分子生物实验讲义Word

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1、 分子生物学实验 课程讲 义总学时：3216 周学时：2适用年级专业：生物技术2011级生物科学2010级开课时间：20122013学年第 2学期授课教师姓名：胡凯1 / 26目录实验一 基因组DNA的提取实验二 基因组DNA的纯化实验三 DNA的琼脂糖电泳检测实验四 DNA的琼脂糖回收实验五 PCR基因的扩增实验六 质粒DNA的提取实验七 核酸的荧光定量检验实验八 大肠杆菌的感受态细胞制备实验九 大肠杆菌的质粒转化实验一 基因组总DNA的提取一、实验目的与原理简介：抽提的DNA可用于PCR、Southern blotting、DNA文库构建等操作。细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或

2、染色体DNA， DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。DNA的提取常用的有以下两种方法：SDS（十二烷基硫酸钠）法：高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNase A 消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。该法操作简便，能满足大多数实验需要。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐浓度（0.7mol/L NaCl）中

3、是可溶的，通过离心就可将复合物同变性的蛋白质、多酚、多糖杂质（沉淀项）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质，直接向水相中加入预冷的异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，分离DNA沉淀并经75乙醇漂洗后溶于TE （或纯水）得到DNA的粗提物。用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。用RNase水解RNA，用酚：氯仿：异戊醇和氯仿：异戊醇抽提去蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。该法可以通过高盐缓冲液的选择型沉淀能很好的去除材料中的多酚及糖类杂质，得率高，质量好，用于PCR、Southern

4、杂交、分子标记、DNA文库构建等。二、实验准备：SDS提取液：100 m M Tris-HCl (PH 8.0)2.5%(V:V) 巯基乙醇500 m M NaCl20m M EDTA1.5% SDSCTAB抽提液：2%（w/v）CTAB100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)20 mmol/L EDTA(pH8.0)1.4 mol/L NaCl醋酸钠：3 mol/L NaAc用冰乙酸调pH值至4.8-5.2。TE溶液：100mmol/L Tris-HCl1.00 mmol/L EDTA调pH值至8.0 。为防止Dnase的降解作用，提取使用的各种器具及溶液均应经过高压灭菌。三、实

5、验步骤CTAB 法DNA的粗提1、加入250 mg土壤、730l 提取缓冲液、70 l裂解液和600mg 0.1mm 玻璃珠到2ml离心管中，70水浴10min。2、加入使用Tissrelyser (10min 20Hz,2次或者10min 25Hz,1次)。3、裂解管离心14000g1分钟,转移上清(约600ul)到新管，加入300ul 腐植酸吸附剂和200ul 10M乙酸铵，室温放置5min，离心14000g5分钟，将上清液转移到一个新的1.5ml离心管中。【如样品中腐殖酸含量高，溶液颜色较深，可加入腐殖酸吸附剂再处理一次】4、冷至室温后加入等体积(5ml)氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠

6、倒混匀使乳化10min；10000转分离心10min（18-20）；5、 吸取上清于另一干净的2ml离心管中；注：根据需要可用氯仿：异戊醇如上法重复抽提一次；吸取上清时一定不要打破沉淀层6、 吸取上清加入与上清液等体积（约4至5ml）且已于-20预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现；注：若没有沉淀出现，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3M NaAc,混匀，于20冰箱中沉淀30min；7、 10000转分离心10min（18-20）；弃上清，用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇；8、 用1ml 75%乙醇再漂洗一次；9、 用无水乙醇再漂洗一

7、次；10.沉淀于室温或60以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；用100l TE溶解沉淀，可用65水浴助溶，得DNA粗提物，可用于PCR等。实验二 基因组DNA的纯化一、实验目的与原理简介在分子生物学实验中，我们粗提取的需分离纯化去处蛋白质、多糖、腐殖酸等杂质，才能获得纯度高的DNA样品完成后续实验。同时通过紫外分光光度计测定OD260,OD280的吸收值，以确定DNA的浓度和纯度纯化方法通常有醇沉淀、硅胶膜吸附、磁珠法等。硅胶膜在高盐（如4M 盐酸胍）低PH（如PH5.0-6.5）会选择性的吸附DNA，RNA。硅胶膜在低盐浓度高PH（如PH8.0）会释放DNA，RNA。可以利用硅胶膜的这个特

