多倍体与转基因动物课件

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1、第第1414章章 多倍体与转基因动物多倍体与转基因动物14.1 多倍体动物多倍体动物动物多倍体比较少，原因：动物多倍体比较少，原因：（1）高等动物远源杂交能力很弱，很难形成杂种个高等动物远源杂交能力很弱，很难形成杂种个体；体；（2）多倍体动物高度不育，染色体异常通常会千万多倍体动物高度不育，染色体异常通常会千万胚胎死亡，很难得到多倍体后代。胚胎死亡，很难得到多倍体后代。 但但低等脊椎动物如鱼类、两栖类和爬行类低等脊椎动物如鱼类、两栖类和爬行类。多倍体动物多倍体动物产生原理产生原理：染色体的加倍可以：染色体的加倍可以通过保留受精卵第二极体即通过保留受精卵第二极体即抑制卵子抑制卵子的第二次成熟分裂

2、的第二次成熟分裂或或抑制受精卵的第抑制受精卵的第一次卵裂一次卵裂来实现。来实现。鱼类精子入卵的时期是鱼类精子入卵的时期是第二第二次减数分裂的中期次减数分裂的中期，刺激卵，刺激卵子继续完成第二次分裂。卵子继续完成第二次分裂。卵中原有的二组染色体中中原有的二组染色体中一组一组作为第二极体作为第二极体排出受精卵成排出受精卵成为正常的二倍体。如果在精为正常的二倍体。如果在精子入卵时第二极体不能正常子入卵时第二极体不能正常排出，则精卵原核结合成为排出，则精卵原核结合成为三倍体受精卵三倍体受精卵。如果卵子受精后，照常排出如果卵子受精后，照常排出第二极体形成第二极体形成单倍体卵单倍体卵，单，单倍的卵原核与倍

3、的卵原核与单倍的精原核单倍的精原核结合就形成二倍的受精卵，结合就形成二倍的受精卵，这时再这时再抑制受精卵的第一次抑制受精卵的第一次卵裂卵裂，则产生，则产生四倍体四倍体。1 1 多倍体动物培育方法多倍体动物培育方法A 物理方法物理方法 机制主要是通过机制主要是通过破坏微管形成破坏微管形成，使由微管蛋白聚，使由微管蛋白聚合成的微管解体或阻止微管的聚合过程，合成的微管解体或阻止微管的聚合过程，使染色体使染色体失去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动失去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动，形，形成多倍体细胞。成多倍体细胞。（1 1）温度休克法）温度休克法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热：即用略高

4、于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导休克来诱导三倍体三倍体( (抑制第二极体排放抑制第二极体排放) )或或四倍体四倍体( (抑制第一抑制第一次卵裂次卵裂) )的方法。根据处理温度的高低分为的方法。根据处理温度的高低分为热休克法和冷休热休克法和冷休克法克法。一般。一般冷水性鱼类如蛙科鱼类，宜用热休克，温度范围冷水性鱼类如蛙科鱼类，宜用热休克，温度范围为为28-3628-36; ;温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0-50-5左左右。右。优缺点：优缺点：简便、廉价，但诱导率较低。简便、廉价，但诱导率较低。（2）水静压法水静压法：采用较高的水静压（如采用较高的水静压（如

5、65kg/cm2）可抑制）可抑制卵母细胞第二极体的释放或卵母细胞第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体的方法。体的方法。原理：静水压处理破坏了有丝分裂器中的原理：静水压处理破坏了有丝分裂器中的纺锤丝即纺锤体和星体纺锤丝即纺锤体和星体，从而暂时阻断了有丝分裂的进程。从而暂时阻断了有丝分裂的进程。该方法处理程序标准化该方法处理程序标准化易于掌握易于掌握，处理时间短，处理时间短(3-5min)，诱导率诱导率较高，对受精卵损伤较小较高，对受精卵损伤较小。但需但需专门的设备专门的设备如水压机等。此外，静水压处理还使如水压机等。此外，静水压处理还使染色体染色体发发生了不

