TNF-α诱导的胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢变化的分子机制分析

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称ACRP30adipocyte complementrelated脂肪细胞补体相关蛋白30protein of 30lADPNadiponectin脂联素ATGLadipose triglyceride lipase脂肪细胞甘油三酯酶 ALBPadipocyte lipidbinding protein脂肪细胞脂质结合蛋白 bpbase pair碱基对BGblood glucose血糖BSAbovine serum albumin牛血清白蛋白cDNAcomplementary DNA互补DNACPT-lcarnitine

2、palmitoyltransferasel肉毒碱脂酰转移酶一1ddH20dehydronium H20去离子水DEPCdiethyl purocarbonate二乙基焦碳酸盐DMdiabetes melitus糖尿病dNTPdeoxyribonucleoside triphosphate脱氧核糖三磷酸EBethidium bromide溴化乙啶EPeppendorf微量离心管 FABPfatty acidbinding protein脂肪酸结合蛋白 FFASfree fatty acids游离脂肪酸GIRglucose infusion rate葡萄糖输注率GLUTglucose transp

3、orter葡萄糖转运体HGPhepatic glucose production肝糖输出率HMGCR3-hydroxy3methylglutaryl羟甲基戊二酸单酰辅酶A还coenzyme A reductase原酶HSLhormone sensitive lipase激素敏感性脂肪酶ILinterletIkin白介素重庆医科大学硕士研究生学位论文InsRinsulin receptor胰岛素受体 IRSinsulin receptor substrate胰岛素受体底物 IRinsulin resistance胰岛素抵抗LDLRlow density lipoprotein receptor低

4、密度脂蛋白受体 MAPKmitogenactivated protein kinases丝裂原活化蛋白激酶 PAIplasminogen activator inhibitor纤溶酶原激活物抑制剂 P13Kphosphatidylinositol 3-kinase磷酯酰肌醇三激酶 PBSphosphate buffered Saline磷酸盐缓冲液PMSFphenylmethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟PPARperoxisomeproliferator-activated过氧化物酶体增殖物激活受receptor体PVDFpolyvinylidene fluoride聚

5、偏二氟乙烯RNAribonueleie acid核糖核酸mI矾Amessenger RNA信使RNAI之T-PCRreverse transcriptpolymerase逆转录聚合酶链反应chain reactionRCF(g)relative centrifugal force相对离心力SREBPsterol regulatory element binding固醇调节元件结合蛋白proteinTBEtrisBoric AcidEDTA三羟甲基胺基甲烷一硼酸一四乙酸缓冲液TBStris buffered saline三羟甲基胺基甲烷缓冲液TBSTtris buffered saline wi

6、th tweenTBS一吐温缓冲液TCtotal cholesterol总胆固醇TGtriglyceride甘油三酯TNFtumor necrosis factor肿瘤坏死因子2重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任学位论文作者签名：1

7、丕玉卑日期：二旦墅皇二三L学位论文版权使用授权书本入完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学 位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文论文作者签名：丕丝塑l指导教师签名：岔生日期：巡：丝：缨重庆医科大学硕士研究生学位论文TNFQ诱导的胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢变化的分子机制研究 摘要目的：探讨TNFQ诱导的胰岛素抵抗(IR)小鼠

8、糖脂代谢的变化及其分子机制。方法：将20只健康雄性C57BL6J小鼠随机分为TNFa干扰组 (TNF组，n=10)和正常对照组(NC组，n=10)，给予TNF组腹腔注 射TNFa(699kg体重天)，NC组注射等体积生理盐水，共7天；取 血浆及脂肪、肝脏组织样本。测定血浆Fins、FBG、TC、TG、FFAs等糖脂代谢一般指标；测定脂肪组织及肝脏组织中与葡萄糖、甘油三 酯、胆固醇代谢相关的基因mRNA或(和)蛋白的表达变化以及核转 录因子过氧化物酶体增殖物激活受体PPARs的表达变化并研究它们 之间的相关性。结果：1)血浆糖脂代谢一般指标测定结果：与NC组相比较， TNF组小鼠Fins、FBG

9、明显升高(pO01)，FFAs亦升高(pO05)。2)葡萄糖代谢相关基因的表达变化：TNF组脂肪组织脂联素mRNA和血浆脂联素蛋白 表达下降(均p001)，脂肪组织visfatin rnRNA和血浆visfatin蛋白表达降低(p005和p005)。3)甘油三酯代谢相关基因的表达变化：TNF组脂 肪组织ATGL mRNA和蛋白表达均明显下降(pO01和p005)。 4)胆固醇代谢相关基因的表达变化：两组小鼠 间肝脏组织SREBP2、HMGCR、LDLR mRNA的表达无明显差异(均 为p005)。 5)核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体PPARs 的表达变化：n师组脂肪组织PPARy mRN

