分子生物学实验讲义_final

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1、-实验安排实验内容时间安排学时细胞培养引物设计抽提RNA枪头、离心管等DEPC处理自学、讲述灭菌抽提RNA枪头、离心管、LBRNA抽提RNA电泳cDNA一链合成20/5星期日 上午上午下午下午4PCR扩增扩增期间配LB及感受态制备用品，灭菌，倒平板PCR产物电泳检测及回收提质粒酶切基因和质粒接种DH5、BL21单克隆用于制备感受态26/5星期六 上午 中午 下午 下午 下午4酶切产物回收、电泳检测连接制备感受态细胞DH5和BL21转化27/5星期日 上午上午下午下午4观察、鉴定转化结果，测序28/5 星期一2实验一 PCR引物设计PCR引物设计的目的是为了找到一对适宜的核苷酸片段，使其能有效地

2、扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循*些原则，则有助于引物的设计。1.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级构造区：*些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级构造的影响，选择扩增片段时最好避开二级构造区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级构造，有助于选择模板。实验说明，待扩区域自由能G小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。假设不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的

3、。3.长度：寡核苷酸引物长度为15-30bp，一般为20-27bp。引物的有效长度 Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74),不能保证产物的特异性。4.G+C含量:G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。假设按公式Tm=4G+C+2A+T估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最正确。5.碱根底随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样

4、会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身:引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状构造影响引物本身复性。这种二级构造会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。假设用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于4bp。7.引物之间:两引物之间不应不互补性，尤应防止3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3端；引物的延伸是从3端开场的，不能进展任何修饰。3端也不能有形成任何二级构造可能，除在特殊的PCRAS-PCR反响中，引物3端不能发生错配。防止3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。9.引物的5端：设计5端

5、和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并：如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。11.简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物，只知道目的片段氨基酸序列而不知其具体核酸序列时使用。为了增加特异性，可以参考密码子使用

6、表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3端使用简并碱基，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度1M到3M，因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。同时，简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。实验二 哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳一、实验目的学习并掌握总RNA的别离提取，检测质量以及定量的方法。 二、实验原理细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多占80%85。在p

7、H 6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何防止RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境；实验介绍如何使用TRIzol来别离总RNA。 TRIzol是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能

8、在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。注意：TRIzol 具有强烈腐蚀作用，小心操作。三、实验材料、试剂与器材1、细胞5106Hela2、DEPC水溶液，PBS，TAE3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯4、TRIzol试剂购自Invitrogen5、烧杯1000，500，100，50ml假设干，量筒1000，500，250，50，20 ml假设干，玻璃棒，药勺，试剂瓶，三角瓶。枪头1000、200、20 ul，离心管 (0.2ml、0.5ml PCR管 ,1.5ml、2ml、7ml离心管)，枪头盒。四、实验步骤1.RNA提取前的准备1、玻璃器皿，金属及耐250物品的处理：于高温烘

9、箱中干烤，180，5小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部。2、塑料制品的处理： 0.05-0.1%的DEPC 焦碳酸二乙酯水浸泡过夜：l 必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5ml PCR管，必要时应用枪逐个的用水灌注这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作。l 泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。l 121，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反响，烘干，备用。l DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶

10、的活性基团组氨酸的咪唑环反响而抑制酶活性。具强挥发性，致癌物,因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。3、试剂的配制：试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但 DEPC能与胺和巯基反响,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾*的试剂，然后高压灭菌。所需烧杯等必须干烤处理以前方可用。0.05-0.1的DEPC水三蒸水，磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜，121，30分钟高压灭菌。2.RNA的提取(TRIzol法)：平安去除细胞生长介质往细胞培养瓶中参加1ml PBS洗涤单层细胞，不要将细胞破裂，倒出PBS洗涤