8、性，达到纯化DNA，RNA的目的。在磁性小球表面覆盖能够与DNA结合的载体分子，比如氧化硅、羧基等，利用同样原理也可纯化DNA分子。DNA的浓度可以利用自外分光光度法进行测定，对于双链DNA，OD260=1.0时溶液浓度为50g/ml。DNA样品浓度（g/l）等于OD260N（样品稀释倍数）50/1000。纯的 DNA溶液其OD260/OD280应为1.8，如果大于1.9，表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质或酚污染。OD260/OD230应大于2.0，如小于2.0，表明溶液中有残存的盐及小分子杂质（如核苷酸、氨基酸、酚等）。二、实验准备：2ml离心管，1.5ml离心管，枪头，硅胶膜纯化柱

9、、纯化磁珠。DNA结合液：6M NaClO4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC (pH 5.2) 溴酚红少许膜洗涤液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脱液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超纯水（无DNA酶） pH8.0 三、实验步骤DNA的硅胶膜纯化1、向50ul TE溶解的DNA粗提物中入4l RNaseA；2、于65酶解RNA 30min以上；3、10000g常温离心10min，吸取上清到新1.5ml离心管；加入200ul DNA结合液轻柔混匀，并室温放置5min。【溶液颜色应为黄色(pH8)，加入10ul 3M

10、 醋酸钠（pH5.0)调节为黄色】4、转移溶液到一个硅胶膜纯化柱中，静止2min,8000g离心1分钟,将接收管中的液体重新吸取到膜中央;重复离心一次，弃掉接收管中溶液。5、加入300ulDNA结合液于纯化柱中，8000g离心1分钟。6、加入700ul洗涤液，14000g离心1分钟，重复洗涤3次。7、将接收管中的液体倒掉，14000g离心2分钟，去除纯化柱硅胶膜中的乙醇。8、纯化柱真空干燥2分钟，将其放到一个新的1.5ml离心管中。9、加入50l 预热的洗脱液，室温放置5min,14000g离心2分钟。10、弃掉纯化柱，1.5ml离心管中液体即为纯化后DNA.DNA的磁珠纯化1、向50ul T

11、E溶解的DNA粗提物中入4l RNaseA；2、于65酶解RNA 30min以上；3、10000g常温离心10min，吸取上清到新1.5ml离心管；加入200ul DNA结合液轻柔混匀，并室温放置5min。【溶液颜色应为黄色(pH8)，加入10ul 3M 醋酸钠（pH5.0)调节为黄色】4、加入10ul 磁珠溶液轻柔混匀，室温放置5ml。5、利用磁铁分离架分离磁珠，吸取上清弃之。6、加入700ul洗涤液，振荡混匀，磁铁分离架分离磁珠5min,吸取上清弃之。7、重复步骤6一次。8、磁珠真空干燥2分钟，加入50ul预热的洗脱液，室温放置5min,14000g离心2分钟。9、小心吸取上清，即为纯化后

12、DNA。两种DNA纯化方法效果比较： 将DNA粗提液、膜法纯化液、磁珠法纯化液分别测量紫外吸收值，比较其含量、纯度，并作图分析。实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验目的及实验原理通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，

13、可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称CCCDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open circular DNA ,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA,简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DN

14、A泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。二、实验准备：（一）仪器1、 琼脂糖凝胶电泳系统2、 凝胶成像系统或紫外投射仪（二）试剂1、 5TBE（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml 5TBE：Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）2、 凝胶加样缓冲液（6）溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%3、 琼脂糖4、 溴化乙锭溶液（EB） 0.5g/ml三、实验步骤（一） 制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb0.3 5600.6 1200.70.8100.9