10、A表达明显减弱(pO05)，与脂联素mRNA表达和ATGL mRNA表达显著正相关(pO01和PO05)。同时，肝脏组织PPAR6 mRNA表达明显减弱(p005)。结论：TNFo【过表达下调脂肪组织脂联素、visfatin、ATGL等糖 脂代谢相关基因以及脂肪组织中PPARy、肝脏组织中PPAR8等PPARs 家族基因的表达，其中对脂联素和ATGL转录的下调作用可能通过 PPAR7途径。TNFa对肝脏组织中HMGCR、SREBP2、LDLR等胆固醇代谢相关基因表达的影响较小。关键词：TNFQ，胰岛素抵抗，糖脂代谢，脂联素，Visfatin，ATGL，PPARl,，PPAR84重庆医科大学硕士

11、研究生学位论文RESEARCH OF THE MoLECULAR MECHANISM FOR THE GLUCoSELIPID METABoLISM CHANGE IN TNFALPHA INDUCED INSULIN RESISTANT MICEABSTRACTobjective：To investigate the effects and the molecular mechanism of TNF一0【induced insulin resistance on the related genes of glucose-lipid metabolism in miceMethods：Mal

12、e C57BL6J mice were randomly divided into 2 groups The mice were given an intraperitoneal inj ection of TNFo【(TNF group，6I_tgkgd；n=1 O)and saline(NC group，n21 0)for 7 daysAfter 7 days，we analyzed the in vivo role of n晒一0【on some metabolism-related genes and adipocytokines in the development of insul

13、in resistanceResults：1)耵师一0【treament resulted in a marked increasing fasting blood glucose，insulin，free fatty acids(FFA)compared with NC group(p001 and pO05)；2)The adipocyte ADPNmRNA expression in adipose tissues and ADPN protein in plasma were decreased(p00 1)；visfatin mRNA expression in adipose ti

14、ssues and visfatin protein in plasma were decreased(pO05 and pO05)；3)The ATGL mRNA expression and ATGL protein in adipose tissues were decreased(p001 and p005)4)The mRNAexpression of SREBP一2，HMGCR，LDLR mRNA in liver tissues were notsignificantly changed(pO05)5)The PPAR7 mRNA expression in adipose ti

15、ssues were significantly decreased(PO05)；the PPAR8 mRNA expression in liver tissues were significantly decreased(PO05)6)In adipose tissues，PPART and ADPN mRNA expression were significantly positively related(p001)，PPAR7 and ATGL mRNA expression were significantly positively related(pO05) Con clusion

16、：TNF0【_downregulates some glucose-lipid metabolismrelated genes such as ADPN，visfatin，ATGL in adipose and some PPARsfamily genessuch asPPARy in adiposeand PPAR8in liver；the downregulation effects to ADPN and ATGL transcription might be throughP呐pathwaysTNFohad small influences to cholesterol metabol

17、ismrelated genes such as HMGCR,SREBP-2，LDLR in liver tissuesKey words：TNF(1，Insulin resistance，Glucoselipid metabolism， Adiponectin，Visfatin，ATGL，PPAR7，PPAR86重庆医科大学硕士研究生学位论文TNFQ诱导的胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢变化 的分子机制研究L厶J一刖昌胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合 后生物效应低于正常，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的摄取减 少和抑制肝脏葡萄糖输

18、出的作用减弱。IR是糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等疾 病的共同病理生理改变，尽管近年来世界各国都投入了大量的人力物力进行研究， 但IR的发生机制目前仍不十分清楚。近年来慢性亚临床炎症及炎性因子在IR发病 机制中的作用日益受到重视，在慢性炎症过程中IR和炎性反应相互促动，引起机 体一系列内环境的改变，从而促进病变进展。炎症是机体对病变的防御反应，对于消除病害和对局部组织损伤修复具有重 要作用，它可由非特异性和特异性免疫介导。慢性亚临床性、非特异性免疫介导 的炎症，包括非特异性的炎症细胞、炎症细胞分泌的炎症因子和肝脏产生的急性 反应物质，后两者常常被称为炎症标志物。目前认为与IR有关的炎症因子主要

