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1、 抗体制备技术抗体制备技术1、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。混合物。2、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由）：由一个识别一种抗原表位的一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价
2、高、少或无交抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。叉反应性。Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+ PEG, 融合融合Ab2单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备方法一、单克隆抗体与杂交瘤技术二、单克隆抗体的制备过程三、单克隆抗体的特性单克隆抗体与杂交瘤技术单克隆抗体与杂交瘤技术1、单
3、克隆抗体2、杂交瘤技术表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 由一个识别单一抗原决由一个识别单一抗原决定簇（表位）的定簇（表位）的B细胞克隆所细胞克隆所产生的同源抗体。产生的同源抗体。杂交瘤技术杂交瘤技术 通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1、致敏淋巴细胞的准备2、骨髓瘤细胞的准备3、细胞融合4、选择性培养5、抗体分泌细胞的筛选6、克隆化过程7、单克隆抗体的制取抗原致敏淋巴细胞骨髓瘤 细胞融合选择性 培养抗体
4、分泌细胞筛选克隆化单抗制取单抗纯化单抗鉴定 克隆选择学说的模式图克隆选择学说的模式图致敏淋巴细胞的准备致敏淋巴细胞的准备动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定收集时间：末次接种后72h骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的准备细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态细胞融合细胞融合方式：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞离心 1000rpm 10min50%PEG 1ml培养液 10ml离心 1000rpm 7min37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min加入HAT
5、培养液悬浮细胞，置于培养孔内选择性培养选择性培养随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理随机融合后的细胞类型随机融合后的细胞类型细胞组合 HGPRT 生长状态淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期生长骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生长未融合淋巴细胞 + 短期生长未融合骨髓瘤 不能生长HAT选择培养原理选择培养原理核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）抗体分泌细胞的筛选抗体分泌细胞的筛选对筛选方法的要求： 多大量样品一次检测 快迅速取得检测
6、结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法灵敏度高常用筛选方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等克隆化过程克隆化过程概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞有限稀释法有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔单克隆抗体的制取单克隆抗体的制取制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对同一决定簇单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性1、理化性状高度均一2、抗原结合性高度特异3、生物活性高度单一多抗与单抗制剂的比较多抗与单抗
7、制剂的比较 多抗 单抗 单抗 （血清） （腹水） （培养上清）特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025无关Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性 + +特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇稳定性 较好 略差 略差重复性 差 好 好抗体的纯化与鉴定抗体的纯化与鉴定一、抗体纯化的目的与方法二、纯化抗体的鉴定与保存抗体纯化的目的抗体纯化的目的1、去除杂蛋白2、去除杂抗体3、去除非同类抗体抗体纯化的方法抗体纯化的方法1、盐析、层析技术2、抗原吸附 凝胶过滤层析凝胶过滤层析( 分子筛分子筛)的作用机理的作用机理 亲和层析的作用机理亲和层析的作用机理 亲和层析纯化亲和层析纯化IgG基本过程示意图基本过程示意图 纯化抗体的鉴定和评价纯化抗体的鉴定和评价1、多克隆抗体的鉴定2、单克隆抗体的鉴定表面等离子体共振（表面等离子体共振（SPR）石英晶体微天平（石英晶体微天平（QCM）纯化抗体的保存纯化抗体的保存1、4。C保存2、-20。C保存3、冷冻干燥保存
生物化学：4-第五章 蛋白质之抗体制备与纯化-2015-04-14
