BioRad定量PCR说明书学习教案

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1、会计学1BioRad定量定量(dngling)PCR说明书说明书第一页，共77页。第1页/共76页第二页，共77页。第2页/共76页第三页，共77页。技术(jsh)背景本来，本来，PCRPCR技术是为了将样本中微量的技术是为了将样本中微量的DNADNA模版放大以便模版放大以便研究模版特性研究模版特性随着研究的深入，需要了解样本中基因的表达模式与疾随着研究的深入，需要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系病的关系(gun x)(gun x)，这就要了解标本中的，这就要了解标本中的DNADNA原始拷贝原始拷贝数。数。第3页/共76页第四页，共77页。DenaturationPrimer Anneal

2、ingElongation53535353535355TaqTaqRepeatIn theory, product accumulation is proportional to 2n, where n is the number of amplification cycle repeats第4页/共76页第五页，共77页。nA linear increase follows exponentialnEventually plateausCycle #TheoreticalReal LifeLog Target DNAReality vs. TheoryAmplification is exp

3、onential, but the exponential increase is limited:第5页/共76页第六页，共77页。常规常规PCR方法方法(fngf)的局限性的局限性分析：分析：无法无法(wf)(wf)对起始模板准确定量对起始模板准确定量, ,只能对终产物只能对终产物进行分析进行分析对终产物分析，受对终产物分析，受PCRPCR过程平台效应的干扰，定过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差量准确度难以提高（相对误差1000%1000%）；存在扩）；存在扩增产物的污染问题。增产物的污染问题。必须在扩增后用电泳方法分析必须在扩增后用电泳方法分析, ,费时费力而且费时费力而且

4、EBEB有毒有毒无法无法(wf)(wf)对扩增反应实时检测对扩增反应实时检测第6页/共76页第七页，共77页。CycleEnd Point第7页/共76页第八页，共77页。 实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后(zuhu)通过Ct值和标准曲线对样品中的未知样品 的起始浓度进行定量的方法。 Real-Time PCR第8页/共76页第九页，共77页。 Quantitative PCR 或 Real time PCR 是确定样品(yngpn)中DNA (或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法第9页/共76

5、页第十页，共77页。CycleEnd PointC(t)第10页/共76页第十一页，共77页。Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification.第11页/共76页第十二页，共77页。第12页/共76页第十三页，共77页。第13页/共76页第十四页，共77页。PCR仪仪 + 监测、分析系统监测、分析系统 + 荧光荧光(ynggung)标记标记 第14页/共76页第十五页，共77页。第15页/共76页第十六页，共77页。温度梯度选择可以温度梯度选择可以允许使用者在同一允许使用者在同一次扩

6、增中优化复性次扩增中优化复性(f xn)温度。温度。采用多点温控和传感采用多点温控和传感技术，可以技术，可以(ky)实实现梯度现梯度PCR功能功能第16页/共76页第十七页，共77页。采用采用(ciyng)0.2ml的离心管的离心管, 排管排管和和 96孔孔PCR反应板。反应板。 降低消耗品降低消耗品成本。成本。同时扩增和检测同时扩增和检测(jin c)96个样品个样品第17页/共76页第十八页，共77页。PCR仪仪 + 监测监测(jin c)、分析系统、分析系统 + 荧荧光标记光标记 第18页/共76页第十九页，共77页。第19页/共76页第二十页，共77页。DetectorEmission

7、FilterLight SourceExcitationFilter第20页/共76页第二十一页，共77页。53FQTubulin53HQGapdH53TXQb b-actin53Cy5QCyclophilinMultiplexing-同时同时(tngsh)检测检测5色色荧光荧光第21页/共76页第二十二页，共77页。CycleLog Relative FluorescenceTexas RedFAMHexCy51010010001471013161922252831343740434649TubulinCyclophilinbeta ActinGAPDHMultiplexing第22页/共7

8、6页第二十三页，共77页。v可兼容的定量方法可兼容的定量方法(fngf)：v SYBR Green I、Taqman探针、探针、Beacon探针、探针、FRET探针探针v可兼容的突变检测方法：可兼容的突变检测方法：v 熔点熔点(rngdin)曲线功能、曲线功能、MGB探针探针v可兼容的试剂种类：可兼容的试剂种类： 所有国产与进口试剂所有国产与进口试剂第23页/共76页第二十四页，共77页。iQ5 Data Analysis Software iQ5 Data Analysis Software 第24页/共76页第二十五页，共77页。第25页/共76页第二十六页，共77页。第26页/共76页第

9、二十七页，共77页。标准曲线标准曲线定量定量(dngling)计算计算第27页/共76页第二十八页，共77页。第28页/共76页第二十九页，共77页。基因(jyn)表达分析第29页/共76页第三十页，共77页。PCR仪仪 + 监测、分析监测、分析(fnx)系统系统 + 荧荧光标记光标记 第30页/共76页第三十一页，共77页。l ll ll ll l第31页/共76页第三十二页，共77页。第32页/共76页第三十三页，共77页。35BDBD5BDBDBD第33页/共76页第三十四页，共77页。Extension53535353Extension ContinuedApply Excitatio

10、nWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll第34页/共76页第三十五页，共77页。 Advantages!Inexpensive compared to hybridization probesNo additional design work than the primer used for PCR reaction However Not template specific, will bind ALL double stranded DNA inducing primer-dimer and unsp