19、包 括肿瘤坏死因子仅(tumor necrosis factor-a，TNFa)、白介素6(interleukin6，IL6)、 游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)、纤溶酶原激活物抑制剂一1(plasminogen activatorinhibitor-1，PAI1)及抵抗素等。其中TNFQ是较早发现的与IR密切有关的炎性因子，它是由单核细胞分泌的一种重要的细胞因子，也可由脂肪细胞、血管内皮细 胞和肾小球系膜细胞等合成分泌。尽管已有研究表明TNF0【使游离脂肪酸升高导致 肥胖和IR并且在IR动物和人类2型糖尿病(T2DM)TNFa mRNA表达和蛋白浓度 明显升高【H】，

20、但其作用机制并不十分清楚。在前期实验中本课题组利用扩展胰岛素钳夹术探讨了TNFa过表达导致实验 小鼠胰岛素敏感性的变化，发现TNFa处理使小鼠外周组织胰岛素敏感性降低，机 体产生了明显的胰岛素抵抗。本研究选用C57BL6Jdx鼠为实验对象，通过腹腔注 射TNFa重组蛋白构建IRdx鼠模型，测定了实验小鼠血浆中糖脂代谢的一般指标以 及肝脏、脂肪组织中与糖脂代谢相关的基因在核酸或蛋白水平的表达变化，旨在 进一步研究TNFQ诱导的IRd鼠糖脂代谢变化的分子机制。7重庆医科大学硕士研究生学位论文本课题的技术路线 动物模型的构建20只雄性C57BL6J小鼠随机分成二组正常对照组TNFa干扰组(NC GR

21、OUP,n=10)(TNF GROUP,n=10)血浆糖脂代谢测定糖脂代谢相关一般指标测定基因mRNA或蛋白的表达变化测定血浆Fins、FBG、TC、 TG、FFAs等指标测定葡萄糖测定甘油三 测定胆固醇 测定过氧化物 代谢相关基酯代谢相关 代谢相关基 酶体增殖物激 因ADPN、基ATGL、 HMGCR、 活受体PPARvisfatin、HSL、CPTlSREBP2、Y、PPAR a、 FGF2l等等的表达变LDLR等的PPAR 6的表达 的表达变化化表达变化变化8重庆医科大学硕士研究生学位论文材料与方法1主要试剂生理盐水重庆天圣制药胰岛素测定试剂盒中国原子能研究所甘油三酯测定试剂盒英国RAN

22、DOX公司总胆固醇测定试剂盒英国凡州DOX公司游离脂肪酸测定试剂盒英国RANDOX公司小鼠脂联素测定试剂盒美国PHONIX公司小鼠肿瘤坏死因子吨英国PEPROTECH公司DEPC美国mmresco公司RNAiso Reagent大连TaKaRaMMLV逆转录酶大连TaKaRaIA酶抑制剂大连TaKaRaOligo d(331 8大连TaKaRarTaq酶大连TaKaRadNTP(25mM及0mM)大连TaKaRaMgCl2大连瑚(aRa6xLoading Buffer大连TaKaRaDNA Marker DL2000大连TaKaRa琼脂糖大连T2敝aRa三氯甲烷(分析纯)重庆川东化工异丙醇(分

23、析纯)重庆川东化工乙醇(分析纯)重庆川东化工组织蛋白抽提试剂上海申能博彩公司PMSF上海申能博彩公司抗小鼠visfatin美国SantaCruz公司9重庆医科大学硕士研究生学位论文抗小鼠13-actin(1为参)武汉博士德生物工程抗小鼠ATGL美国Cayman生物技术公司 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG北京中杉金桥生物技术 辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG北京中杉金桥生物技术 化学发光试剂盒(KC一420)康成生物技术公司PVDF膜美国Roche公司考马斯亮蓝G250美国AdllleSCO公司考马斯亮蓝R250美国Allesco公司牛血清白蛋白美国Sigma公司封闭蛋白干粉武汉博士德生物工程公司

24、2主要仪器高速冷冻离心机德国Heraeus公司低温冰箱日本SANYO公司血糖仪强生(中国)医疗器材 SN695A型放射免疫分析仪上海日环技术开发公司 日立7020型全自动生化分析仪日本日立公司液体闪烁计数仪美国Beckman公司制冰机XW-A108T(国产)超净工作台苏州净化设备厂恒温水浴箱上海精宏实验设备高温烤箱上海浦东荣丰科学仪器高压蒸汽灭菌锅上海医用核子仪器厂恒温摇床Rosi 1000(美国)PCR仪BIO-RAD Gradient Cycler(美国)电泳仪BIORAD(美国)凝胶数字成像系统BIORAD(美国)lO重庆医科大学硕士研究生学位论文紫外分光光度计岛津UV-265(日本)M

