初级检验技师微生物检验讲义第23章立克次体及检验

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1、立克次体及检验本章要点：1.概述2.致病性3.立克次体的检测方法一、概述1.概念：立克次体是一类微小的原核细胞型微生物。2.立克次体的共同特征：大多是人畜共患病原体；以节肢动物为传播媒介或储存宿主；大小介于一般细菌与病毒之间，革兰染色阴性，呈多形性；除极少数外均专性活细胞内寄生；对多种抗生素敏感。3.分类对人类致病的立克次体有五个属：立克次体属（Rickettsia）、柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴通体属。4.外斐反应立克次体的耐热多糖抗原与变形杆菌某些X株的菌体抗原（OX19、OX2、OXK抗原）具有共同的抗原性，因而临床上常用后者代替相应的立克次体抗原进行非特异性凝集反应，这种交叉凝

2、集试验称为外斐反应，用于立克次体病的辅助诊断。二、致病性（一）立克次体斑疹伤寒群主要包括普氏立克次体和莫氏立克次体。1.普氏立克次体常以人的体虱为传播媒介，通过虱粪擦入损伤的皮肤，引起人与人之间传播的流行性斑疹伤寒。2.莫氏立克次体莫氏立克次体的贮存宿主是鼠类，主要传播媒介是鼠蚤或鼠虱，通过蚤粪擦入损伤的皮肤，引起地方性斑疹伤寒。3.恙虫病立克次体通过恙瞒幼虫叮咬传给人，引起恙虫病。4.贝纳柯克斯体（又称Q热立克次体）以蜱为传播媒介，也可不借助于媒介节肢动物而通过接触、呼吸道、消化道等途径传给人，引起Q热。5.汉赛巴通体为杆菌性血管瘤-杆菌性紫瘫和猫抓病的病原体，与猫抓伤、咬伤有关。三、立克次

3、体的检验由于立克次体的传染性较强，病原体的分离鉴定必须保证在安全防护的条件下进行，以防止实验室感染的发生。（一）标本的采集和处理1.患者血液在病程第一周内并在使用广谱抗生素前采集患者血液510ml，立即在患者床边接种于动物。血清学检查标本一般采集3份血液标本，分别取自病程早期、病后1014d及病后2128d。如患者已使用抗生素治疗，因抗体产生较晚，故需采集第4份标本。2.活检或尸检材料组织标本研磨制成10%20%悬液，低速离心取上清接种，若标本有细菌污染，可加青霉素（100l000IUml）置室温作用30min后接种动物。（二）标本直接检查1.立克次体的染色法多用于脏器标本的检查。标本印片、固

4、定后用荧光抗体染色或常规染色镜检。必要时作切片检查。2.核酸检测 采用PCR技术和核酸探针检测。（三）立克次体培养法1.鸡胚卵黄囊培养或细胞培养。2.动物接种常用动物有豚鼠、金黄地鼠、小白鼠、大白鼠及家兔等。（四）血清学试验血清学试验是研究立克次体的重要方法，也是立克次体病实验诊断和鉴定病原体的重要手段。患者双份血清的试验结果，有利于立克次体病现症诊断。1.间接免疫荧光（IFA）试验、ELISA间接法是目前检测标本中特异性抗体的常用方法。间接微量免疫荧光技术的方法敏感，重复性好，又节省材料和时间，因而在血清学诊断及立克次体种别鉴定上广泛应用。单份血清滴度1：128者有现症诊断意义，一般滴度在1

5、：16或以上即为阳性，4倍增长可作为立克次体病的现症诊断。补体结合试验虽特异，但敏感性不如IFA和ELISA且操作繁琐，除Q热诊断外，此法已多被前两者取代。2.凝集试验分为特异性凝集和非特异性凝集试验两种，具体方法如下：特异性凝集试验：微量血凝试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验。微量血凝试验以血清最高稀释度呈凝集者为其滴度，达1：8以上者为阳性。间接凝集试验滴度在1：50以上有诊断价值。乳胶试验结果与间接血凝结果相吻合。非特异性凝集试验：外斐试验常用于立克次体属的三个生物型的诊断，缺乏敏感性和特异性。一般血清滴度达1：160即为阳性，病程中双份或多份血清试验，至少效价有4倍增长才有诊断意义。四、

6、斑疹伤寒立克次体（一）生物学特性1.形态与结构 斑疹伤寒立克次体比细菌小，呈多形性，有球形、球杆状、长杆状或长丝状。在感染细胞内大多聚集成团分布在胞浆内。细胞壁不含磷壁酸，但含有胞壁酸、葡萄糖胺和二氨基庚二酸，与革兰阴性菌的肽聚糖成分相似。斑疹伤寒立克次体最外表含有黏液层和微荚膜结构。2.培养特性 采用鸡胚成纤维细胞、L929细胞和Vero细胞进行分离培养，繁殖一代需要6-8小时，培养时需要CO2。3.抗原构造 立克次体有两种特异性抗原，一种为群特异性抗原，与黏液层的脂多糖有关；另一种为种特异性抗原，与细胞壁外膜的表面蛋白成分有关。大部分立克次体与普通变形杆菌某些X菌株的耐热多糖抗原有共同的抗