11、液向细胞培养瓶中参加1mlTRIzol，以枪小心吹打室温下培育五分钟使核蛋白复合物充分别离向EP管中参加0.2ml氯仿/1mlTRIzol，用力摇晃15秒钟，室温培育三分钟12000g，4oC离心15min小心吸取上层无色水样层0.6ml/mlTRIzol转移至一新EP管中参加0.5ml/mlTRIzol异丙醇，室温放置15min 12000g，4oC离心10min，轻轻倒去上清参加1ml /mlTRIzol 75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min，4oC离心5min弃上清，倒置EP管，5-10min空气枯燥勿完全干躁，难再溶，参加20ul的DEPC水55加热RNA5-10min提高

12、RNA溶解度，-70保存注意：异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。因此，假设去蛋白后，样本被剩余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。因此，将水相中RNA彻底从有机相中别离出，并防止通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。3、琼脂糖凝胶电泳检测1、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用；2、以DEPC处理的水稀释50TAEDEPC处理的水配制，高压灭菌为1TAE备用；3、用以上1TAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶；4、电泳 5V/cm 电泳20min 5、电泳图谱：28s和18 s条带清晰、28s亮度是18s

13、亮度的2倍以上4、分光光度计测定浓度。1、加2-3l于500 l无菌水，颠倒混匀；2、置于石英吸收池中，测量OD280和OD280；3、根据公式计算RNA浓度。RNAg/l=A260稀释倍数404、计算A260/A280，A260/A280应在1.82.0*围内,低于1.8也可以用，通过凝胶电泳的结果得到证实。实验三 反转录-聚合酶链式反响 RT-PCR一、 实验目的通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。二、 实验原理逆转录-聚合酶链反响 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 是间接对*一特定的RNA分子的扩增

14、，可分作相对独立的两个步骤：即RT将mRNA反转录成cDNA和PCR通过聚合酶链式反响扩增特定的cDNA。其原理是：由总RNA或poly(A) +RNA(mRNA) 采用OligodT或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进展PCR扩增，而获得目的基因或检测基因。一、反转录酶的选择：1 Money 鼠白血病病毒MMLV反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱；2 禽成髓细胞瘤病毒AMV反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性；3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+

15、存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级构造；4MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大局部的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级构造的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择：1随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源

16、于rRNA；2Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小；3特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，假设PCR反响用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该

17、技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要，必须完整，且不被基因组DNA污染。三、实验材料、试剂与器材1第一链cDNA合成试剂盒promega公司2dNTPmi*：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM申能博彩3Taq DNA聚合酶Takara4、特异引物Invitrogen合成5、模板RNA(上次实验提得)四、 实验步骤1. cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理根本一样，但操作步骤不一。现以promega公司提供的M-MLV试剂盒为例。1在pcr管中，参加0.5

18、l inhibitor40U/l，参加总RNA 0.5-2g，在管中加10M OligodT12-18 2l，补充适量的DEPC H2O使总体积达14l15l ，轻轻混匀、离心；270加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中，冰浴5min，离心，将液体收至管底，冰浴中参加以下试剂的混合物：10mM dNTPmi* 1.5l5PCR buffer 5l inhibitor40U/l1l M-MLV反转录酶 1lDEPC水 2.5l Total 25l 42孵育60min。3于94加热3min以终止反响。4-20保存备用第一链反响混合物可在-20保存3个月以上。2. PCR1取PCR管，依次参加以

19、下试剂： 10PCR buffer 5lMgcl2 2l dNTP(10mM) 0.5l上游引物10pM 2l 下游引物10pM 2l 第一链cDNA 1lTaq 酶1u/l 1l ddH2O 11.5l Total 25l2轻轻混匀，离心；3设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。条件： 1. 94 5min2. 94 40sec3. 60 40sec4. 72 15sec5. Go To 2, 32 cycles 10. 4 Forever4电泳鉴定：进展琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；5密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进展密度扫描,检测相对表达量。五

20、、本卷须知1逆转录反响过程，需建立无RNAase环境，以防止RNA的降解；2为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；3 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量，防止假阴性，常用的内参有G3PD甘油醛-3-磷酸脱氢酶、-Actin-肌动蛋白等；4 防止DNA的污染：1可采用DNA酶处理RNA样品。2在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。实验四 DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习琼脂糖凝胶电泳别离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。二、实验原理琼脂糖agarose是一种直链多糖，是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组