25、K3型酶标仪芬兰Thermo公司3动物模型构建及样本采集健康雄性C57BL6J小鼠(购自第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所 实验动物中心)20只，体重在26329，鼠龄1214周，分笼喂养在温度2025 动物室中，明暗周期为12小时(8am8pm)，实验前适应性饲养一周，自由摄食 饮水。将实验小鼠随机分为正常对照组(NC组，n=10)和TNFa处理组(TNF 组，n=10)，TNF组腹腔注射TNF-a重组蛋白(6 pgl(g体重天，每天分两次注 射，9am和6pm)，NC组腹腔注射等体积生理盐水，连续注射7天。随即禁食6h后采集血浆及脂肪、肝脏组织样本，血浆样本放至20冰箱储存待用，组织样

26、本采集后立即放入液氮，然后转入80冰箱储存待用。实验过程中对动物的饲 养及取材均遵守实验动物管理与保护的有关规定。4血浆糖脂代谢一般指标测定41血浆胰岛素的测定采用放射免疫法测定：胰岛素测定试剂盒购自中国原子能研究所。步骤如下： 待试剂充分溶解，平衡至室温后，即按下表顺序加样及操作。心胰岛素放免分析操作程序表单位：uIT管特异管零标准管标准管待测管温育液200100胰岛素标准lOO待测血样100重庆医科大学硕士研究生学位论文125I一胰岛素100100100100100胰岛素抗体100100100充分摇匀，37C温育2个小时分离试剂500500500500充分摇匀后，室温静置15分钟，3500

27、转分离心15分钟，弃上清液后，沉淀计数60秒。42血浆FBG、FFAs、TC、TG测定空腹血糖(FBG)：葡萄糖氧化酶法(日立7020型全自动生化分析仪测定)； 血浆游离脂肪酸(FFAs)-酶法测定(日立7020型全自动生化分析仪测定)； 甘油三酯(TG)：酶法测定(日立7020型全自动生化分析仪测定)； 总胆固醇(TC)：酶法测定(日立7020型全自动生化分析仪测定)。5脂肪与肝脏组织中糖脂代谢相关基因mRNA表达的测定51溶液配制和器材处理511溶液配制(1)0IDEPC水：取DEPC lml加入lLddH20中，混匀备用。 (2)757,醇：75ml无水乙醇中加入25ml经DEPC处理过

28、夜并高压的ddH20。 (3)TBEI ris 549，硼酸2759，05M EDTA 20ml，ddH20溶解，并用ddH20定容至1000ml，即配成5xTBE的贮存液，应用前稀释成05xTBE的工作液。512器材处理逆转录所用器材均需进行去除RNase处理：将加样枪头、EP管、匀浆管、 培养皿、手术器械完全浸泡在01DEPC的去离子水中处理过夜；加样枪用棉球 蘸无水乙醇彻底擦拭干净；所有玻璃器皿在使用前应酸洗，蒸馏水冲洗后置 150180烤箱中烘烤4h以上，后经120高压灭菌30 min，80烘干备用。12重庆医科大学硕士研究生学位论文52引物准备(设计、合成、溶解、稀释)在美国国立生物

29、技术信息中心(NCBI)官方网站查找小鼠各基因的mRNA表 达序列，用primer5软件自行设计引物，由大连宝生物技术公司合成，使用时按 照说明书操作用高压ddH20先溶解为100M的储存液，再稀释为101tM的应用 液。各引物的具体序列如下：基因名称(编号)引物序列产物长度F：5GCTGTCCCTGTATGCCTCT3，p-actin(NM_007393)220bpR：5GATGTCACGCACGATTTCC3，I-actinF：5CCACTGCCGCATCCTCTTCCTC3400bp(NM 007393)R：5TCCTGCTTGCTGATCCACATCT3p-actinF：5TCCAGC

30、CTTCCTTCTTGGGTAT3(NM_007393)559bpR：5，GTCGCCTTCACCGTTCCAGT3，ADPNF：5-CTCTTAATCCTGCCCAGTCAT-3507bp(NM_009605)R：5-GAGGCTCACCTTCACATCTTT-3visfatinF：5，ATTCCCGCCACAGTATCT-3，337bp(NM_02 1524)R：5，TCCCGATTGAAGTAAAGG3，FGF2lF：5-CACCGCAGTCCAGAAAGT3，385bp(NM_020013)R：5，CCTGTAAAGGCTCTACCATG3，ATGLF：5，TGCTACCCGTCTGC

