引物二聚体的形成

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1、-什么是引物二聚体？怎样消除引物二聚体是引物的3端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。减少PCR产物中引物二聚体的方法:1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的方法;2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度;4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再参加反响体系

2、当中，引物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹构造,自身环化等构造,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样到达目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。5.所配MI*中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性;6.PCR反响体系的配制在冰上进展，最后加TAq酶，PCR完毕后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。7.增加循环数;8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，假设提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定，片段长

3、则相应镁离子浓度应该高一些);9.假设降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释1001000倍，如果间隔较长可以稀释50100倍。反响成分问题：可能的原因解决方法 引物3端互补 重新设计引物 引物长度过短 增大引物长度 引物浓度太高 降低引物浓度 模板浓度太低 提高模板浓度反响条件问题：可能的原因解决方法 退火温度不够优化 优化退火温度 循环数太多 减

4、少循环数如何区分引物二聚体与PCR产物100kb1PCR产物的电泳检测可能出现那些问题：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反响的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进展分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丧失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定

5、不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平

6、衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止屡次冻融或长期放冰箱冷藏局部，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反响体积的改变：通常进展PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进展PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出

7、现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列*段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不适宜：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进展PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序

8、列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的穿插污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反响管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异

9、性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对

10、策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。2。怎么鉴别引物二聚体和产物：1实时定量PCRPCR可对特定核苷酸片断进展指数级的扩增。在扩增反响完毕之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进展定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道*一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PCR技术的难点主要在于：如何确定PCR正处于线性扩增*围内

11、只有在此*围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例，为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。所谓的实时荧光定量PCR，其反响体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反响的进展，PCR反响产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线如图1。一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量

12、的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进展定量分析。为了定量和比拟的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值threshol

13、d value如图2所示。定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开场增加。对*一样品的Ct值就定义为荧光量与荧光阈值线穿插时的循环数。CT值与起始模板的关系研究说明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数如图3所示。因些只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。SYBR Green 荧光染料目前荧光实时定量 PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：

14、内嵌染料SYBR Green 、双标记探针、FRET探针、分子信标和Ampliflor。其中SYBR Green 染料法不需要设计合成序列特异性探针和新的引物对，是一种简便，性价比拟高的实时监测方法，常常被用于进展RNA表达相对定量以及DNA定量研究中。SYBR Green 是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反响体系中，参加过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺入链中的SYBR染

15、料分子仅有微弱荧光信号背景，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料结合，因此SYBR Green的检测灵敏度很高。但是，由于SYBR Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级构造以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的准确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特

16、异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。在PCR完毕后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过和中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR Green的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点熔点，Tm即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反响的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，说明

17、实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。荧光定量PCR技术的应用实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进展定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到*个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进展比拟。除此之外我们不定期可以对PCR产物或样品进展定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体。以区分非特异扩增；利用特异性探针进展基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于根底科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几

18、个方面：1、比拟经过不处理样本之间特定基因的表达差异如药物处理、物理处理、化学处理等，及特定基因在不同相的表达差异。2、比拟正常组织与病理组织中各种mRNA 表达量差异。3、验证基因芯片实验结果。4、验证RNA干扰实验结果。2D*Y上的建议：1可以用非变性PAGE胶电泳，应该能分开的，理论上说分辨率到达1个碱基。可以用非变性丙烯酰胺凝胶电泳进展别离鉴定NA在丙烯酰胺凝胶中的有效别离*围:丙烯酰胺(W/V):12% 有效别离*围(bp):40-20015% 25-150电压一般是1-8V/cm, 6个小时后银染即可分辨你的两个片段2可以用1.3%TAE的长胶，在30伏的电压下中号电泳槽，跑16-

19、20小时是应该可以分开的。3用2.5%的琼脂糖就能分开，我们实验室经常用它来分开相差28bp的片段，效果很好，看的很清楚，但有几点要注意，缓冲液要是新配的，电压100v跑10分钟，接着50v跑一个半小时，到两个小时。4理论上用1.5或者2.5琼脂糖应该都可以分开，在电泳的时候电压不适宜太大，用40-50v跑上2小时左右应该就可以了。电压加大到80v或者100v的时候虽然节省实验时间，但是有时条带的效果看起来就不是很好。还有就是似乎你的Marker选择的不好，即使电泳能够分开两条带，这个Marker也很难来说明你的目的条带和内参带的大小。5用聚丙烯酰胺跑垂直电泳。1。需要单独的垂直电泳槽，及配置