21、成的线型多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，不吸附被别离的物质，是一种很好的凝胶剂。45开场形成多孔性刚性滤孔，孔径大小决定于琼脂糖浓度。DNA分子碱性环境下带负电荷，外加电场作用下，从负极向正极移动，兼具电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，以分出不同区带。EB溴化乙锭为扁平状分子，与DNA分子形成EB-DNA复合物，在UV照射下，发射荧光，且荧光强度与DNA质量成正比，以肉眼观察，可检测5ng以上的DNA。注意：EB分子具有强致癌性，请小心使用。三、实验材料、试

22、剂与器材质粒DNA、微波炉、电泳仪、微型电泳槽、天能凝胶成像系统、三角瓶250ml琼脂糖、50TAE、6loding buffer、EB母液0.5mg/ml四、实验步骤(一) 制胶1 选择大小适宜的电泳制胶板，选择孔径大小适宜的点样梳，水平而垂直地架在封好的电泳制胶板的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.51.0mm；2 按被别离DNA分子的大小，确定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：琼脂糖的含量%别离线状DNA分子的有效*围Kb0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1称取适量琼脂糖，参加装有适量1电泳缓冲液的三角瓶

23、中，摇匀，置微波炉中加热，直至琼脂糖融化均匀琼脂糖极易暴沸，加热时间不能过长，一般在加热一分钟后，数十秒地进展直至溶解均匀，沸腾时的琼脂糖溶液不能摇晃以免溶液扑出, 加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发；3 待凝胶溶液冷却至60左右时，参加最终浓度为0.5g/ml的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；4 待凝胶冷却凝固后，小心拨出梳子,保证点样孔完好，将凝胶放入电泳槽内，参加电泳缓冲液至液面覆盖凝胶2-3mm，排出点样孔内气泡制备琼脂糖凝胶和进展电泳所用的电泳缓冲液必须一致。(二) 点样待测的DNA样品中加1/5体积的6*溴酚蓝指示剂，混匀后小心地进展点样，记录样品次序与点样量，点样量于

24、点样孔大小匹配如果DNA浓度较大，加的体积较小，就须加水或电泳缓冲液补足到规定体积，再加溴酚蓝指示剂混合均匀后点样，点样时枪头垂直，防止碰坏凝胶孔壁，带型不齐。(三) 电泳1 翻开电源开关，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。根据需要设电压为15V/Cm，本实验选择5v，当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高，根据溴酚兰条带估计电泳位置；2 电泳时间看实验的具体要求而异。在电泳中途可用紫外灯直接观察，待DNA各条区带分开后，电泳完毕。一般当溴酚蓝条带移动到胶全长的2/3左右时,可停顿电泳，取电泳凝胶直接拍照或绘图每次测定时，要有分子量的DNA片段作为标准，进展对照电泳。实验五

25、DNA 片段的别离-从琼脂糖凝胶中别离DNA片段一、 实验目的通过本实验学习掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的工作原理及操作方法。二、 实验原理目前回收DNA片段的方法很多，常用的有冻融法，透析袋法，电泳回收法，玻璃孔回收法，本实验学习掌握低熔点琼脂糖法。平时可根据实验的需要选择适宜的方法进展DNA片段的回收。三、实验材料、试剂与器材PCR产物，电泳仪，电泳槽，天能凝胶成像系统，1%琼脂糖胶，50TAEbuffer，刀片，凝胶回收试剂盒四、实验步骤(一) 从琼脂糖凝胶中别离DNA片段的操作步骤将样品进展琼脂糖电泳，方法步骤见实验二，但注意以下不同：1. 先用去污粉清洗电泳槽、电泳制胶板和点样梳

