研究对象来验证BiLC系统能否快速有效的检测ISGs蛋 白与流感蛋白相互作用；同时建立了稳定表达细胞系的构建方法及快速检测流感 病毒复制的系统。与文献报道一致，TRIM22能有效抑制流感病毒的

4、复制，并且 BiLC系统检测到TRIM22与NP蛋白有特异的结合。基于上述实验方法，我们研 究了TRIMl4与流感病毒的关系。发现TRIMl4属于ISG并且主要被I型干扰素 诱导高表达。过表达TRIMl4和敲除内源TRIMl4细胞的病毒扩增实验都证明 TRIMl4对流感病毒具有抑制作用。利用高效BiLC系统检测发现TRIMl4可能通 过与M2、NP、PA、NSl等蛋白相互作用来抑制流感病毒复制。上述研究的完成，为快速研究ISG与流感病毒的关系和机制提供了新的方法。 丰富了固有免疫对流感病毒抑制方式的认识，同时也为研究抗流感病毒药物提供 了新的视角。关键词：TRIM22，TRIMl4，IAV，I

5、SG，B302SPRY万方数据AbstractInfluenza viruses pose a serious threat to public health which can result in severe diseases and even death in vulnerable and hi。曲一risk populationsInfluenza epidemics are estimated to contribute to about 3 million to 5 million cases of serious diseases and about 250 thousand t

6、o 500 thousand cases ofdeath worldwide each yearIt is demonstrated that influenza viruses are divided into type A，B，and C on the basis of variation in thenucleoprotein antigen，in which influenza A virus(IAV)is the most common infectiouspathogenThere is currently a lack of effective drug treatment fo

7、r influenza since the virus Can evolve resistance to drugsAlthough virus infection can be prevented by the vaccine，the annual epidemic strains of influenza viruses are different and found to be hi曲ly mutatedTherefore，preventing infection only by injecting vaccine is not enoughTherefore，there is a ve

8、ry urgent need to find new mechanisms for the inhibition ofinfluenza virus，which may provide clues for the development ofnew drugsInterferon plays a prominent role when the innate immunity fights against the infection of influenza virus，and induces the expression of ISG(interferonstimulated gene)whi

9、ch inhibits the replication of the virus by changing cell metabolism and internalenvironment，or directly interacting with virusThe ISG includes a number of TRIMproteinsThe TRIM(tripartite motif)family proteins，characterized by the presence of the tripartite motif,are composed of a RING domain，one or

10、 two B-box domain(s)and a Coiledcoil regionTRIM 1 4 and TRIM22 are members of TRIM familyRecently,some TRIM proteins have been identified as inhibitors of viruses such as HBV,HIV IAV and SO onHowever,the relationship between TRIM 1 4 and influenza viruses is still unclearTheTRIM22 isdesigned as the

11、research objectto verify whether BiLC system can quickly and effectively detect the protein-protein interactions between ISGs and influenza virusesIn addition， methods have been constructed to produce stable expression of cell line and a system to detect the replication of the influenza virus hasals

12、o been set upConsistent with the results reported in the literature，TRIM22 Caneffectively inhibit the replication of influenza viruses and interact with NP proteinsAnd this paperis aiming to study the relationship between TRIM 1 4 and influenza virusesIt has been discovered that TRIM 1 4 Can be indu

13、ced by interferon and influenza virus in A549 cellsFurthermore，the viral amplification experiments with TRIMl4 over-expressing cells and KO TRIMl4 cells have proved that TRIMl4 is an inhibitor of influenza viral replicationFurther studies indicate that the interaction between TRIM 1 4 and NP,M2，NS 1

14、，PA is of vital importance to inhibit IAVAll the significance of this thesis is to provide a llew approach to make quick research on the relationship between ISGs and influenza virusBesides，this study enriches the content of the meehanism for the inhibition of influenza virusIn themeantime，a new per

15、spective is brought to develop new drugsKeywords：TRIM22，TRIMl4，IAV，ISG，B302SPRY4第一章研究背景第一节流感病毒概述一流感病毒简介流感病毒是一种能够引起人类急性呼吸道传染病的病毒。流感病毒属于正黏病 毒科，正黏病毒是一类分节段的单链负义RNA病毒。流感病毒根据其核蛋白的抗 原性分为三类：甲型流感病毒(Influenza A virus)，又称A型流感病毒；乙型流感 病毒(Influenza B virus)，又称B型流感病毒：丙型流感病毒(Influenza C virus)， 又称C型流感病毒。流感病毒的A型、B型、

16、C型分类只是针对感染人类的流感病毒。其中A型流感病毒对人类危害最大，本研究主要针对A型流感病毒。根据世界卫生组织1980年通过的流感病毒毒株命名法修正案，流感毒株的命 名包含6个要素：型别宿主分离地区毒株序号分离年份，对于甲型流感病毒需要 注明血凝素(H)和神经氨酸酶类型(N)，对于乙型和丙型流感病毒省略亚型信息。例如AswineIowa1530(H1N1)表示的是核蛋白为A型的流感病毒。目前甲型 流感病毒已经发现有18种不同的血凝素亚型(H1至H17)和11种不同的神经氨 酸酶亚型(N1至NIO)【11。根据WHO统计，流感病毒每年在世界范围内的流行引起造成约300万至500 万例严重疾病和