20、聚丙烯酰胺凝胶。2，具体的做法可以到生物谷，有详细的说明。3，你可以用5%的琼脂糖跑一下。6建议你跑PCR的时候做个阴性对照，只加引物，电泳时看阴性对照引物二聚体的位置，以区分拟订目的片段71bp条带，或是电泳时直接加一空引物做对照1材料与方法11标本人单核细胞系U937，细胞密度2108/L，分对照组(N)、处理组(T1)、处理组(T 2)，N用1640培养基及10胎牛血清培养，T1用IFN-104U/L LPS 1g/L、T2用IFN- 10 U/L LPS l0g/L分别刺激7 h。12主要试剂与仪器TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomy*)、Su

21、persript 逆转录酶(GIBCO BRL)、AmpliTaq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free DNaseI(Promega);Genomy* LR 、 Genomy* SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer)13总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA，以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA，经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度14mRNA差异显示1.41逆转录反响选择锚定引物T7(dT12)AP(anchored prime rs，AP

22、)，序列为5ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3，其中 MAGC NA /G/C/T，以总RNA为模板进展逆转录反响，每管反响体系如下：总RNA l0g,AP 4 pmol ,70 5 min,参加50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25mol/L，dNTPmi*(1111)，SuperScript 60 Units，总反响体系20 l 。42 5 min，50 50 min，70 15 min。142荧光标记差异显示PCR选取与逆转录引物序列一样的带荧光物质标记的

23、锚定引物TMR-T7(dT12)AP，随机引物(5ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3)，以逆转录产物为模板，进展PCR反响。反响体系包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH84) ，50 mmol/L KCl，375 mmol/L MgCl2，逆转录产物30 l，50 mol/L dNTP mi *(111)，035 mol/L 5-随机引物,035 mol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 U nits，总反响体系10 l。95 2 min。9415 s，50 30 s，72 2 min，4个循环； 94 15 s，60 30 s，72 2 min，

24、25个循环；72延伸7 min。143别离差异显示片段配制56变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚02 5 mm，大小6133 cm。将PCR产物加40 l上样缓冲液，95变性后上样。3000V、100 W 、55电泳45 h。干胶后置于Genomy* SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分析处理扫描结果。144回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30 l去离子水中，37水浴3060 min，备用。145差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子 22-mer(5GTAATACGACTCACTATAGGGC3)、反M

25、13(-48)24-mer(5AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3)为引物,进展再扩增反响：模板2.0 l,20 mmol/L Tris-HCl(pH84)，50 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2,20 molL dNTP mi*(1111)，02 molL T7、0 2 mol/L M13-r，AmpliTaq 10 U nits，总反响体系20 l。反响条件同差异显示PC R。2结果21总RNA的质量总RNA经Dnase I处理，用10甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带，且28 S18 S约为21(图1)，说明RNA完整性好，无降

26、解现象。N、T1、T2的OD260OD28 0比值分别为192、183、198，说明样品纯度高。Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel22荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比拟见较多呈有无或强弱变化的差异条带，图2中箭头所示。23差异条带再扩增取T2中约125Kb的条带再扩增，结果见图3。荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改良，极大减少了上述缺乏。差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定

27、引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的重叠带现象减少。DD专用的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改变RT-PCR反响条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1015 kb(图2)，因较长的cDNA片段容易通过Northern blot进展分析鉴定区分真假阳性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致4。

28、通常，再扩增的引物与DD引物一样，本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer)，此为在锚定引物的5端和随机引物的3端分别增加的序列(本文方法中所列差异显示引物序列的划线局部)，这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的时机。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴定(RPA或Northern分析)提供了方便。用常规的序列分析胶进展分辨时,较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本操作改用56的PAGE胶(聚丙烯酰胺)，减少胶的厚度(仅250 m)，通过提高电泳的电压( 3000 V)及

29、温度(55),可显著提高分辨率。同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，根本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物质标记于锚定引物的5端,可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理5、病理过程相关的未知表达基因的研究,相信对提醒生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。军队九五医药卫生科研基金资助课题(96M145)7附：凝胶电泳程序：凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的别离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温

30、度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在 37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.(一)凝胶浓度凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.琼脂糖凝胶的浓度与DNA别离*围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的别离*围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12(二)电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高，DNA别离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高

31、，容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较廉价，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.10*TBE缓冲液的配制Tris硷，108克EDTA，9.3克硼酸，55克H2O至，1000ul(其PH应为8.08.2)临用时用水稀至0.5*TBE(20倍稀释.(三)核酸电泳的指示剂与染色剂1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致一样.二甲苯青的水溶