26、，清水冲净后，再用蒸馏水浸泡备用；2. 选择点样孔大小可供20-50微升较检测点样孔大左右的样品量点样如无此长距离的点样孔，也可用透明胶封住23个点样孔。注：尽量挑选比较薄点样梳制备回收用的琼脂糖凝胶，这样跑出来的DNA条带较窄，利于减少下一步切下来的琼脂糖凝胶块的体积。3. 按常规方法制备琼脂糖凝胶，但在凝胶制备过程中要保持环境中没有DNA污染；不同大小的DNA片段要选择适合的琼脂糖凝胶浓度，在允许的情况下，琼脂糖凝胶的浓度越低越好。4. 点样时尽量防止样品的外泄，所以点样孔的体积要比样品体积稍大，如果同一块凝胶回收多个样品更要注意防止因点样过多而造成的样品彼此之间的污染。5. 用一只手拿住

27、塑料板的一端，另一只手将电泳槽稍倾斜之，小心地把塑料板插入琼脂糖凝胶下面，把胶铲起放在长紫外灯上；(二)低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法1 戴好手套，准备好已灭菌的Eppendorf管子、医用眼科解剖刀与小电泳槽宽度一致的铲板一块，要把以上用具清洗后才可使用，防止酶的破坏作用；2 在紫外灯下，用医用解剖刀在目的DNA片段的泳动方向正前方挖出一小块琼脂糖凝胶，挖块的大小与DNA样品量的多少有关；注：DNA片段的回收一般在长波紫外下进展，因为紫外线对DNA的破坏随波长的增加而减少，但是本实验室只有混合波长的紫外灯，所以，在切胶的步骤上时间要尽量的短，以目的DNA片段的损伤。3 在紫外等下用医用解剖刀尽量

28、切除含DNA的凝胶，把含目的DNA区带的凝胶块放在Eppendorf管中；4 大致估计凝胶块的体积，加5倍于凝胶块体积的20mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA缓冲液，将Eppendorf管子摇动数次。5 把Eppendorf管子放在65水浴中，510分钟，使低熔点琼脂糖凝胶融化；6 在室温20下用等体积的的酚与氯仿1:1抽提一次，离心，吸出上层水相。7 再用氯仿与异戊醇24:1抽提一次，离心，吸出上层水相。8 加3MNaAC至最终浓度为0.3M，再用二倍体积的无水乙醇沉淀DNA，置-20约12小时，12，000rpm离心10分钟，弃去乙醇；9. 75%乙醇洗涤沉淀后，离心，去乙醇，

29、室稳烘干；10.将DNA溶解在适量的无菌双蒸水中；11.取0.5微升点样电泳，确定其浓度与纯度。(三)各种柱回收法请严格按照试剂盒的说明书进展操作。本实验采用凝胶回收试剂盒，操作如下：1. 在紫外灯下将凝胶中的目的片段割下不要在紫外线下暴露超过30秒，放入1.5ml EP管预先称重中，称量凝胶的重量。2. 参加等体积binding buffer1g加1ml，在5565孵育7分钟23分钟晃一下，促进溶解溶液为桔红色就加5l醋酸钠，浅黄色则不用3. 10000g 离心1分钟4. 将离心管中的液体转入柱子上，10000g 离心1分钟，弃去废液5. 用300l binding buffer洗柱，洗去非

30、特异性吸附，10000g 离心1分钟6. 用700l SPW washing buffer，室温放置23分钟，10000g 离心1分钟7. 重复步骤68. 弃去收集管中的液体，重新放入柱子，10000g 离心1分钟9. 把柱放入干净的1.5ml的离心管中，参加30l Elution buffer，室温放置23分钟，10000g 离心1分钟，弃去柱子10. 把上步中的离心管20保存离心管中的得液体即为目的DNA溶液。注意：a) 从琼脂糖凝胶中回收DNA时，不容易做到彻底除净琼脂糖，这是因为琼脂糖是从琼脂中提取的，而琼脂中的琼脂胶含有硫酸根和羟基的多糖，因此绝大多数的琼脂糖中都带有含硫酸根的多糖，