17、约25万至50万例死亡。对婴幼儿、老年人或慢性病患者等高危人 群危害尤其大。其中最著名的是1918年西班牙流感大流行造成约5000万人死亡2】； 2013年2月以来的H7N9病毒在中国东部爆发流行造成679人感染，并且死亡率超 过40131。因此，流感是一个严重的公共卫生问题，它能在人群中造成严重疾病和 死亡。流感的流行不仅造成劳动力的丧失，而且还会造成社会恐慌而影响经济发展。二流感病毒的组成和结构甲型流感病毒具有复杂的组成和结构。病毒表面为病毒衣壳，由脂质膜和蛋白 组成：脂质膜来自宿主细胞，病毒表面的蛋白由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、 突出病毒表面的M2蛋白组成；目前在电子显微镜下已

18、经能清晰的观察到流感病毒 的刺突(图11A)，这些刺突由HA和NA蛋白组成，而且HA与NA的数目比约 为4：l，长度约10至14nm。目前对流感病毒的内部结构了解较少：病毒衣壳的下 方为超螺旋结构的基质蛋白(M1)；病毒的核心成分为病毒核糖核酸蛋白复合物 (vRNPs)，由RNP(Ribonucleoprotein)和病毒的8条单链负义RNA 组成：RNP由PB 1(polymerase basic 1)、PB2(polymerase basic 2)、PA(polymerase acid)和NP(nucleoprotein)组成【41；另外，在纯化的病毒中还发现j-NS2(nonstruct

19、ural protein 2)蛋白。甲型流感病毒的基因组由8条分节段的单链负义RNA组成(图11B)。这些 RNA分别编码各自相应的蛋白，其中M和NS基因生成M2和NEP mRNA，编码 M1、M2和NSl、NS2蛋白；PBlF2和PBlN40蛋白来自PBl开放阅读框的选择 性表达，但不是所有的流感病毒株都会编码这些蛋白质【51。每段病毒RNA片段在5 和3都有非编码区并且非常保守。BvlraI RNA coated with NPAH1N1电镜图(USCenters for Disease Control in Atlanta，2009)B流感病毒结 构示意图(fields virology

20、，6th edition)图11流感病毒电镜图和流感病毒结构示意图三流感病毒生命周期流感病毒生命周期包括如下阶段：黏附、进入宿主细胞、融合和脱壳、转录和 复制、组装和释放(图12)。彀Y_：，一i瀚謦r锄：fV冀：I彳二，h|1w1建，迪L(。”rl“释一善 _ 一“七。画够并图1-2甲型流感病毒复制周期示意图【6】6万方数据黏附甲型流感病毒通过病毒包膜表面上的HA蛋白与细胞表面上的唾液酸结合来吸 附细胞。HA是一种糖蛋白，它以同源三聚体的形式在流感病毒表面形成刺突。HA0 为HA的前体，由HAl和HA2组成，HA2为跨膜蛋白，HAl和HA2由二硫键连 接。流感病毒具有宿主特异性：感染人类的流

21、感病毒优先通过a(2，6)糖苷键与唾液 酸结合，而禽类病毒则大多通过a(2，3)糖苷键与唾液酸结合。与以上发现一致的是：人的气管上皮细胞含有的唾液酸主要为a(2，6)唾液酸，而禽类主要为a(2，3)唾液酸。但是，流感病毒宿主特异性并不是绝对的，禽类和人类细胞可以同时包含a(2，3)和 a(2，6)唾液酸。当流感病毒在宿主内传代时，流感病毒的HA蛋白可以通过突变来增 强对宿主细胞的亲和性。对ANew YorkI1918禽流感病毒HA蛋白的研究表明该 病毒只需要一个氨基酸的突变(D190E)就能对a(2，3)糖苷键具备亲和性【71。 进入宿主细胞流感病毒进入细胞的过程需要低pH环境，低pH环境能够

22、引发膜融合从而使 流感病毒能够被内吞进入细胞内。有四种内吞机制：(一)通过网格蛋白小窝；(二) 细胞膜穴样内陷；(三)通过非网格蛋白小窝和非细胞膜穴样内陷途径；(四)通 过巨胞饮。第一种途径是流感病毒进入细胞的经典模型【8l。对病毒进入细胞所利用 的宿主蛋白的研究进一步揭示了病毒进入细胞的方式，全基因组范围内的RNAi筛 选已经发现病毒进入细胞的几个关键因子【91。目前认为唾液酸并不是流感病毒进入 细胞的唯一黏附分子：N端糖基化缺陷的Lec1细胞(能表达唾液酸蛋白)不能够内吞流感病毒，流感病毒却能够进入缺乏唾液酸但能表达Ctype凝集素、DCSIGN、 LSIGN之一的细胞10】。融合和脱壳在