31、TCTTTC3，169bp(NM_025802)R：5-GACCTGATGACCACCCTTTC-3HSLF：5，GACTCACCGCTGACTTCC-3，(NM 010719)161bpR：5，TGTCTCGTTGCGTTTGTAG-3CPT1F：5，GAGCGACTCTTCAATACTTC3，(NM 013495)492bpR：5-CTCTGCGTTTATGCCTATC3，HMGCRF：5-TGGCAGGACGCAACCTCTAT3，(NM_008255)222bpR：5-TGACGGCTTCACAAACCACA-313重庆医科大学硕士研究生学位论文SREBP2F：5-CTGGTACGCT

32、GGTTACTCAA3，263bp似F_374267)R：5-GCTGTCAGGTGGATCTCAAT3，LDLRF：5，GAACTCAGGGCCTCTGTCTG-3188bp(NM 010700)R：5-GAAACCATGCGTGTATCCCT3，PPAR7F：5-GAAACCATGCGTGTATCCCT3，266bp(U_01841)R：5，AGACCACTCGCATTCCTTT-3，PPARnF：5，TACGGCAATGGCTTTATCAC3，209bp(NM 011144)R：5，CCCTCCTGCAACTTCTCAAT3，PPAR6F：5，CTTCTTCCGCCGGACAATCC3，

33、310bp(NM_01 1 145)R：5，GCTCCGGGCCTTCTTTTTGG-3注：F：上游引物；R：T游引物53脂肪组织和肝脏组织总RNA提取(1)脂肪组织总RNA提取将EP管、玻璃匀浆器(OIDEPC水处理、高压并烘干)置冰上预冷。快速称取100mg左右的脂肪组织标本，迅速加入到己加有TRIzol试剂的 玻璃匀浆器中(每只匀浆器事先加入10ml TRIzol试剂于冰上)，彻底匀浆，冰上 裂解约30rain。4C 120009离心lOmin。吸弃上层油质。将下层液体吸出(不可吸到沉淀)，置入另一干净EP管内。按02ml氯仿mlTRIzol的比例加入氯仿，用力振摇混匀约15sec，15

34、30。C 静置5min，4C，120009离心15min(氯仿抽提可重复一次)。吸上层水相至DEPC处理过的15ml的离心管中，按1：l比例加入异丙 醇，轻轻上下颠倒混匀，15-30C静置10min，4C，120009离心lOmin，弃上 清，留沉淀。加入OIDEPC水配制的75冷乙醇，短暂振摇混匀，4C，120009离 心5min，弃上清(可重复洗涤RNA沉淀一次)。室温空气中干燥RNA沉淀至半透明状，约5min，加入适量的RNase free水溶解。所得RNA立即进行逆转录反应合成cDNA或置80冰箱暂存。14重庆医科大学硕士研究生学位论文(2)肝脏组织总RNA提取将EP管、玻璃匀浆器(O

35、1DEPC水处理、高压并烘干)置冰上预冷。快速称取约50mg肝脏组织标本，迅速加入到己加有TRIzol试剂的玻璃 匀浆器中(每只匀浆器事先加入10ml TRIzol试剂于冰上)，彻底匀浆，冰上裂解 约30min。4C，120009离心10min，将上层液体吸出(不可吸到沉淀)，置入另一干净 EP管内。接下来的步骤与脂肪组织总RNA提取(到)相同。 (3)RNA质量及浓度测定 采用1O琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。用紫外分光光度计测定提取的RNA在260nm和280nm处的吸光度值A260、A280，确定RNA的纯度及浓度，A260A280应在1820之间。54逆转录反应反应体系(总量60

36、Itl)在管中配制下列模板RISA弓l物混合液试剂名称浓度用量 总RNA(脂肪或肝脏)48Itg(约7591) Oligo d(T)18501上M69lRNase free H20225“l混匀，70保温lO分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上离心数秒钟使模板l州引物的变性溶液聚集于管底部在上述管中加入下列逆转录混合试剂MMLV Buffer512tld1、TP10mM39lRNA酶抑制剂40Ulxl159lMMLV逆转录酶200Ugl151alRNase free H2069l42(2保温1小时，700保温15分钟后冰上冷却得到的cDNA 溶液用于PCR扩增或20保存15重庆医科大学硕士研究生学位

37、论文55 PCR反应(1)反应体系组成(总量50I-tl体系，冰上操作)试剂名称浓度用量PCR Bu艉r10x501Mgcl225mM4山dNTP25raM4plddH2029。75止cDNA301上游引物10州21xl下游引物100M201rTaq酶5UIxl0250,1(2)预实验一：温度梯度PCR(确定最适退火温度)试剂分装，加样：按前述反应体系，根据需要配制35管量的总反应体系，再均分成相应管数(每管设定不同的退火温度)。PCR反应预变性943分钟lcycle变性9430秒钟 从50至60设数个不同的温循环退火35cycle度梯度，共3-5管。30秒钟延伸7250秒钟加长延伸725分钟