15、0.571.20.461.50.242.00.13称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，按100ml的凝胶加5l的EB。（二） 胶板的制备1、 取有机玻璃内槽，洗净，晾干。2、 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3、 将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。4、 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中。（三） 加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品（上次实验的质粒DNA和基因组D

16、NA）加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。（四） 电泳1、 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。2、 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。（五）、质粒DNA的电泳分析在细胞中，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）常常以超螺旋形式存在，如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，则形成松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA,ocDNA）.在电泳中，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比开环和线状DNA的泳动速度快，因而

17、在电泳凝胶中呈现三条带（如图）开环DNA 线状DNA超螺旋DNA 实验四 DNA的琼脂糖凝胶回收一、实验目的及原理了解DNA片段回收的原理；学会DNA的琼脂糖凝胶回收操作技术。本实验所用的回收试剂的原理是在溶胶/结合液存在的条件下，使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片段吸附于磁珠的羧基上，通过70%乙醇洗涤后重新溶解于洗脱液中。二、实验准备高速台式离心机 、微量取液器；1.5，0.5和0.2ul的EP管、水浴锅，电子秤、切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶 DNA结合液：6M NaClO4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC (pH 5.2) 溴酚红少许膜洗涤液：50 mM Tris-cl，

18、0.1 mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脱液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超纯水（无DNA酶） pH8.0 三、实验步骤1. 按照标准的方法进行DNA电泳，请使用质量好的高熔点琼脂糖，或低熔点琼脂糖，使用TAE或TBE为电泳缓冲液。2. 取与样本数相同的若干1.5ml离心管，分别称量后记录下重量。3. 使用插入染料如溴化乙锭对DNA进行染色。在较长波长紫外灯下，用干净的手术刀片或刮胡刀片切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶块，尽量减小胶块的体积。为防止DNA 损伤，要尽量缩短DNA暴露在紫外灯下的时间。将胶切片转入已称重的离心管中，再称重后减去空管的重量，得到胶切

19、片的重量。注意：胶切片可在4或-20于无RNA 酶的离心管中储存一周，请务必盖紧管盖。4. 按照每10mg胶切片加10ul结合液的比率加足量膜结合液。5. 振荡混合以上混合物，在50-65下孵育10分钟，或直到胶块完全融解。每隔几分钟振荡离心管以加速胶块的融解。室温短暂离心，使溶液集中于管底。【溶液颜色应为黄色(pH8)，加入10ul 3M 醋酸钠（pH5.0)调节为黄色】5、加入10ul 磁珠溶液轻柔混匀，室温放置5ml。6、利用磁铁分离架分离磁珠，吸取上清弃之。7、加入700ul洗涤液，振荡混匀，磁铁分离架分离磁珠5min,吸取上清弃之。8、重复步骤6一次。9、磁珠真空干燥2分钟，加入50

20、ul预热的洗脱液，室温放置5min,14000g离心2分钟。10、小心吸取上清，即为回收的DNA。保存备下次实验用。11、检测回收DNA的吸光度，计算其含量和纯度。实验五 聚合酶链式反应（PCR）技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（PCR），即通过引物延伸核酸的某一区域而进行的重复双向DNA合成。PCR的原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次重复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。由于PCR在分子克隆和DNA分析中具有许多广泛的用途，特别是近年来迅速出现了许多以PCR为基础的新技术，因此，学习并尽快掌握这一门常规技

21、术是十分必要的。影响PCR反应的因素主要在于两个方面：1）引物的合理设计；2）PCR反应体系及反应条件的优化。学习PCR法体外扩增DNA的原理及操作方法；了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；掌握引物设计的原则和方法。二、仪器及药品PCR扩增仪，PCR用薄壁管，移液枪及电泳仪等；Taq DNA聚合酶，10PCR buffer,25mmol/lMgcl2,0.225mmol/ldNTP, 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul）三、实验步骤1）在50 ul反应体系中分别加入：MiniQ H2O37.5ul10PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM d