23、流感病毒通过内吞作用进入细胞后，内体的低PH值激活病毒与内体发生膜 融合。膜融合的过程依赖于HA蛋白的结构变化：首先，HA0裂解成HAl和HA2； 一旦与内体的低PH环境接触，HA分子就发生构象变化暴露出HA2的N端融合肽； 之后，HA2插入病毒膜的肽段和插入内体膜的融合肽处于并排状态从而在病毒膜上 形成空洞释放病毒RNPs进入细胞质(图13)。7万方数据CYTOPLASMENDOSOMEL卜_fusm pep。，。l鬻协侧-：t：譬?I：r崦雾一：咚 HAA严 ，lENDOSOME菇飞P卧， S O o，ILL，L仲 叭里图13膜融合过程示意图(fields virology，6th edi

24、tion)RNPs的释放还依赖于病毒膜上的M2蛋白【11】。M2蛋白是一种四聚体III型跨 膜蛋白，并具有离子通道活性，对H+具有高度选择性。膜融合的同时也打开了M2 的离子通道，打开的离子通道选择性的将内体内大量的H+输入病毒颗粒内部，输入 病毒颗粒内的H+能够破环蛋白质之间的相互作用，从而使RNP从MI蛋白解离出 来。金刚烷胺和金刚乙胺能够阻断M2蛋白的离子通道活性【12，13】。大部分病毒从吸 附到进入细胞的时间为25分钟，极少数为34分钟【14。转录和复制病毒脱衣壳后，病毒核糖核蛋白复合体(vI埘Ps)被转运至细胞核，其负链病 毒IA(vI矾A)首先会通过引物依赖性机制转录为mRNA，

25、但这些mRNA是vRNA 的不完整拷贝，后面还需经过5端加帽和3端加Poly(A)尾的过程。病毒基因的复R万方数据制首先以vRNA为模板合成互补的cRNA，再以cRNA为模板合成更多的vRNA(图14)。棚3州I：!n一芝加厂cII嗍p呐v)h胁。咖崎Py啊n、触木。”“-，H”mMpe2I嘿画留易孥警一“”之14I络孓赢一一卜、j一l嘿蓠图l-4甲型流感病毒转录和复制模式示意图与大部分RNA病毒不同的是，流感病毒的生命周期依赖于细胞的细胞核。流 感病毒的RNA片段以与四种流感病毒的蛋白相结合的形式存在。这四种蛋白分别 是NP、PBl、PB2、PA，其中NP覆盖整个RNA，PBl、PB2、PA

26、以特征性的手掌 结构结合在RNA的末端【16。由于RNPs有10到20nm宽，因此认为其不可能通过 主动融合的方式进入细胞核17】。虽然这四种蛋白都具有核定位信号(NLss)来调节 RNP入核，但目前只有NP上的信号被认为是必须的。这些蛋白一般结合各种核胞 浆转运蛋白(karyoperins)如karyoperinsufl等入核【18。每段病毒RNA都是以RNP复合物的形式存在被NP覆盖形成螺旋发夹结 构并在末端结合聚合酶复合物。NP是一种富含精氨酸的蛋白质和具有净正电荷(pH 65)，因此能够与带负电荷的RNA骨架结合，并且它们之间的相互作用并没有明9万方数据显的序列特异性191。RNA约每

27、24个核苷酸就被一个NP单体覆盖，NP蛋白同源寡 聚的性质使得RNP成为一个高度有序的复合物，这一结构对于维持其转录活性也 至关重要201。NP由一个头端结构域、体端结构域和一个能够调节寡聚性具有伸缩 性的尾环组成【21】。NP的头端结构域和体端结构域形成了一个含高度正电荷的结构 被认为是可能的RNA结合位置，目前已经有研究发现能减弱NP与病毒RNA结合 的药物22】。有研究表明单独的NP能够和PBl和PB2发生相互作用，同时电子显微 镜的数据结果也显示在RNP卜NP能够直接与聚合酶复合物相接触【2。对NP上的 保守区域进行突变还发现NP参与病毒基因的转录复制和组装。流感病毒聚合酶复合物是一个

28、由PBl、PB2、PA组成的250kD复合物。虽然 目前已经通过结晶和功能实验证实了PBI通过N端和C端分别与PA、PB2相互作 用，但新合成的聚合酶复合体是如何组装的目前并不清楚【23】。在RNA链延长过程中，由PBl蛋白催化顺序加入核苷酸。PBl上的444446 位SDD序列是RNA依赖的RNA聚合酶的保守序列特征并且是其重要活性位点【241。 同时也发现PBl负责结合vRNA和cRNA的末端来起始基因的转录和复制。X射线 晶体衍射表明，PBl的18l或125能与PA的C端相互作用，而且发现合成的PBl 的这个部位的短肽可以与PA竞争性结合来抑制病毒复制【25。27。另外，PBl还通过 C