38、lcycle凝胶电泳及成像根据产物片段大小配1-2的琼脂糖凝胶(加入适量EB)，取适量PCR产 物与6xloading buffer混匀后上样电泳，1 80V恒压电泳1 530分钟，置Bio Rad 凝胶成像仪上成像。分析电泳结果，确定出最适的的退火温度。16重庆医科大学硕士研究生学位论文(3)预实验二：PCR扩增反应指数期确定为保证RT-PCR半定量的准确性，在确定最适退火温度后进行PCR指数期实 验。按PCR预实验一的体系分装好试剂及标本。置PCR仪内，按各基因已经确 定的反应条件进行PCR反应，循环数设为38个。在PCR扩增反应过程中，依次 在预定的不同循环数时，暂停PCR仪，取出一管，

39、置于冰上，继续反应，直到最 后一管取出。最后一起进行凝胶电泳及成像。根据电泳条带结果确定各基因扩增 指数期时的最佳循环数。(4)各样本PCR实验试剂分装，加样(509l体系每管，冰上操作) a按下列组成配制PCR反应液以做20个标本为例加上内参基因共40管，考虑到分装损耗，故实际按42管计算。试剂名称浓度每管用量20个标本用量实际用量 PCR BufferlO5btl5422109l Mgcl225mM49l4x421681xl(1NTP25mM4pl4x421689lddH202975F12975421250111rTaq酶5 Ugl025ItlO25x421159l b混匀，每管881t1

40、分成20管，再在各管中分别加入各eDNA标本6p1 c混匀，再将各管均分成两管，每管46pi，其一为待测管，另一管为内参管共40管d在上述各管中继续加各基因引物待测管加待测基因上下游引物，内参管加内参基因上下游引物。待测基因引物10pM待测管中加上下游引物各29l内参基因引物10p,M内参管中加上下游引物各29l e混匀离心各管，放入PCR仪内。PCR反应反应条件为：预变性94。C，2 rain，1次循环_变性94。C，30 s；退火52-,55。C，17重庆医科大学硕士研究生学位论文30 s；延伸72。C，50 s(循环数：依据指数期不同选取不同的循环数)_加长延伸722，5 min，1次循

41、环。根据各基因预实验结果确定参数设置(如前所述，本文中 各基因PCR参数的差异主要在退火温度和循环数两项，其余项相同，具体见表)。基因类别测定基因产物长度退火温度循环数 内参基因Bactin(脂肪或肝脏)220 bp52552426 13-aetin(H旨肪或肝脏)400 bp52552325 pactin(脂肪或肝脏)559 bp52552325葡萄糖代谢ADPN(脂肪)507 bp5522相关基因visfatin(n旨肪)337 bp5536FGF21(肝脏)385 bp5235甘油三酯代ATGL(n旨肪)169 bp5527谢相关基因HSL(脂肪)161 bp52535CPT-l(脂肪)

42、492 bp5532胆固醇代谢HMGCR(肝脏)222 bp5330相关基因SREBP2(肝脏)263 bp5334LDLR(肝脏)188 bp5327过氧化物酶 PPAR丫(脂肪)266 br,5529体增殖物激PPAR，l,(肝脏)266 bp5532活受体基因PPARa(肝脏)209 bp5527PPARS(肝脏)310 bp5335凝胶电泳及成像根据产物片段大小配1-2的琼脂糖凝胶(加入适量髓)，各取适量待测 管及相应内参管PCR产物1：l混匀，并与6xloading buffer混匀后上样电泳，180V 恒压电泳1530分钟，置Bio Rad凝胶成像仪上成像。用quantity on

43、e软件分析 灰度值。以各样本目的基因条带灰度值与相应内参基因条带灰度值的比值作为该样本的相对表达值。18重庆医科大学硕士研究生学位论文6血浆与脂肪组织中糖脂代谢相关基因蛋白表达的测定61 ELISA法测定血浆脂联素蛋白(1)试验前仔细阅读操作指南，把所有的试剂恢复至室温。 (2)按说明配制不同浓度的标准液：将各小鼠血浆样本进行l：2000稀释。 (3)取相应量的包被孔板，在各孔中分别加入100pl各标准液及稀释血浆样本，空白对照孔不加样。(4)用封口膜封口，300400rpm摇床上室温孵育2h。 (5)倒掉所有液体，拍干，每孔加入3509l洗涤液，洗四次，最后拍干。 (6)每孑LJ3nk 1