32、液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，使加样操作更方便.染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色.溴化乙锭(ethidium bromide，E是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中参加终浓度为 0.5ug/ml的EB，有

33、时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用复原剂如甲醛使Ag+复原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.(四)电泳1.电泳装置:电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.2.电泳方法:(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.(

34、2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200400bp的DNA片段，可配制1.21.7%浓度的琼脂糖用于电泳.3.配制0.5*TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化.冷却至60(需要时可参加溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.4.向电泳槽中倒入0.5*TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有气泡，应设法除去.5.在DNA样品中参加0.2体积的载样缓冲液，混匀后，参加样品孔内.6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的

35、距离计算).7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200400bp的PCR产物50V电压，电泳2040min即可.(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比拟被扩增产物的大小.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜别离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能别离.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与下，

36、聚丙烯胺链与链之间穿插联接而形成凝胶.聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效别离*围见表2.丙烯酰胺(%)有效别离*围(bp)溴酚兰*二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).(一)材料1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4可保存二个月.3.10

37、%过硫酸铵过硫酰铵，1克加水至，10ml4可保存一周，-20可保存一个月.4.1*TBE电泳缓冲液5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳根据别离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.2.将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角.3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.4.参加TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止.5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物

38、体上，使成10角，可减少液体泄漏的时机.6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1*TBE 缓冲液.7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的外表，将导致以后DNA电泳带型不规则.8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡.9.接好电极，电压为1-8V/cm，进展电泳.10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，1530min

39、后取出水洗紫外仪下观察结果.12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染.(3).出现引物二聚体应该怎么做？1假设是非特异扩增的小片段条带2可以引物浓度不变，升高一下褪火温度。设计一个引物浓度梯度，接着降引物浓度。3除了做引物浓度梯度，可以降低一下Mg离子浓度，或者干脆做一个镁离子浓度梯度，降低退火温度肯定是非特异产物更多的。引物二聚体的出现是相对的，并不是单纯因为你的条件而导致二聚体的出现，事实上如果引物更倾向于和目的片断结合，正常pcr扩增的话，那引物二聚体就根本不会出现了，换句话说，如果你能扩增出目的条带，则同样的条件，撤去模板，进展pcr循环就

40、有可能出现引物二聚体。引物二聚体的出现并不可怕，只是说明你的引物不是最正确，但不直接决定能否扩增出来，通常只要引物和目的片断有一定的配对区，摸索适宜的pcr条件，应该是能扩增出来的。4拿我的实验为例，我的目的片断GC含量较高，在未加DMSO之前，怎么优化条件，总是扩不出目的片断，而电泳前端的引物二聚体倒是常常光临，且亮度挺高，当向体系中参加1.5l的DMSO后，终于扩出了目的片断，而且二聚体也不攻自破了。5原因之一：6引物二聚体的出现太多，说明你的扩增效率不高，也就是说很多引物没有被用来参与PCR的扩增，尤其是目的片段少的情况下，更能用此解释。你可以检查一下你的扩增产物是不是很多。7单纯依靠降

41、低退火温度，不能解决这一问题，反而会增加非特异扩增的时机。建议你先摸索一下退火温度，提高退火温度常可解决问题。从你的条带位置看，不像是二聚体，到像是非特异扩增的条带，很可能引物设计的不好，还有另一位置扩增效率更高，因为条带短，更容易扩增出来。另外，你用的引物浓度也太高了。正常情况下，终浓度0.1-1uM。8100-200bp应该是非特异的扩增条带。可以提高退火温度以及降低Mg2+浓度试试9你没有说除了100200bp的条带还有没有你要扩增的目的条带？比例是多少？如果有你要的扩增条带，量还可以那没关系呀，把你要的条带切胶继续往后做克隆如果没有你要的扩增条带，建议你重新设计引物好了有时候你反复摸P

42、CR条件还不如你重新设计合成引物来的快10电泳都是引物二聚体，内参是GAPDH，原因可能是模板量太少，1.RNA抽提的问题。抽完RNA后应立即测一下纯度。可以用紫外分光光度仪或甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计算A260/A/280值，如果在之间，说明纯度较好，低于辞职说明有蛋白污染，高于此值说明可能有RNA降解。琼脂糖电泳可以大致的估计一下看三条带的亮度，28S18S5.8S。2.RT没做成功。关于逆转录的反响体系的影响因素都要考虑进去，为了防止RNA被痕量的RNase 降解，一般还应参加RNase抑制剂。3.如果RT没问题，就加大模板的量再扩扩试试。11其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。12. z.