6、同程度的凝缩，生了不同程度的凝缩，,还可能使还可能使受精卵的结构受精卵的结构发生某些物理和发生某些物理和化学变化，造成发育受阻，因此在生产中应用较少。化学变化，造成发育受阻，因此在生产中应用较少。B B 化学法化学法细胞松弛素诱导法细胞松弛素诱导法：细胞松弛素：细胞松弛素B(B(CBCB) )导致极体的保留是导致极体的保留是通过通过阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离来实现的。来实现的。CBCB处理比其他方法能更有效地诱导处理比其他方法能更有效地诱导三倍体三倍体的形成。的形成。6-6-甲氨基嘌呤诱导法甲氨基嘌呤诱导法： 6DMAP6DMAP 是一种蛋白激素酶抑制是一

7、种蛋白激素酶抑制剂。当剂。当6DMAP 6DMAP 与微管蛋白二聚体结合以后与微管蛋白二聚体结合以后对微管正常对微管正常的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体三倍体。C C 生物法：主要是远缘杂交法生物法：主要是远缘杂交法瑞齐（瑞齐（RaschRasch）等于）等于19651965首先证明了三倍体脊椎动物可通首先证明了三倍体脊椎动物可通过四倍体个体与二倍体个体杂交产生。过四倍体个体与二倍体个体杂交产生。化学法缺点：化学法缺点：成功率较低，且对胚胎及操作者有毒性，影成功率较低，且对胚胎及操作者有毒性，影响存活。响存活。2 2 多倍体

8、动物的鉴定多倍体动物的鉴定人工诱导处理过的群体可能是由多倍体、二倍体甚至是多人工诱导处理过的群体可能是由多倍体、二倍体甚至是多倍体与二倍体构成的嵌合体等倍体与二倍体构成的嵌合体等混合群体混合群体，所以需要筛选出，所以需要筛选出需要的多倍体。需要的多倍体。（2 2）核仁染色观察法）核仁染色观察法：一般而言，细胞：一般而言，细胞核仁数量与染色体核仁数量与染色体组数目（倍性）成正比例组数目（倍性）成正比例，通过，通过银染法银染法检测胚胎细胞核仁检测胚胎细胞核仁数量及分布情况可以鉴定多倍体，直观、可靠。数量及分布情况可以鉴定多倍体，直观、可靠。（1 1）染色体计数法：）染色体计数法：将细胞固定制片、将

9、细胞固定制片、染色后观察染色染色后观察染色体个数体个数。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍是目前鉴定多倍体倍性的是目前鉴定多倍体倍性的一种直观、可靠的方法一种直观、可靠的方法，缺点，缺点是比较费时。是比较费时。（4 4）DNADNA含量测定：染色体组数与含量测定：染色体组数与DNADNA含量成正比。含量成正比。测定测定单个细胞的单个细胞的DNADNA含量，含量，根据细胞根据细胞DNADNA比较来推断出细胞的倍比较来推断出细胞的倍性。如果发现杂种的性。如果发现杂种的DNADNA含量是其亲本的一倍半，就可以含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三

10、倍体。确定这些杂种是三倍体。DNADNA含量测定法快速准确，能测含量测定法快速准确，能测出嵌合体，但是缺点是需要专门仪器。出嵌合体，但是缺点是需要专门仪器。（3 3）核体积测量法）核体积测量法：一般而言，：一般而言，细胞核大小与染色体数细胞核大小与染色体数目成比例，目成比例，为了维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大为了维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此，细胞大小也按比例增加。因此多倍体细胞及细胞核通常多倍体细胞及细胞核通常要比二倍体大一些要比二倍体大一些。一般通过。一般通过测定红细胞核体积测定红细胞核体积的大小可以的大小可以鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性