31、这种物质与DNA一起从凝胶中被抽提出来，它将强烈地抑制内切酶、连接酶、激酶、聚合酶等活性。此外，从琼脂糖凝胶中回收DNA的效率与DNA分子量的大小有关，当DNA分子量小于1kb时，可以绝大局部被回收，当DNA分子量大于20kb时，回收率一般低于20%。b) 在凝胶电泳中观察DNA区带时，为了防止DNA样品受到损伤，要用300360nm长波长的紫外灯照射，尽量缩短照射时间，并使照射距离不能太近。11. 电泳检测回收到的目的DNA浓度。实验六 DNA的体外连接一、 实验目的通过本实验学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法，即将实验回收的目的片断与载体质粒片段进展定向连接的工作

32、原理及操作方法。二、 实验原理在基因工程中，外源DNA片段和载体DNA的连接方法很多。如果不利用专一性的限制酶切点，而利用*些酶对DNA能切出平整的末端，然后利用T4DNA连接酶将两者连接，这就是平头末端Blut end连接法。但是它要求DNA的浓度高，连接酶的用量比粘性末端的连接大20100倍，因此不普遍被利用。采用粘性末端进展基因连接是最普遍，最方便的一种方法。一般来说所采用的限制性内切酶也以方法成熟，价格廉价的为好。T4 噬菌体DNA连接酶的作用：在有ATP存在的连接缓冲系统中，催化两个双链DNA片段5端磷酸和3端羟基之间形成磷酸二酯键。 DNA连接酶的作用步骤有：1) T4DNA连接酶

33、与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物腺苷酰酶。2) 酶-AMP复合物再结合到具有5磷酸基和3-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。3) 产生一个新的磷酸二酯键，将缺口封起来。以上连接反响的最适温度为37。但是在这个温度下，粘性末端的氨键结合点是不稳定的。一般限制性内切酶作用所产生的末端，仅仅通过4-5个碱基对相结合，这缺乏以抵抗该温度下的热运动。因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反响，其最适温度是采取催化反响与末端粘合这两者反响温度的折中。一般采用16过夜或者12。也有人采用7-8，连接23天。本实验采用promega公司的pGEM-T TA克隆试剂盒，严格按照试剂盒的说明书进展操作。

34、pGEM-T 和pGEM-T Easy 载体系统可用于PCR 产物的克隆。这两种载体是通过EcoR酶切pGEM-5Zf(+)和pGEM-T Easy 载体，并在3末端参加胸腺嘧啶构建的。插入位点3-T 突出端可提高PCR 产物的连接效率，与DNA 聚合酶在PCR产物末端加的A 尾配对。三、实验材料、试剂与器材PCR胶回收产物，promega公司的PGEM-T TA克隆试剂盒，低温水循环水浴锅四、实验步骤1. 确定好载体DNA和外源DNA 的量，计算每微升DNA所含的摩尔数；2. 将载体DNA和外源DNA以摩尔数比约为1:3的比例混合，补无菌双蒸水至9l；T载体的连接 连接体系： 2buffer

35、 5l DNA 3.5l T载体 0.5l T4 DNA连接酶1l Total 10l3. 弹匀，短暂离心；4. 置4水浴中,连接过夜416小时。注意：影响连接反响效率的因素1. 连接酶的用量：在一般情况下，酶浓度高，反响速度快，产量也高。但是当使用的连接酶单位下降时，要参加大量连接酶，而连接酶是保存在50%甘油中，因此在连接反响系统中由于甘油含量的过高，会影响连接效果。如果连接酶的纯度欠佳，加进的连接酶到达一定浓度后，再增加酶量对加快反响速度并不明显，而杂酶如降解酶的作用变得明显，反而影响产率。2. 作用时间与温度：反响时间是与温度有关的，因为反响速度随温度的提高而加快。在我们实验中，根据试