44、00I-tl一抗，封口，300400rpm摇床上室温孵育2h。 (7)重复步骤5。(8)每孑LN)k 1 oo山二抗(SAHRP)，300400rpm摇床上室温孵育30min。 (9)重复步骤5。 (10)各孔加入100pl底物液(TMB)，封13避光，300400rpm摇床上室温孵育30min。(11)每孔加入1009l终止液，颜色应该由蓝变黄，20rain内检测。 (12)用酶标仪测定各孔450mn处的光密度值OD450。 (13)绘制标准曲线，通过标准曲线查得各稀释样品的浓度值，乘以稀释倍数即得血浆中脂联素的浓度。62 western blot法测定血浆visfatin蛋白和脂肪组织AT

45、GL蛋白621主要试剂配制(1)30(VV)丙稀酰胺：丙稀酰胺299，N，N一亚甲双丙稀酰胺lg，双蒸水定容至100 ml。045pro滤膜过滤后，棕色瓶4C保存。(2)15molL Tris-HCI(pH88)-Tris45439，双蒸水200ml溶解后用浓盐酸调pH至88，双蒸水定容至250ml。19重庆医科大学硕士研究生学位论文(3)10 molL TrisHCI(pH68)-Tris2419，双蒸水150 ml溶解后用浓盐酸调pH至68，双蒸水定容至200 ml。(4)10 molL TrisHCI(pH75)Tris2419，双蒸水150 ml溶解后用浓盐酸调pH至75，双蒸水定容至

46、200 ml。(5)10过硫酸铵： 过硫酸铵019，双蒸水定容至lml。(4C保存，一周内有效)(6)10SDS：SDSlog，双蒸水定容至100 ml。(7)考马斯亮蓝G-250溶液(测蛋白含量)：考马斯亮蓝G-250 50 mg，95乙醇25 ml，磷酸50 ml，双蒸水定容至500ml。 配制时先用乙醇溶解考马斯亮蓝燃料，再加磷酸和水，混匀后，滤纸过虑。(8)还原型5xSDS上样缓冲液：05 molLIrisHCI(pH68)25ml 二硫苏糖醇(DTT，MWl 545)0399 SDS O59溴酚蓝0025 g甘油25ml 混匀后，分装于15ml离心管中，4C保存。(9)10xSDSP

47、AGE电泳液缓冲液(使用时稀释至1即为应用液)Tris(MWl2114)1519 甘氨酸(MW7507)72019 SDS 509加蒸馏水约400ml充分溶解，定容至500ml，室温保存(1 0)(半干转法)正极转移缓冲液(250m1) 10xSDSPAGE电泳液缓冲液1 75m1 甲醇50ml蒸馏水25ml 混匀即可(11)(半干转法)负极转移缓冲液(250m1)20重庆医科大学硕士研究生学位论文10xSDSPAGE电泳液缓冲液25ml甲醇50ml 蒸馏水175ml 混匀即可(12)TBS缓冲液1 molLtrisHCI(pH75)1 0ml NaCI 889加蒸馏水至1000ml(13)T

48、BST缓冲液(含005Tween20的TBS缓冲液) 20T叭en 20 165mlTBS 700ml混匀即可(14)封闭液(含5脱脂奶粉的TBST缓冲液) 脱脂奶粉59TBST 100ml622 Western blot法检测血浆中visfatin蛋白水平6221 SDSPAGE电泳(1)配制SDSPAGE电泳胶：12分离胶，5浓缩胶的配方表。试剂名称12分离胶(75m1)5浓缩胶(3m1)ddH20245 ml21ml30丙稀酰胺3Oml05ml15molLTris-HCI(pH 88)19ml10molLTris-HCI(pH68)038ml10SDS75pl301al10过硫酸铵759

49、l301xlTEMED3 Itl39l21重庆医科大学硕士研究生学位论文先配分离胶，充分混匀后立即倒胶，用加样枪沿玻璃板缓慢注入，直至分离 胶项部距玻璃板顶端22cm(红色标志线上方约2ram)，蒸馏水压胶。室温聚合约3050min，当水胶之间出现一条折射线时，说明胶已凝固，再等510min，弃去上层水，并用滤纸尽可能吸干。插入干净的梳子，灌制浓缩胶。置室温下聚合3040min。(2)上样：将5“l血浆样品用1009l PBS缓冲液稀释，取已稀释样品329l加5蛋白上样 缓冲液89l，100。C变性5min。离心后，取209l小心上样。同时上预染蛋白 Marker209l。最后在上样孔两侧的未