29、端的678757残基与PB2的137残基相互作用12刀。PB2在病毒的转录起始有着关键的作用，它负责结合在宿主前体mRNA的帽子 结构上281。尽管对早期结合位点仍存在争议，但已有研究发现PB2的318-483残基 已经能够完成结合帽子的过程，而且点突变实验证明F363和F404对这一过程非常 重要29】。PB2也存在核定位信号，它的C端678759能够与karyopherinal相互作用1301。PB2同时也参与基因组的复制是但目前还没有发现其参与转录过程311。目前对于PA蛋白的具体功能还不清楚，但PA的N端的晶体结构显示其具有 内切酶活性，内切酶活性对获得帽子结构是必须的321。对PA内

30、切酶活性的结构分 析可将其归类为PD(DE)XK家族核酸内切酶成员。催化位点涉及的残基包括His41、 Glu 80、Aspl08、Glul 19，和Lysl34和螯合的两个Mn(2+)离子突变这些残基会影响 流感聚合酶的转录活性但不影响其复制【2蚋。PA也参与流感病毒的复制。PA与PBl存在相互作用，PBl的N端插入到PA的257716残基形成的龙头样结构内1331。病毒vRNA5端13个氨基酸与3端的12个氨基酸部分互补配对形成发卡结构 341。转录起始阶段，聚合酶从宿主RNA聚合酶II获得5帽子结构，这一过程需要 PB2和PA的内切酶活性的参与。PBl结合于vRNA的5末端引起聚合酶构象

31、变化， 从而暴露出PB2与宿主preRNA的结合位点使得PB2与preRNA结合，同时使得 vRNA的3端也能够结合于PBll29I。3端vRNA与病毒结合后一方面能够稳定聚合10万方数据酶结构，另一方面也能够激活PA的内切酶活性：在preRNA 5端1013核苷酸(一 般为嘌呤核苷酸)处切断preRNA；之后由PBl催化加入的第一个核苷酸为鸟嘌呤， 与vRNA的3端倒数第二个位置的胞嘧啶配对；之后的延长也由PBl催化，延长直至vRNA的5端第16个残基处；之后，由于连续的57个氨基酸尿嘧啶形成空 间位阻效应使得PBl不断催化延长腺嘌呤从而形成polyA的尾巴【”l。生成的mRNA可以通过选择

32、性剪切来生成一种基因的两种蛋白【3 61。与宿主细 胞高效的RNA剪切不同，由于流感病毒剪切和未剪切的RNA都需要表达蛋白，因 此病毒的RNA剪切并不高效。由于调节的作用的存在，剪切的RNA占未剪切RNA 的比例约稳定在10。对病毒RNA的剪切可以在多层次上控制，包括未剪切RNA 的出核和RNA的剪切。转录和复制虽然都是以vRNA为模板进行，但两者的时机和机制很不同。复制 不需要引物，而是由RdRp以cRNA为模板从头合成vRNA。cRNA是vRNA的完 全转录物，它的5端是pppA核苷酸残基，3端没有Poly A尾。一般认为，cRNA的合成也是通过一个不依赖引物的机制进行的。病毒的转录与cR

33、NA的合成都是病毒RdRp通过与vRNA启动子相互作用而进行的，但病毒RdI岫在两者之间是具体 如何切换的还有待研究。流感病毒基因的表达调控流感病毒各个蛋白的表达时间各有不同：NP、NSl在早期表达，而HA、NA、 M1在病毒复制晚期表达37。这些表达时间的差异是由于这些蛋白在病毒生命周期 中功能不同造成的。如病毒复制早期需要NP的参与，同时需要NSl对抗宿主细胞的免疫反应；M1能够抑制病毒转录，还参与RNP的出核，因此只在晚期表达M1 蛋白381。另外病毒还可以通过RNA保守区域的3端的第四个位置来调控病毒表达。PBl、 PB2、PA的RNA片段的这个位置为碱基C，其余蛋白这个位置为u。c4

34、启动子 能下调转录上调复制；U4启动子上调转录下调复制【3 91。对c4和U4的启动子分析 表明它们之间的不同会影响与聚合酶的相互作用从而调节基因的表达【401。流感病毒基因的表达也可以在翻译水平进行调控。流感病毒通过多种机制抑制 宿主转录来增强自我转录，这些机制包括(一)降解宿主premRNA(二)抑制宿 主mRNA加工(三)降解细胞RNA聚合酶II(四)优先翻译病毒RNA。组装和释放RNP的出核：病毒RNA复制完成后，新合成的RNP在细胞核内组装。组装完 成后由M1和NS2蛋白参与RNPs的出核41，421。M1通过C端与vRNP发生相互作11万方数据用，M1还能与NP相互作用，同时M1还