36、剂盒要求，采用4，但是在选择反响的温度与时间关系时，要考虑在反响系统中其他因素的影响。3. 底物的浓度问题：一般采用提高DNA的浓度来增加重组的比例，但当底物浓度过高，反响体积太小即浓度太大时，连接效果也很差，这可能是分子运动受到阻挠。4. 干扰因素：在酶切与连接反响中，除了要求有较高质量的纯酶以外，也要排除其他干扰因素，如EDTA的存在会抑制酶的活性。DNA样品中有蛋白质、RNA存在，也会阻碍与DNA的直接作用，因而影响酶切与连接效果。当酶切完毕，为了去除加进去的内切酶蛋白质，以及在终止酶切反响时加进去的EDTA，都需要进一步提纯DNA样品。实验七大肠杆菌感受态制备与转化一、实验目的通过氯化

37、钙法制备大肠杆菌的感受态，学习将体外重组的DNA上次实验的连接产物引入受体细胞，使细菌具有新的遗传特性，并从中筛选出转化子的常用方法。二、实验原理重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化transformation。常用的转化方法是使用0的低渗CaCl2溶液处理大肠杆菌，菌细胞膨胀成球形，细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化体系中参加适量的DNA后，形成DNA-钙磷酸复合物粘附于细胞外表，经42短暂热冲击，促使细胞吸收DNA复合物，转化成功的细菌，得到的外源DNA可复制表

38、达，使获得新的遗传性状，载体中的抗生素基因得到表达，可在选择性培养基上筛选出来。 本实验所用重组DNA的载体带有E.coli中的-半乳糖苷酶基因LacZ的调控序列和局部编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后可与宿主细胞之间实现-互补而产生Lac+，在生色底物*-gal存在下形成蓝色菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。三、实验材料、试剂与器材上次实验的连接产物重组DNA、受体菌E.coli, DH5、LB平板、涂布棒、氯化钙、*-gal、IPTG、恒温水浴锅、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、冷冻高速离心机等。四、实验步骤1、感受态细胞的制备1超净

39、工作台挑取一DH5单菌落于5ml LB培养液中37培养过夜。2取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37振摇培养3-4小约200转/分钟。3取1.5ml菌液置冰上冷却15min，使菌液冷却至0每组准备两份。44，4000 rpm，离心5分钟收集菌体。5弃尽上清，小心吸去剩余的液体。6用100ul冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液小心悬浮细胞。7冰浴25分钟84，4000 rpm，离心5分钟，弃上清，参加100ul冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液小心悬浮细胞，即制成感受态细胞，4冰箱保存过夜或者加终浓度15%的甘油置于-80冰箱保存备用。2、转化9取4管已制备好的

40、感受态细胞，冰上自然融化。按照下面的设置分别参加空载体、ddH2O、连接产物和重组质粒。空载体ddH2O连接产物重组质粒阴性对照0.5ul空白对照10 ul处理10 ul阳性对照0.5ul10用移液器的吸头轻轻混匀。11冰上放置30min。1242热击90秒，保持静置。13迅速放于冰上冷却2-3分钟。14向转化管中参加200ul不含抗生素的预热的LB，37，120-160转/分钟，振摇45分钟复苏细菌。151,2000离心30 S，去除200ul上清，混匀100ul转化混合物铺于含抗生素Amp的LB琼脂平板提前涂布上*-gal和IPTG上，正面放置10分钟待液体吸干，倒置平板，于37培养过夜。

41、1616-18小时后观察转化结果。五、本卷须知1、为防止对感受态细胞的破坏，制备感受态时吸管应剪去尖端扩大口径。2、制备感受态细胞的培养时间最好以OD值来决定，细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进展成功转化的关键。 3、用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定*围内成正比，但当参加的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。此外，对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进展转化。 4、防止杂菌和杂DNA的污染，整个操作过程均应在无

42、菌条件下进展。整个操作均需在冰上进展，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。实验八 质粒DNA的提取一、实验目的通过质粒DNA的提取实验，全面掌握质粒DNA的提取纯化技术及其原理。学会使用各种离心机设备。二、实验原理质粒DNA的抽提常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。碱裂解法具有抽提的质粒DNA产量高、快速等优点。其原理是：在pH为12.012.6的碱性环境，线性的大分子量细菌染色体DNA双螺旋构造遭到破坏而变性，但由于质粒DNA分子量相对较小且呈环状超螺旋构造，即使在高碱性条件下两条互补链也不会充分别离。当参加中和缓冲液后，pH值调至中性，变形质