7、原性，故可用这些X菌株代替立克次体抗原进行非特异性凝集反应去检测抗体，这种交叉凝集试验称为外斐反应（Wiel-Felix reaction），可作为立克次体病的辅助诊断。4.基因组 本病原体Madrid E株染色体为1111523bP组成的环状DNA，G+C含量为29.1mol%；Wilmington株基因组全长为1111496bp，为单链环状DNA，G+C含量为28.9mol%。5.抵抗力 对热敏感，耐低温和干燥，在干虱粪中能保持两个月左右。对四环素和氯霉素类抗菌药物敏感。磺胺可刺激其增殖。（二）致病性 斑疹伤寒立克次体是地方性斑疹伤寒的病原体，啮齿类动物是其主要储存宿主，主要传播媒介是鼠蚤

8、或鼠虱，自然感染周期为鼠蚤-啮齿类动物-鼠虱、鼠蚤。本病原体主要致病物质有脂多糖、脂酶A及微荚膜样黏液层，患者以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。有的伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤。（三）微生物检验 患者采集血液标本、活检或尸检材料作为检测标本。1.标本直接检査1）免疫荧光检测：多用于脏器标本的检査。荧光显微镜下可见脾、肺及心瓣膜赘生物中有立克次体，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。2）核酸检测：本法敏感度高、重复性好、操作简单，对斑疹伤寒立克次体早期诊断、鉴别诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价值，且所需样品量只需ELISA实验的1/5.2.分离培养 动物接种分离培养病原体，

9、常用实验动物为豚鼠，实验动物应隔离饲养，以防交叉感染。每日观察动物1-2次，注意观察其活动及饮食等有无异常情况。3.鉴定1）抗原检测：用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的特异性抗原；并用已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。2）抗体检测：主要采用外斐反应、间接免疫荧光试验、ELISA、补体结合试验等进行抗体检测。五、恙虫病立克次体（一）生物学特性1.形态与结构恙虫病立克次体，具有多形性，但以球杆状或短杆状为常见。长约0.5-1.2m，平均1.2m；宽0.2-0.6m。革兰染色阴性，吉姆萨染色呈紫红色；Macchiavello染色呈蓝色；Gimnez染色呈暗红色。背景为绿色

10、。细胞内寄生的恙虫病立克次体分布在细胞质内，密集于细胞核旁。2.培养特性 恙虫病立克次体是专性细胞内寄生的微生物。常采用动物接种或细胞培养方式进行培养。在敏感动物体内、鸡胚卵黄囊内，以及组织培养的细胞内均能生长、繁殖。3.抗原成分 具有耐热性多糖抗原和特异性抗原。与变形杆菌OXk株具有共同抗原成分。4.基因组 目前有Boryong株和Ikeda分别在2007年和2008年被测序注释。前者为线性DNA，全基因组长2127051bP，基因组G+C含量为30.5mol%，后者为环状DNA，全基因组长2008987bp，基因组G+C含量为30mol%。（二）致病性 恙虫病的疫区主要分布在东亚、南亚、东

11、南亚、太平洋岛屿、日本和我国的东南与西南地区。每年感染人数估计在一百万人。病原体致病因素为死后所释放的毒素样物质，患者可表现为高热，通常在3841之间，寒战、头痛、肌肉痛。皮疹一般在发病后3-8天出现。严重的患者常出现并发症，包括肺炎、肝炎、心脏的病变、肾功能损害、脑膜炎和脑炎等。（三）微生物学检验患者采集血液标本、活检或尸检材料作为检测标本。1.直接检测1）抗原检测：ELISA间接法是检测标本的特异性抗原或抗体的最常用方法。2）PCR：可以检测出20ng恙虫病立克次体DNA水平。2.分离培养接种小鼠分离病原。3.抗体检测 主要采用外斐反应、间接免疫荧光试验、ELISA、补体结合试验等进行抗体

12、检测。六、贝纳柯克斯体（一）生物学特性1.形态与结构 个体较小，多为短杆状或球杆状，常排列成对，大小为0.41.0m，宽0.2-0.4m，在细胞空泡中繁殖。Gimnez法染色呈红色，背景呈绿色，用Giemsa染色呈紫红色。革兰染色阴性，但着色不显。有荚膜，约20nm厚，呈绒毛状。可有芽胞。2.培养特点 鸡胚是培养大量立克次体的极好宿主。一般培养10-12天。一个鸡胚卵黄囊膜中的繁殖量可达2109个立克次体。一般不引起明显的细胞病变。3.抗原成分 为颗粒性抗原，表现为两相。4.基因组 目前共有5株贝纳柯克斯体被全基因组测序，均为环状DNA。5.抵抗力 抵抗力强，70-90加热30-60min尚难