11、不高。鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性不高。14.2 14.2 转基因动物转基因动物1.1.转基因动物转基因动物（transgenic animaltransgenic animal）：是指在基）：是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。稳定地遗传给后代的基因工程动物。利用利用转基因动物生产人类药用蛋白、异体器官转基因动物生产人类药用蛋白、异体器官等非常等非常规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研究的热点之规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研究的热点之一。一。2.2.转基因动物培育方法转基因动物培育方法（

12、1） 原核期胚胎原核期胚胎显微注显微注射法射法：几百几百KB大片段、应用广泛大片段、应用广泛目的目的DNADNA制备（无需构建载体）制备（无需构建载体）DNADNA注入原核胚（受精卵雄核）注入原核胚（受精卵雄核）胚胎体外培养胚胎体外培养胚胎移植（移植前鉴定）胚胎移植（移植前鉴定）发育发育出生、鉴定出生、鉴定19801980年年，GordonGordon等人首先等人首先育成育成转人生长素基因小鼠转人生长素基因小鼠。世界第一个转基因动物世界第一个转基因动物。生长速度快生长速度快2 24 4倍、体形倍、体形大一倍的转基因大一倍的转基因“硕鼠硕鼠”。发表在发表在19821982年的年的naturena

13、ture杂杂志上。志上。原核期胚胎显微注射法原核期胚胎显微注射法原核期胚胎显微注射法改进为体外受精转基因法原核期胚胎显微注射法改进为体外受精转基因法（2）胚胎干胚胎干细胞方法细胞方法胚胎干细胞（胚胎干细胞（ES）是一种含）是一种含正正常二倍染色常二倍染色体的体的具有发育具有发育全能性的细胞全能性的细胞，因此只要，因此只要将将外源外源DNA导入导入胚胎干细胞胚胎干细胞就就可以实现基因可以实现基因的转移。的转移。（3 3）精子载体法：）精子载体法：精子与外源精子与外源DNADNA混合培养，混合培养，DNADNA可被吸收可被吸收进入精子头部，进入精子头部，然后再与卵细胞受精后发育成转基因动物。然后再

14、与卵细胞受精后发育成转基因动物。（4 4）逆转录病毒感染法：）逆转录病毒感染法：见见11.1011.10。（5 5）卵细胞显微注射法：）卵细胞显微注射法：将将外源外源DNADNA克隆到逆转录病毒载克隆到逆转录病毒载体上，再显微注射到体上，再显微注射到M IIM II中期卵细胞（无核膜），中期卵细胞（无核膜），再体外再体外受精，胚胎移植，发育成转基因动物。受精，胚胎移植，发育成转基因动物。Chapter 14细胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.反转录病毒感染法Chapter 14细胞工程Copyright 2011 Wang

15、Weidong, All rights reserved.东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因转基因”克隆猪克隆猪绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆Chapter 14细胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.Genetically modified animalhttp:/GloFish fluorescent fish, the first geneticallymodified animal to be sold as a pet目的基因目的基因的鉴定：的鉴定

16、：检查动物体内是否有外源基因的检查动物体内是否有外源基因的存在存在，以判明是否是转基因动物。可用，以判明是否是转基因动物。可用聚合酶链反聚合酶链反应应(PCR)、斑点杂交、斑点杂交(Dot blot), Southern印迹印迹分析等多种方法进行检测。分析等多种方法进行检测。目的蛋白目的蛋白的鉴定：有活性的目的蛋白的检测非常的鉴定：有活性的目的蛋白的检测非常重要。检测方法主要有：重要。检测方法主要有：(1) SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)(2) 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(ELISA)(3) Western印迹分析印迹分析3 3 转基因动物鉴定转基因动物鉴定（1）