35、与核酸酶结合，因此有假说认为M1能将 RNP从核基质释放出来43441。NS2蛋白能够与出核受体蛋白Crml分子直接作用， 形成RNPM1一NS2复合物45，461，并且由NS2负责募集出核蛋白并指导出核过程， 细胞内注入NS2的抗体能阻断这一过程471。NS2与M1结合位点正好是M1的核定 位信号，从而能够阻止已经出核的RNP在回到细胞核内。vRNP到达细胞浆之后，需要进行病毒粒子的组装。流感病毒需要利用宿主细 胞来组装成完整的病毒颗粒，然后从细胞中释放出去感染邻近的细胞。由于病毒组 装的过程并不十分精确，因此可能会产生不含或仅含少数几个vRNP的病毒粒子。 目前对病毒组装过程作用机制研究的

36、比较清楚的蛋白有HA、NA、M2481。HA、NA、 M2在流感细胞核糖体合成后被装运至ER进行折叠修饰，HA被组装成三聚体，NA、 M2被组装成四聚体。HA、M2之后被转运至高尔基体：HA加上半胱氨酸残基M2 棕榈基化。之后这三种蛋白都通过细胞膜顶上信号定位到组装位置上。另外对病毒 的8段RNA具体如何组装还并不十分清楚，目前有两种模型来解释这一的过程： 随机包装模型和特异性包装模型49-51。随机包装模型认为病毒基因组片段是被随机 选择并包装进病毒体中；而特异性包装模型则认为病毒各基因组片段中存在指导它 们被特异性包装进病毒体的包装信号，目前也发现这种信号存在于病毒RNA片段 的5和3末端

37、的非编码区和编码区中52-56】。病毒一般从极化细胞的顶侧出芽5刀。基因敲除与突变技术分析表明，M2蛋白 的末端对于病毒颗粒的形成十分关键，M2蛋白末端被删除或部分突变的病毒会生 成一种长形颗粒。存在于病毒脂质双分子层下的M1蛋白在病毒关闭衣壳和出芽过 程中起重要作用。此外，几个宿主蛋白也参与了病毒出芽。新生病毒粒子在离开宿 主细胞膜前，须由NA蛋白裂解除去唾液酸残基，如果没有这一过程，病毒粒子则 无法从细胞膜上释放出去5引。四固有免疫与流感病毒流感病毒感染将激活宿主细胞多种抗病毒反应来限制病毒的复制与传播。固有 免疫系统通过模式识别受体(Pattern recognition recepto

38、rs，PRRs)识别病原相关分 子模式(Pathogen associated molecular pattem，PAMP)诱发细胞的抗病毒应答反应【591。PRRs分为三类：Toll样受体(Tolllike receptors，TLRs)、RIGI样受体(RIGIlike receptors，RLRs)和NOD样受体(NOD1ike receptors，NLRs)。以上PRRs 的活化刺激宿主细胞产生大量的I型干扰素(type I interferon，IFN)、趋化因子和 细胞因子，最终导致众多抗病毒因子的表达。TLR3、TLR7以及RIGI识别IAV的 感染，再分别通过其下游分子刺激免疫

39、反应：TLR3通过TRIF(TIRdomaincontaining adapterinterferon-beta)刺激IRF3(interferon regulatory factor 3)和NF一1(B(nuclear12万方数据factorkappa beta)；TLR7通过MyD88(myeloid differentiation factor 88)激活IRF7 (interferon regulatory factor 7)和NFrB60，61，RIGI通过MAVS(mitochondrial antiviral signalling激活IRF3，IRF7和NFrB。PRR最终诱导产

40、生的IFN吖p最终在抗病毒反应中发挥了重要作用。IFN一0【B与细胞表面的干扰素受体(IFNAR)结合，激活JAKSTAT(janus kinasesignal transducer and activator of transcription)通路， JAKSTAT通路的激活导致STATl、STAT2和IRF9形成的转录因子复合体。形成 的转录因子复合物促进ISGs(IFNstimulated genes)的表达。这些ISG一般具有抗 病毒的功能，如目前发现的viperin、Mx、ISGl5、IFITM家族成员、TRIM家族成 员等62-701。面对宿主的免疫反应，流感病毒也进化出各种机制来

41、对抗宿主免疫反应。前面 提及的NSl蛋白就是对抗IFN抗病毒作用的关键分子：它不仅能够通过与RIGI 或TRIM 25直接相互作用来抑制IFN的产生，而且能够抑制ISG蛋白的抗病毒活 性。例如，IAV感染细胞时会激活PKR，激活的PKR接着磷酸化elF2a关闭细胞 蛋白的合成来对抗IAV的感染；而NSl能够抑制PKR磷酸化elF2a。NSl蛋白也 能抑制OAS和RNase L的抗病毒作用。NSl还能通过干扰细胞mRNA剪接、多聚 腺苷酸化和premRNA核输出过程减少IFNn0 mRNA水平。PB 1一F2是由8790个 氨基酸残基组成的小分子蛋白，PBl基因在核糖体翻译时由于扫描遗漏而从第四