13、杀死，除了对乙醇、乙醚、三氯甲烷等脂溶剂敏感外，一般消毒剂杀灭该病原体较为困难。对氯霉素和四环素类抗菌药物敏感。（二）致病性 Q热在我国绝大多数省、市和自治区均有报道。病原主要储存于动物中，如牛、绵羊、山羊等，传染源主要是受感染的牛、羊等。对人的感染力特别强，是立克次体中唯一可不借助于媒介节肢动物，而感染动物的排泄物污染环境后，通过接触，气溶胶经呼吸道、消化道等途径感染人及动物。其致病物质为脂多糖。患者除出现发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎和肝炎为其主要的临床特征。（三）微生物学检验 患者采集血液标本、活检或尸检材料作为检测标本。1.直接检测1）抗原检测：免疫荧光法进行检测。2）核酸检测：具有

14、髙灵敏度、操作简单、重复性好、检测速度快等特点。2.分离培养 病原体分离只是在该地区尚未证明有Q热存在，病情特别严重，致病源不能确定的流行中才有必要。一般实验室多将标本接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与否或生长情况，经形态学、血清免疫学等鉴定后作出结论。3.抗体检测 主要采用外斐反应、间接免疫荧光试验、ELISA、补体结合试验等进行抗体检测。七、埃立克体（一）生物学特性1.形态与结构 革兰阴性小球菌，呈多形性，直径为0.5-1.5m。Romanowsky染色呈蓝色和紫色。电镜下受侵细胞胞质内可见包涵体。2.基因组 目前有5株埃立克体属菌株被全基因组测序。3.抗原成分 埃立克体有7种主要蛋白抗原

15、，其中22kD为热敏性，其他均为热稳定性。各种埃立克体均可有血清学交叉反应，但交叉反应的程度有较大的差异。（二）致病性 埃立克体属有腺热埃立克体、查菲埃立克体和人粒细胞埃立克体3个种，分别引起人腺热埃立克体病、人单核细胞埃立克体病及人粒细胞埃立克体病。（三）微生物检验1.直接检测1）直接显微镜检査：标本经Giemsa或Wright染色，在光镜下观察细胞内圆形、深紫色桑葚体进行检测。2）核酸检测：PCR技术是最有效的埃立克体病的病原学诊断方法，可用于埃立克体病的早期诊断。2.分离培养 可通过细胞培养、小鼠接种及从蜱内分离埃立克体来进行分离培养检测。3.抗体检测 主要采用间接免疫荧光试验、ELIS

16、A、免疫印迹试验等进行抗体检测。八、汉赛巴通体（一）生物学特性1.形态与结构 为弯曲的杆状小体，常呈多形性；革兰染色阴性、Giemsa染色呈紫蓝色，镀银染色呈黄色。其大小为0.5m1m初分离的汉赛巴通体有菌毛，初代后可消失。基因组大小为2005kb。 2.培养特性 汉赛巴通体是营养要求苛刻的需氧杆菌，用新鲜绵羊、马、兔或人血的琼脂或巧克力、活性炭-酵母浸液琼脂以及心脑浸液或心浸液琼脂等。于35-375%CO2环境下培养。（二）致病性 汉赛巴通体是巴通体属内对人致病的一个重要病原微生物，可引起人类杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜和猫爪病。（三）微生物检验1.直接检测1）直接显微镜检查：活检病理标本用Wa

17、rthin-Starry染色能查见多形性病原体。2）核酸检测：PCR技术是最有效的埃立克体病的病原学诊断方法。2-分离培养 将患者血液和（或）研磨的组织悬液接种培养基，待长出菌落后做生化反应，分析其细胞脂肪酸和16SrRNA序列等加以鉴定。3.抗体检测 主要采用间接免疫荧光试验、ELISA、免疫印迹试验等进行抗体检测。【习题】与立克次体有共同抗原成分的细菌是A.痢疾志贺菌B.大肠埃希菌C.绿脓杆菌D.变形杆菌E.产气杆菌正确答案D地方性斑疹伤寒的传播媒介是A.蜱B.蚊C.鼠蚤D.恙螨E.鼠正确答案C流行性斑疹伤寒的传播媒介是A.蜱B.蚊C.鼠蚤D.人虱E.恙螨正确答案D立克次体与细菌的主要区别是A.有细胞壁和核糖体B.含有DNA和RNA两种核酸C.严格的细胞内寄生D.以二分裂方式繁殖E.对抗生素敏感正确答案C由立克次体引起的疾病是A.梅毒 B.沙眼 C.莱姆病 D.性病淋巴肉芽肿 E.恙虫病正确答案E下列除哪项外均为特异性反应A.肥达试验 B.锡克试验 C.外斐反应 D.补体结合试验 E.SPA协同凝集试验正确答案CB型题A.流行性斑疹伤寒 B.地方性斑疹伤寒 C.Q热 D.猫抓病 E.恙虫病1.与莫氏立克次体有关的是 正确答案B2.与普氏立克次体有关的是 正确答案A3.与东方立克次体有关的是 正确答案E4.与汉赛巴通体有关的是 正确答案D5.与贝纳柯克斯体有关的是 正确答案C