22、NTP mix 1ul引物1(10M) 1ul引物2(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板（cDNA） 1ul终体积为50 ul 注意：如果只是普通的检测，而无须回收时，则25ul的反应体系即可（上述体系中的各成分相应减半）2）短暂离心混匀后，放入PCR仪中，反应程序如下：I） 943-5minII） 94 1min581min 721min30sec 30-35个循环 III） 72 7-10minIV） 4 保存1） 反应完成后，将PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果实验六、质粒DNA的提取（碱裂解法）一、实验目的与原理简介质粒DNA

23、的抽提是基因工程操作中最常用和最基本的技术。质粒作为载体一般要满足四点基本的要求：1）拷贝数多；2）本身较小；3）要有较多的单一酶切位点；4）有易选择的标记如抗生素抗性基因。将细菌悬浮液暴露于高PH植的强阴离子洗涤剂中，会使细胞破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中，经管碱性溶剂使碱碱基配对完全破坏，但是闭环的质粒DNA双链不会彼此分离，这是因为在拓扑学上是相互缠绕的。只有OH出理的强度和时间不要太过，ph植恢复时，质粒DNA双链又形成。在裂解过程中，细菌蛋白质，破裂的细胞壁和染色体DNA会相互缠绕成大型的复合物，后者被SDS包裹，当用钾离子取代钠离子的时候，这些复合物会从溶

24、液中有效地沉淀下来。离心除掉变性剂，就可以回收上清中的质粒DNA了。 分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。学习掌握质粒的提取纯化、限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳等方法和技术二、试剂配置STE：0.1M NaCl, 10mM Tris-Hcl(pH8.0), 1mM EDTA溶液I：50 mM 葡萄糖,25mM Tris-Hcl(pH8.0),10mM EDTA溶液II：0.2M NaOH,1%SDS,(注意：一定要现用现配) 溶液III（100 mM）：0.5M Kac 6.0ml,冰醋酸 11.5ml,水28.5ml氯仿：异戊醇

25、（24：1）：24份氯仿与1份异戊醇混合均匀即可三、实验操作1、碱法小量制备质粒DNAa.挑单菌落（阳性克隆）接种于LB（含相应抗生素）液体培养基中，培养(37,200rpm)8h，再将此活化的菌液取400ul于20ml含相应抗生素的液体培养基中（1/50），250rpm, 37培养2h，即可获得经扩大培养的菌液；b.取1.5ml菌液，4 12000rpm，离心1min，去上清；再重悬于0.5ml STE ，4 12000rpm离心30sec，去上清；注意：去上清可采用剪去枪尖的枪头来吸干净c.沉淀加入100 ml 冰上预冷的“溶液 I”，剧烈震荡重悬的菌体；d.加入200 ml 新配制的“溶

26、液 II”，盖紧管口，快速颠倒5次混匀，不要震荡，确保内表面均与溶液 II接触，冰上3-5min；注意：该步时间切勿超过5 mine.加入150 ml 冰上预冷的“溶液 III”， 盖紧管口，倒置试管，温和震荡(缓慢倒转几次即可)5sec，冰上5min；注意：动作要缓和，以防机械切力对DNA的断裂作用f.4高速离心5min(13000rpm) ，将上清转移至新的1.5 ml eppendorf离心管中；g.加等体积的苯酚:氯仿（1:1），并振荡混匀, 4, 12000 rpm离心2min，将上清转移至新的离心管中；注意：取上清时，宁可损失一部分DAN，也不要将沉淀吸入，否则会出现蛋白污染。为了

27、充分的去除残余的蛋白质，可将此步重复一次。i.加入等体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），震荡混匀，室温放置2-5 min；j.4 高速离心5min去上清，倒置eppendorf管，除尽液体。加300 ml 70%的乙醇洗涤沉淀(以去掉沉淀的盐)；k.高速离心30sec，小心去掉上清；l.空气中干燥DNA10min，加30-50 ml的TE溶液（加入的RNase终浓度为20 mg/ml）溶解沉淀，65培养30min去除RNA；-20保存四、注意事项1提取用的菌量要适量。菌体过多，导致所得的DNA内杂质较多。2提取过程中尽量在低温条件下进行（0或冰上操作）。3苯酚/氯仿的混合液去蛋白的效果比单独