50、上样的孔中加入209l l x蛋白上样缓冲液，以 防止泳道扩散。每次均取同一只正常组小鼠的血浆与各样本同时测定，作为对照，以保证不同批次测量结果的可比性。 (3)电泳：5浓缩胶，恒压80v，30min左右，电泳至溴酚蓝染料前沿从浓缩胶进入分离胶时，即调节电压进行分离胶电泳；12分离胶，恒压120V,2 h左右，电泳至 溴酚蓝染料到达分离胶底部为止。6222转膜(半干转) (1)电泳结束后，从玻璃板中取出凝胶，切除浓缩胶，留分离胶，并根据预染蛋白Marker切取目的蛋白所在部分的凝胶。用平皿倒取适量负极缓冲液，将切 取下的凝胶放置入负极转移缓冲液中室温平衡20-45分钟。(2)剪好l张PVDF膜

51、和6张适宜大小的滤纸(正极负极各3张)。将负极滤纸 放置于负极转移缓冲液中(与胶一起)室温平衡20-30分钟。分别用两个平皿倒取 适量甲醇和正极缓冲液，将PVDF膜先在甲醇中浸泡15-30秒后取出，立即放置 入正极转移缓冲液中室温平衡10-20分钟。将正极滤纸放置入正极转移缓冲液中 (与膜一起)室温平衡1 0-20分钟。(3)从下至上依次将3层正极滤纸、PVDF膜、胶、3层负极滤纸叠放到转膜 仪的正极金属板上(注意每一步均应避免气泡，使彼此贴紧)。将负极金属板盖于 负极滤纸上(注意与四个卡扣正确吻合)。(4)接通转膜仪电源，恒压15V，转膜15-20分钟，转膜过程中注意观察电22重庆医科大学硕

52、士研究生学位论文流的变化情况。转膜完毕后打开转膜仪，取出PVDF膜进行后述的封闭、免疫反应、化学发光成像等步骤。6223封闭及免疫反应(1)封闭称取一定量的封闭蛋白干粉溶于TBST缓冲液中以配制5的封闭液。将 PVDF膜置入封闭液中，4冰箱中过夜。(2)一抗孵育及洗涤量取适量TBST缓冲液将相应量一抗(羊抗鼠visfatin多克隆抗体)进行l：200 稀释，将PVDF膜从封闭液中取出并置入稀释的一抗溶液中，在恒温摇床中30 4C 下孵育2小时。在脱色摇床上用TBST缓冲液洗膜两次，每次10分钟，然后再用 TBS缓冲液洗膜一次。(3)二抗孵育及洗涤量取适量TBST缓冲液将相应量二抗(辣根过氧化物

53、酶标记兔抗羊IgG)J羞行 1：5000稀释，将PVDF膜置入稀释的二抗溶液中，在恒温摇床中30C下孵育15 小时。在脱色摇床上用TBST缓冲液洗膜两次，每次10分钟，然后再用TBS缓 冲液洗膜一次。6224显色及成像取出化学发光试剂盒，吸适量A液和B液1：1等量混匀后待用。将PVDF膜 取出置于化学发光板上，加混合好的发光试剂在PVDF膜上。室温避光反应2-3 分钟，然后置化学发光成像系统内成像。用quantity one软件扫描各条带灰度值，计算各条带灰度值与对照道灰度值的比值为该样本的相对表达值。623 Western blot法检测脂肪组织中ATGL蛋白水平6231脂肪组织蛋白的提取

54、(1)将匀浆器置冰上预冷，加入400I_tl组织蛋白抽提试剂(上海申能博彩)，并加入49l PMSF，混匀。 (2)迅速称取约120mg脂肪组织标本，移入匀浆器内。重庆医科大学硕士研究生学位论文(3)匀浆器置于冰上，间或匀浆，避免起泡沫和发热，冰上匀浆约30分钟。 (4)将样品转移到15mlEP管，4。C，200009离心30分钟。 (5)将上清小一11,转移到干净无菌EP管中，一20C保存。6232脂肪组织蛋白含量的测定(考马斯亮蓝G250法)(1)制作标准曲线从20。C取出lmgml BSA，室温融化后备用。取18个15ml离，Ii,管，3个一组，分别标记为01xg，10Itg，2099，3099，5099，801xg。按下表在各管中加入各种试剂。标准管01tg101tg2099309950998099 Imgml BSA109l209l309l509l809l 09NaCl4001al3901d3809l3709l3501tl3209I G250液50001tl50009l50009l50009l5000l_