42、个 起始密码予翻译形成。PBl一F2能与定位于线粒体膜上的MAVS(mitochondrial antiviralsignalling protein)发生相互作用并干扰其功能，从而抑制细胞干扰素的产 生。第二节TM蛋白抗病毒概述一TRIM蛋白简介机体的免疫系统能够通过产生天然免疫应答和适应性免疫应答发挥抗病毒作 用。天然免疫作为机体抵御病毒侵染的第一道防线，能够对各种病毒的共性特征进 行有效识别，并产生相应的抗病毒应答反应，而其主要机制是诱导干扰素的产生。 I型干扰素通过特异性结合病毒感染细胞和非感染细胞表面的干扰素受体 (Interferon“B receptor,IFNAR)复合体发挥抗

43、病毒作用。干扰素与受体的结合启动 JAK(Janus kinase)一STAT(signal transducer and activator of transcription)信号级联反应， 调控数百个干扰素刺激基园(interferonstimulated gene，isG)彭j表达【711。这些ISG的 表达，一方面会改变细胞的代谢和内环境，或进一步调节机体免疫反应，从而使机 体处于抗病毒状态；另一方面，有些ISG蛋白能够直接与病毒的某些组分发生直接 的相互作用，从而抑制病毒的复制。目前已经系统性鉴定了I型干扰素与II型干扰 素诱导机体细胞表达的300多个关键ISG分子，并全面系统地研究

44、了这些ISG分子13万方数据在细胞和动物水平的抗病毒作用效果，以及与病毒编码蛋白之问的相互作用和相互拮抗的分子机制【721。这些ISG成员中有很多是属于TRIM(The tripartite motif)家族。TRIM蛋白家族 是以由N端到C端的RING、Bbox、Coiledcoil结构域依次排列为结构特征的一类 蛋白731。TRIM家族蛋白的命名可以追溯到37种人和鼠的蛋白具有共同的RBCC 结构域的发现741。随着基因测序技术的进展目前发现的TRIM家族成员约80个左 右。TRIM家族蛋白有相似的生化和结构功能：通过CC区域定位于亚细胞结构域和TRIM蛋白E3泛素连接酶活性。TRIM家族

45、的结构功能特点使其能够调节细胞的转录分裂、分化、凋亡、细胞信号传导等。TRIM家族蛋白与癌症的发生发展、人类 自身免疫的失调、病毒和微生物的固有免疫应答等有很强的相关性。目前发现TRIM 家族蛋白能够抑制多种病毒的复制如HIV、Influenza virus、HBV等。本文着重介 绍TRIM家族蛋白与抗病毒免疫的关系。二TRIM蛋白家族结构特征RING结构域RING结构域一般由1 020个氨基酸残基组成【74】。RING结构域又可以根据第 5位氨基酸是半胱氨酸还是组氨酸细分为RINGC2和RINGH2t751。这两个氨基酸 位于RING结构域三维结构的核心，通过结合锌原子来维持三维结构稳定74

46、1。RING结构域参与同源或异源二聚体的形成【76，771。RING结构域可以通过自我 聚合不相关蛋白来参与生化反应，例如目前发现PML，BRCAl和BARDl等功能 不相关的蛋白能在体外聚合形成超大分子。此外，RING结构域还具有E3泛素连接酶活性，目前确认的具有此功能的蛋白包括：TRIM5a、TRIM25、TRIM22、TRIM44、 TRIM50等78-82】。这些蛋白能够介导自身与不同底物的泛素化来发挥功能，如 TRIM22通过RING结构域泛素化降解IAV病毒Np r791。Bbox结构域Bbox结构域是TRIM蛋白的重要结构特征，也是锌离子结合结构域【74，831。根 据保守半胱氨

47、酸和组氨酸的数目和空间位置不同可以将Bbox结构域分为B1、B2 两种类型。大约14的人类TRIM蛋白含有串联的N端的B1和C端的B2序列。 目前发现只含有单独的一个Bbox结构域都是B2结构域。B-box结构域是TRIM蛋 白的最主要的特征结构域，但目前发现它也存在于其它非TRIM蛋白中如XNF7蛋 白831。目前还没有发现Bbox结构域的具体功能。Coiledcoil结构域 Coiledcoil结构域是由多个Q一螺旋缠绕形成的绳索样超二级结构，通常具有两万方数据到三个。该结构域主要参与TRIM蛋白问的同源寡聚作用，同时也较少的参与其 他蛋白的异源寡聚作用，促进大分子复合物的形成，以及决定蛋

48、白的亚细胞定位。 如TRIMl9可以同MIDl、MID2、TRIM27等多种蛋白分子聚集，形成核质体的大 分子量聚合体84。TRIM44通过coiledcoil结构域与TRIMl7相互作用调节TIRMl7 的泛素化和稳定性f8】。C端结构域TRIM家族蛋白C端通常会有一到两个不同长度和特征的结构域。其是人类 TRIM家族分类的依据，目前分为9个亚家族：COSFN3一B302一like domain(cI subfamily)、 COS-Acid Rich region(CII)、COSFN3(CIII)、B302 like or SPRY-containing(CIV)、no identifi