28、使用酚或氯仿更好。4提取用的苯酚和氯仿要去干净，否则会影响后面的酶切。实验七 核酸的荧光定量检验（演示实验）一、实验目的与原理荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：

29、荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值（如下图所示）。荧光域值（threshold） 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增

30、阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系： 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。嵌合荧光染料法（SYBR Green） SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特

31、异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。二、实验准备PCR模板、Q-PCR试剂盒、引物、荧光定量PCR仪。三、实验操作梯度稀释的标准品及待测样品的实时定量PCR1、模板的标准梯

32、度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3l按10倍稀释（加水27l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。2、反应体系如下：SYBR Green 1 染料 10l上游引物F 0.5l下游引物R 0.5ldNTP 0.5lTaq酶 1l模板DNA 5lddH2O 32.5l总体积 50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。3、制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后93 1分钟，55 2分钟，共40个循环。各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。4、PCR产物在2琼脂糖凝胶电泳，检测P

33、CR产物是否为单一特异性扩增条带。实验八、感受态细胞的制备一、实验目的及原理学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响

34、。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70保存（有效期6个月）。 感受态细胞制备及转化中的影响因素1.细胞的生长状态和密度最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5

35、107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为05时，细胞密度在5107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。2、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4。3.防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都

36、要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。4.、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。二、材料与试剂大肠杆菌DH5a，LB培养基三、实验方法1.大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）1）将大肠杆菌DH5a接种于3 ml LB液体培养基，37振荡（220rpm左右）过夜（12h左右）培养（至对数生长期）；2）将2 ml 过夜培养的菌液移入100ml LB培养基（一般为1：50的比例）中，37振荡培养至OD600nm为0.5-0.6；放于冰上30min。3）取1ml菌液于1.5ml无菌eppendorf管中，4，4000

37、rpm离心10min，去上清后，沉淀用1ml预冷的0.1M CaCl2（抽滤灭菌）悬浮，用枪头轻轻吹打混匀，于冰上放置30min；4，4000rpm离心10min ，去上清， 沉淀再加200ml 的0.1M CaCl2重悬，冰上放置2-7h后，用于转化；或每管加20-30%的灭菌甘油，混匀，70保存。 注意：新制成的感受态细胞在0放置12-24h这段时期内的转化效率较高实验九 质粒转化及鉴定一、实验目的掌握将外源DNA（如连接产物或重组质粒等）导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。二 试验原理 质粒DNA 转化大肠杆菌的原理是，细菌处于0。C，氯化钙低渗溶液中，菌体膨胀成球形，转化混合物中的D

38、NA和氯化钙形成羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42。C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中的基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。三、材料与试剂大肠杆菌DH5a、PET-30质粒、LB培养基、卡那霉素储存液等.四、实验方法转化大肠杆菌感受态细胞1、取制备的感受态细胞，或从70冰箱中取出一管感受态细胞，融化；每200 ml 菌液加5l DNA加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种；2、42水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min；注意：在水浴中切勿乱晃动3、上述各管中

39、分别加入800 ml 37预热的LB液体培养基至总体积为1ml，混匀后37 180 rpm培养1-2h左右至菌复苏（并使转化体产生抗性）；4、4000 rpm离心10min，去800 ml 上清液，将剩余的200 ml 菌液混匀；用烧烤过的涂布棒将100ml的菌液涂布于加相应抗生素（Amp+50ppm）的LB固体培养基，涂匀，晾于超净台上1h左右至菌液完全被培养基吸收。注意：涂平板时，一定要等烧烤过的玻棒冷却后再涂布，否则会烫死细菌；另外，以上步骤应无菌操作，防止污染。37倒置培养12-14h。5、统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数,公式如下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 友情提示：方案范本是经验性极强的领域，本范文无法思考和涵盖全面，供参考!最好找专业人士起草或审核后使用。