11、ecific amplicon formationMultiplex assays not possible第35页/共76页第三十六页，共77页。Typical “first step” experiment: Evaluate Primer SpecificityUsing Melt Curve Analysis Evaluate Primer Pair EfficienciesBy running serial dilutions of template as standards Identify Sub-Optimal aspects of assayOptimize further

12、with thermal gradient, etc.第36页/共76页第三十七页，共77页。53QFTaq5q3l l3535FQ第37页/共76页第三十八页，共77页。第38页/共76页第三十九页，共77页。Cleavage-based assay:TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ第39页/共76页第四十页，共

13、77页。535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lRCleavage-based assay:TaqManTM第40页/共76页第四十一页，共77页。第41页/共76页第四十二页，共77页。RQMolecularBeacon535353RQ第42页/共76页第四十三页，共77页。第43页/共76页第四十四页，共77页。第44页/共76页第四十五页，共77页。第45页/共76页第四十

14、六页，共77页。Hybridization oligos should have Tms 6 12 degrees higher than the associated primers.Avoid secondary structure in the complementary region of the probe.Avoid Gs at the 5 end of the probe sequence.Use oligo analysis tools to check probe for:DimerizationSecondary StructureCross Reactivity with

15、 Primers第46页/共76页第四十七页，共77页。 Each method has advantages and disadvantages Bio-Rad Real-Time Instrumentation is equipped to handle all chemistries One method may be more appropriate for an application over anotherWhich Method to Use?第47页/共76页第四十八页，共77页。第48页/共76页第四十九页，共77页。第49页/共76页第五十页，共77页。第50页/共76页

16、第五十一页，共77页。第51页/共76页第五十二页，共77页。从图中的重复实验中可以直观地看到，随着从图中的重复实验中可以直观地看到，随着PCRPCR反应过反应过程，荧光信号从基线经一个转折点进入指数期、线性期程，荧光信号从基线经一个转折点进入指数期、线性期和最终的平台期，尽管平台期和最终的平台期，尽管平台期DNADNA拷贝数波动拷贝数波动(bdng)(bdng)很大，很大，CTCT值却是相对固定的。值却是相对固定的。Cycle第52页/共76页第五十三页，共77页。第53页/共76页第五十四页，共77页。 模板起始浓度(nngd)越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct

17、值与模板起始浓度值与模板起始浓度(nngd)的关系的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环(xnhun)到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环(xnhun)到达第54页/共76页第五十五页，共77页。ProductT=(Template0)2nWhere n=Number of CyclesIdeal PCR第55页/共76页第五十六页，共77页。C o p y N u m b e r v s. Ct - Sta n d a r d C u r v ey = -3 .31 9 2x + 3 9 .77 2R2 = 0 .9 9 6 7051 01 52 02 53 03 5

18、4 001234567891 01 1Lo g o f co p y nu m b er (1 0n)CtThreshold Cycle, Ct, is a reliable indicator of initial copy number利用已知起始拷贝数的标准(biozhn)品可作出标准(biozhn)曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准(biozhn)曲线上计算出该样品的起始拷贝数。第56页/共76页第五十七页，共77页。第57页/共76页第五十八页，共77页。Absolute and Relative quantificat

19、ionQuantification第58页/共76页第五十九页，共77页。第59页/共76页第六十页，共77页。Beta-Actin Ornithine decarboxylase (ODC)S-adenysyl methionine decarboxylase (SAMDC)Human Prostate and Thymus第60页/共76页第六十一页，共77页。Beta-ActinODCSAMDCProstate Ct : 23.25 Thymus Ct : 26.93Prostate Ct : 23.10 Thymus Ct : 25.53Prostate Ct : 21.25Thymu

20、s Ct : 21.90第61页/共76页第六十二页，共77页。第62页/共76页第六十三页，共77页。 Only possible with DNA Binding dyes (SYBR Green I) and after completed real time PCR Determines the temperature at which 50% of the DNA molecules separate into two strands - or “melts” apartDiscriminates by Melting Temperature (Tm), Tm is dependen

21、t on:- sequence (G/C content)- lengthWhat is Melt Curve Analysis?第63页/共76页第六十四页，共77页。change in fluorescencesingle amplified productTm第64页/共76页第六十五页，共77页。Melt curve showing two amplified productsTwo amplified productsTmTmMelt CurveCheck specificity of the reaction第65页/共76页第六十六页，共77页。Collecting at 82

22、C would record specific product only Primer Dimers Impact on the Assay第66页/共76页第六十七页，共77页。第67页/共76页第六十八页，共77页。第68页/共76页第六十九页，共77页。第69页/共76页第七十页，共77页。Good TechniquePoor TechniqueCycleCycle第70页/共76页第七十一页，共77页。第71页/共76页第七十二页，共77页。第72页/共76页第七十三页，共77页。Targets an amplicon length of 75 to 200 bp50 to 60% o

23、verall GC contentLimit secondary structureLimit stretch of G or Cs longer than 3 basesNo stable interactions between primers (primer/dimer)Place Cs and Gs on ends of primers, but no more than 2 in the last 5 bases on 3 end第73页/共76页第七十四页，共77页。1.Evaluate target sequence for secondary structure.2.Ident

24、ify regions of 100 bp as potential amplicons.3.Scan sequence by eye or use a program to select potential primer pairs.*4.Use oligo analysis tools to check primers for:DimerizationSecondary StructureCross Reactivity *Repeat if necessary第74页/共76页第七十五页，共77页。谢 谢 ！第75页/共76页第七十六页，共77页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第76页/共76页第七十七页，共77页。