49、able Cterminal domainhomology(c-v)、PHDBROMO domain(Cvi)、immunogl【obulin-NHL repeats(CVII)、MATH domain(CVIII)、ARF domain(CIX)t851最常见的C端结构域是B302结构域。B302结构 域由SPRY结构域和PRY结构域融合在一起形成，该结构域可能参与蛋白和蛋白的相互作用【86】。B302结构域在对逆转录病毒的应答中发挥重要作用，例如TRIM5伍 相对其他没有B302的TRIM5变体来说对逆转录病毒具有一定抑制作用【87】。目前 已发现的具有抗病毒功能的TRIM蛋白一般都有B3

50、02结构域。B302也参与一些 TRIM蛋白的亚细胞定位。TRIM22定位于细胞核需要B302结构域的493、494位 氨基酸的参与8s】。三TRIM蛋白家族抗病毒功能介绍固有免疫是抵抗病毒感染的第一道防线，干扰素在固有免疫反应对抗病毒感染 时发挥了重要作用，而目前发现干扰素能够诱导很多TRIM蛋白高表达，这些高表 达的TRIM蛋白可以干扰不同病毒的各个复制阶段，这些说明TRIM蛋白在抗病毒 感染的固有免疫反应中发挥了重要作用。TRIM21与TRIM5、TIuM6、TRIM34等具有抗病毒功能的TRIM蛋白同处于11号染色体上。TRIM21的B302结构域能与位于细胞浆内的IgGl重链结合89

51、。 TRIM21能与结合病毒颗粒的抗体结合形成TRIM21一抗体一病毒复合物，再利用其RING结构域的E3泛素连接酶活性通过泛素依赖的蛋白酶解途径降解病毒901。 TRIM21抗病毒的机制揭示了一种新的细胞内的抗病毒机制，使得适应性免疫即使 在细胞内也能发挥作用。有意思的是TRIM21能够与FADD相互作用来抑制干扰素 的产生来调节固有免疫91。TRIM5抑制逆转录病毒的发现起始于发现恒河猴TRIM5a具有较强抑制HIV-1 复制的能力87，921。目前发现TRIM5能抑制很多逆转录病毒的复制包括MLV、HIV-1、 HIV-2、SIV、EIAV和泡沫病掣87，93母61。TR，IM5具有多种

52、剪切形式包括TRIM5a、p、万方数据扒6、等。TRIM5ct是其中唯一具有B302结构域的剪接体。而B302结构域在抑 制病毒复制时发挥了重要作用，B302能够识别并结合HIV-1病毒的衣壳蛋白CA， 抑制CA的脱壳来抑制病毒的复制【97，98。Coiledcoil结构域参与TRIM5蛋白多聚体 的形成，促进TRIM5对CA的结厶【991。TRIM5的RING结构域能与HW-1的Gag 蛋白相互作用，使病毒产量降低加01。目前发现有些TRIM家族蛋白并不直接与病毒相互作用而是通过各种信号通路 上调干扰素的表达来产生抑制病毒的效果。TRIM4与RIGI结合并在K一63位泛素 化来调节I型干扰素

53、的产生【1011。TRIM44能与VISA结合并增加VISA的稳定性来 刺激干扰素产生，提高其抗病毒能力1021。TRIMl4能够与MAVS结合通过IRF：3 和NFKB信号通路促进I型干扰素的产生来抑制流感病毒的复Ntl031。TRIM23通 过调节NEMO的泛素化参与TLR3和RIG1的抗病毒的固有免疫1041。有趣的是TRIM家族不仅存在正向调节抗病毒的成员，同时也存在逆向调节抗 病毒反应的蛋白。TRIM38通过降解TRIF来负向调节TLR一3介导的干扰素B的产 生1051。TRIM68通过降解与TFG(TRKfused gene)来负向调节干扰素B的产生1061。 TRIMl 1与TB

54、Kl结合来负向调节干扰素B的产生【1071。TRIM26能够泛素化降解IRF3 来负向调节TRIM26的产生1081。TRIM35通过泛素化降解IRF7来负向调节TLR7和TLR9途径介导的I型干扰素的产生1091。 TRIMl4及TRIM22抗病毒的研究进展TRIM22最先从干扰素aD刺激的Duadi细胞系的eDNA文库中分离出来，能 被干扰素非常高的诱导表达110，1111。TRIM22位于11号染色体，与TRIM5基因相 近1101。在多种细胞系(HOS、U20S、143B)内过表达TRIM22都能抑制HIV-1的 复制【1111。与TRIM50,基因不同，TRIM22主要抑制HIV-1