43、粒DNA又恢复到原来的构型；而染色体DNA则不能复性交联形成不溶性网状构造，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心就可以除去大局部细胞碎片染色体DNA、RNA和蛋白质，质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清中，混杂的RNA 可用RNA酶RNAase。最后加水溶解即可得到质粒DNA。三、实验材料、试剂与器材菌落PCR筛选呈阳性的克隆接种培养得到的菌液、质粒抽提试剂盒、离心机、灭菌水等。四、实验步骤1、在1.5ml EP管中参加1.5ml菌液， 12000rpm离心1分钟，弃上清。再次参加1.5ml菌液，12000rpm离心1分钟，弃上清，吸尽剩余的液体

44、。2、参加100l溶液，用枪头重悬菌体沉淀，重悬一定要充分均匀，不能留有细菌团块(可用振荡器振荡)，室温下放置5分钟。3、参加200l溶液, 盖紧管口，立即上下颠倒4-5次，动作要轻柔 (千万不要振荡)，室温放置2分钟左右至溶液变澄清。4、参加400l溶液，盖紧管口，上下颠倒EP管5-10次，使沉淀混匀，充分中和。5、12000 rpm离心15分钟，无需低温离心。6、小心将上清转移到3S柱中，注意不要将沉淀物吸起，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染，室温放置2分钟。7、12000 rpm离心1分钟，取下3S柱，弃去收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中。8、吸取700l Wash Solu

45、tion到3S柱，静置2分钟，12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。9、重复步骤一次。10、将3S柱放入收集管中，12000 rpm离心2分钟使3S柱中的废液去除完全。11、3S柱放入干净的1.5ml离心管中，在3S柱的膜中央加30-50l TE或ddH2O，室温放置2分钟。12、12000 rpm离心1分钟，收集质粒溶液。取1l琼脂糖凝胶电泳鉴定抽提质粒的质量及浓度。洗脱的质粒可以用于各种分子生物学操作或-20保存备用。五、本卷须知1、参加溶液和溶液时一定要温和，不能剧烈摇动。实验九质粒DNA的限制性内切酶酶切一、实验目的通过限制性内切酶的酶切实验了解限制性内切酶及酶切的条件，学

46、会分析质粒DNA的酶切图谱及重组质粒的酶切鉴定。同时了解菌落PCR及酶切鉴定等常用阳性重组克隆的鉴定方法。二、实验原理细胞内存在DNA甲基化酶和限制性内切酶，它们对DNA底物有一样的识别顺序但生物学功能相反。甲基化酶能在限制性内切酶所识别的假设干碱基上甲基化，防止了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏。本实验所用的限制性内切酶属于II型限制性内切酶，特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。本实验通过限制性内切酶酶切实验初步鉴定所挑选的克隆中是否有目的片段的插入，最终的结果要通过测序进展验证。三、实验

47、材料、试剂与器材上次实验抽提的质粒、限制性内切酶EcoR和 BamH、电泳仪、恒温水浴锅等。四、实验步骤1、质在EP管内参加限制性内切酶酶切反响体系20ul质粒DNA(重组质粒和空载体) 1ug10酶切反响缓冲液 2ulEcoR I 1ulBamH I 1ul无菌蒸馏水 补足至20ul 2、混匀离心，37水浴酶切2-3小时。3、取5 ul酶切产物电泳鉴定是否酶切完全，分析是否有目的片段插入。五、本卷须知1、注意不同的限制性内切酶的反响温度不一致，绝大多数限制性内切酶的反响温度为37，也有个别要求在50-65。2、不同的限制性内切酶所用的缓冲液也不同，在进展双酶切时一定要注意这两种酶是否有共用的缓冲液。3、电泳时注意设置未酶切的对照组，以便比照观察酶切效果。. z