17、快速生长与肉质改善）快速生长与肉质改善。如转生长素基因的猪生长快，瘦肉率也高。如转生长素基因的猪生长快，瘦肉率也高。（2）增加羊毛产量和性能。）增加羊毛产量和性能。细菌基因细菌基因SAT和和DAS可以促进合成可以促进合成Cys，将该基因，将该基因转入羊肠胃道上皮细胞，可提高羊毛产量。转入羊肠胃道上皮细胞，可提高羊毛产量。若将毛角蛋白若将毛角蛋白II中间细丝基因转入绵羊基因组中，中间细丝基因转入绵羊基因组中，所产羊毛光泽亮丽、毛脂含量高暖和。所产羊毛光泽亮丽、毛脂含量高暖和。（3 3）抗冻动物品种培育。）抗冻动物品种培育。 将鱼抗冻蛋白基因将鱼抗冻蛋白基因AFPAFP转入不耐寒鱼或其他动物。转入

18、不耐寒鱼或其他动物。4 4 转基因改良动物的应用转基因改良动物的应用5 5 转基因动物转基因动物乳腺生物乳腺生物反应器反应器（乳腺是最理想的药物蛋白生产场所乳腺是最理想的药物蛋白生产场所）（1）概念：）概念：将外源基因置于将外源基因置于乳腺特异性调节序列乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺之下，使之在乳腺中表达，中表达，然后通过然后通过回收乳汁回收乳汁获得重要获得重要价值的价值的生物活性蛋生物活性蛋白白的技术。的技术。1987 年年Gordon 等将等将组织型纤溶酶原激活剂组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成基因的启动子构成重组基因，成功地培育

19、出了重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠的转基因小鼠.20062006年年6 6月月2 2日，日，世界上第一世界上第一个个利用利用转基因动物乳转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物重组重组人抗凝血酶人抗凝血酶（商品名：（商品名：ATryn ATryn ）上市获得批）上市获得批准。准。目前，目前，1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶(AAT)、人乳球蛋白、凝、人乳球蛋白、凝血因血因子子III、IV、VIII、纤维蛋白原、降钙素、纤维蛋白原、降钙素、SOD、红细胞生成素、红细胞生成素、IGF-1等成功表达，多种药等成功表达，

20、多种药用蛋白已经进入临床试验阶段用蛋白已经进入临床试验阶段。上海交通大学医学遗传研究所：（1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝血因子IX蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。（2）1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”降生。Chapter 14细胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved. 1998年上海医学研究所与复旦大学遗传所合作获得在乳腺肿表达有生物活性的人凝血因子IX转基因山羊（2 2）关键环节）关键环节使用合适的使用合适的乳汁蛋白基因调控元件乳汁蛋白基因调控元件，构建合理有，构建合理有效的效的乳腺

21、组织特异性表达载体。乳腺组织特异性表达载体。目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基因及调控序列的主要有：因及调控序列的主要有：乳清酸蛋白乳清酸蛋白(WAP(WAP）基因及其调控序列。）基因及其调控序列。酪蛋白酪蛋白(Icasein)(Icasein)基因及其调控序列。基因及其调控序列。-乳球蛋白乳球蛋白(-lactoglobulin)(-lactoglobulin)基因及其调控序基因及其调控序列。列。乳白蛋白乳白蛋白(-lactalbumin )(-lactalbumin )基因及其调控序列。基因及其调控序列。（3 3）存在问题）存在问题（1）理论基础薄弱和技术不完善，致使转基因理论基础薄弱和技术不完善，致使转基因在受体动物基因组在受体动物基因组随机整合，遗传不稳定、表达随机整合，遗传不稳定、表达率不高率不高。（2）异位表达和表达产物的泄漏问题，需要异位表达和表达产物的泄漏问题，需要乳乳腺组织特异性高效表达载体腺组织特异性高效表达载体，保证外源基因在乳，保证外源基因在乳腺中专一表达。腺中专一表达。（3）在家畜转基因技术方面，目前多用在家畜转基因技术方面，目前多用原核胚原核胚胎显微注射胎显微注射，平均，平均成功率比较低成功率比较低，需要大量的供，需要大量的供体和受体动物。体和受体动物。