55、复制晚期，干扰HIV-1病 毒的释放1111。TRIM22能特异的与HIV-1的Gag蛋白相互作用，阻止其与细胞膜融 合，却不能与MLV和EIVA的Gag蛋白相互作用。TRIM22还能够与流感病毒的 NP相互作用并泛素化降解NP蛋白从而抑制流感病毒复制【791。TRIM22能通过与 NS5A相互作用抑制HCV病毒复制11 21。还发现TRIM22通过干扰HBV的核心启动 子来抑制病毒复制11 31。TRIMl4属于TRIM家族成员，TRIMl4的结构没有TRIM家族成员典型的 RBCC结构，TRIMl4缺少RING结构域，由一个BBOX结构域、Coiledcoil结构 域、和B302结构域组成

56、。TRIMl4能被I型干扰素诱导表达上调，其主要分布在 细胞线粒体附近1031。在HIV-1、SIV、IAV、HCV、RVl6、RVlB等病毒感染时都 发现TRIMl4表达升高【114J17】，以上都暗示TRIMl4可能具有广谱的抗病毒作用。 最近还发现TRIMl4在HEK293细胞内能激活多种免疫基因的表达来抑制sindbis16万方数据病毒的复制【118。TRIMl4能够通过RLR调节IRF3、NFKB的激活，并且TRIMl4 通过K63泛素化来招募NEMO蛋白来激活MAVS抗病毒途径1031。综上所述，TRIM家族蛋白结构各异但基本具有保守的RBCC结构域。TRIM 家族蛋白能够通过各种

57、途径参与对病毒抑制的固有免疫中。自从2004发现恒河猴 TRIM5a能够抑制HIV-1以来，目前发现很多TRIM家族蛋白具有抑制病毒的功能。 可以根据TRIM家族蛋白抑制病毒的机制粗略的将其分为两类，第一类是通过直接 与病毒蛋白相互作用来抑制病毒复制，如TRIM5a对HIV-1病毒的抑制。第二类是 通过各种信号通路来上调干扰素表达来加强固有免疫从而达到抑制病毒的作用。但 目前对于TRIMl4与流感病毒的关系并不清楚，对TRIMl4家族抗病毒的研究丰富 了人们对固有免疫抗病毒机制的认识同时也为研发抗病毒药物提供了新的思路。1718第二章材料与方法第一节实验材料和工具一分子生物学材料cDNA为A5

58、49细胞提取mRNA反转录得到。论文中的BiLC载体米白中国医 学科学院苏州系统医学研究所秦晓峰教授馈赠，pCMV-CHAFLAG载体购自碧云 天公司。引物由北京金唯智北京公司合成(表21)。TransTaq PCR SuperMix、DHloa感受态细胞和DNA Marker 2000 Plus购自北京全式金公司，限制性内切酶和T4DNA连接酶NEB公司，DNA小提试剂盒购自Genstar公司，反转录试剂盒、DNA 回收试剂盒购自Takara公司。4S Red Plus核酸染料(生工)，Trizol、Tris、NaCl (Invitrogen)，琼脂糖(Amresco)，FastStart

59、Universal SYBR Green Master(Roche) 分别购自上述所注明的公司。表21引物引物名称引物序列real-time TRd14F：5-AGGCTTCAGGCATACACGG-3real-time TRIMl4R：5一CTrGACGGGCTCAAAGGAG一3realtime GAPDHF：5一GAACGGGAAGCTCACTGG一3realtime GAPDHR：5GCCTGCITCACCACCTTCT-3realtime ISGl5-F：5一GCAATGCACTGGAGTTCGGT-3real。time ISGl5R：5CTTCAGCTCTGACACCGACA一3T

60、RIMl4not IF：5AAATATGCGGCCGCTATAAAATGGCGGC托GCGGCGA-3TRIMl4-pac IR：5-CCTTAATTAAGGCTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGGCAGCCGGGGGATG-3GFPnot TF5-AAATATGCGGCCGCTATAAAATGGACTACAAAGACGATGACGA-3GFP-pac IR：5CCTTAAlrAAGGTCACAGGGATGCCACCCG一3TRIM22not IF5AAATATC汇GGCCGCTATAAAATGGAT丌cTCAGTAAAGGTAGACA一3TRlM22pac IR：5-CC

61、TTAATTAAGGCTACTTGTCGTCATCGTCIqffGTAGTCGGAGCTCGGTGGG一319M2CHAF5。CGCGGATCCGCGAT盱AGTCTTCTAACCGAGGTC-3M2CHAR：5-TGCTCTAGAGCAACTCCAGCTCTATGTTGAC一3NPCHAF5CGCGGATCCGCGATGGCGACCAAAGGCACC一3NPCHAR：5TGCTCTAGAGCATTAATr(订CGTACTCCTCTGCATTG-3STINGC-F5CGCGGATCCGCGATGCCCCACTCCAGCCT3STING-CR5TGCTCTAGAGCAAGAGAAATCCGTGCGGAGAG一3TR订14SPRY_F：5TGCTCTAGAGCATA