研究生分子生物学知识点

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1、分子生物学知识点总结1. 蛋白质组（proteome） : proteins expressed by a genome,即基因组表达的全套蛋白质。蛋白质组学（Protemics）则是以蛋白质组为研究对象，从整体 角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。（相互作用网络PPI）2. 表达蛋白质组学研究的基本流程：蛋白样品的制备及定量-总蛋白的双向凝胶电泳（染色）-凝胶分析软件分析-胶内酶解（胰肽酶）-质谱分析（肽质量 指纹图谱）-数据库搜索鉴定蛋白性质3. 双向凝胶电泳：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，先经等电聚焦电泳（isoelectricfocu

2、sing ， IEF），再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE把复杂的蛋白质成分分离。4. 比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织） 之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或 者发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。5. 软电离：所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会 形成碎片离子。6. 肿瘤血清蛋白质分析方法（tumor serologic proteome analysis , SERPA: 是从肿瘤免疫学观点出发建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法。SERPA其实验过程如下： 双向电泳分离

3、肿瘤组织（细胞）总蛋白质； 转膜； 建立western blotting 蛋白质印迹反应图谱（与患者或正常人血清反应）； 软件分析确定差异反应的蛋白质斑点； 质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶（replica gel）中相应的差异蛋白 质点进行鉴定，筛选出肿瘤分子标志物； 用ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证，或者进一步分 析该蛋白功能，研究其在肿瘤进展中发挥的作用。7. 蛋白质芯片：是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面， 形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分 析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。8. 功能蛋白质

4、组学：是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RN间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。研究方法主要有：蛋白质芯片技术目前常用蛋白质芯片有：1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片2. 抗体芯片3. 靶蛋白质芯片4. 液相蛋白质芯片 噬菌体展示技术 酵母双杂交系统 免疫共沉淀9. 免疫共沉淀（Co-lmmunoprecipitation ）:是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。10. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：根据蛋白质分子量

5、不同分离复杂蛋白质 成分。1.制备凝胶试剂：丙烯酰胺（单体）；亚甲双丙烯酰胺（胶联剂）二者 比例29 ： 1；母液浓度30%过硫酸铵（引发剂 引发交联）；N,N,N, N - 四甲基乙二胺（TEMED （加速剂）十二烷基磺酸钠（SDS（阴离子变性剂）2. 蛋白上样缓冲液3.电泳缓冲液 4.考马斯亮蓝R250染色液5.脱色液11. Western blotting 基本原理：将SDS-PAG分离的蛋白质转移至 硝酸纤维素膜（nitrocellulosemembrane上，在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。12. Southweste

6、rn blotting基本原理：细胞核蛋白提取物经 SDS-PAG后,转移至NCM1,然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。细胞死亡形式表现Cell death细胞生命现象不可逆的停止细胞结构和功能的不可逆丧失。细胞死亡并非与机体死亡同步。正常组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。细胞坏死细胞受到外来的急性的强力的致病因素作用下，细胞正常代谢活动被强行中断而引起的“意外”的、被动性死亡过程；只见于病理情况下。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。核染色质随机降解呈 絮状，蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂，细胞内容物流出，引起周围炎症Apoptosis指在一定的生理和病理条件下，

7、多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制并遵循一定程序的细胞主动性死亡过程.又程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）. |凋亡小体: 胞膜皱缩内陷、反折，包围凝集断裂的染色质、胞质、细胞器等形成芽状、泡状突起并分离脱落， 形成一些有膜包被，内涵物不外溢的小块，称凋亡小体（apoptotic body ）。PCD:多细胞生物体在生长发育过程中，细胞在基因调控下，按照一定时空顺序发生的受到严格程序控制的生理性死亡。 “特殊的定时自杀”PCDApoptosis功能性概念发育学概念形态学概念仅存在于发育细胞可存在于发育和成体细胞 大部分凋亡是PCD PCD的

8、最终结果是凋亡某些凋亡是非程序性。如细胞毒物诱导的凋亡13. 凋亡的生物学意义1、确保正常生长发育、2、维持内环境稳定、3、防御功能14. 细胞凋亡的形态学特征：细胞皱缩;2.细胞质浓缩;3.染色质边集核膜下，呈块状、新月形，4.凋亡小体形成；5.凋 亡小体内有结构完整的细胞器。细胞凋亡的生化特征：染色质DNA片段化内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180200bp整倍数的寡聚核苷酸片段。在琼脂糖凝胶电泳中呈特征性的梯状”条带（DNA ladder:细胞凋亡时DNA在核小体间断裂（DNA fragmentation ） 形成一些DNA片断，经过提取和纯化后在凝胶电泳上

9、产生 n条 梯状条带，故称之为 DNA Ladder，是判断DNA损伤的重要标准）却亡商册* 纽抽JIHPSi 外咄&植冲片雁堪15. Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一组对底物的天冬氨酸部位 有特异水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶。Caspase功能：1.细胞骨架蛋白和核纤层蛋白，导致细胞解体成凋亡小体2 激活 DNA#( Caspase-activated DNase CAD。CAD:Caspase激活的 DNA 酶正常情况下CAD与其抑制剂ICAD结合，在胞质内，无活性。凋亡时Caspase 水解ICAD,游离的CADt活性，进入胞核，切割 DNA3灭活凋亡

10、抑制物： 女口 Bcl-2、ICAD4水解与DNA损伤修复相关的酶和蛋白质如聚 ADP核糖多聚酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP )16. 死亡受体途径-外源性途径：死亡受体TNFR1 Fas、CAR1NGFRDR3DR4 DR5等是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。通路(pathway)死亡配体(细胞外)-死亡受体(细胞膜)-相关蛋白(中介蛋白，细胞质内)-激活Caspase8激活Caspase3-细胞凋亡17. 线粒体损伤途径-内源性途径：线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅 是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。

11、释放细胞色素C (Cyt.c ) 释放凋亡诱导因子(即optosis inducing factor ，AIF)和限制性核酸内切酶 G(Endo G)释放 Smac/Diablo (the second mitochondria-derived activatorof caspase,Smac)(direct IAP bin gdi ng prote in, Diablo)18.释放活性氧ROS细胞周期：1.G1期(firstgap)从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主 要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢 活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显 著增大。这一期的主要

12、意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。2.S 期(synthesis ) 即 DNA合成期，在此 期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。 DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。3. G2期(seco nd gap)期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时 期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。4. M期：细胞分裂期。细胞周期蛋白或周期素(Cyclins):类结构类似、能结合并调节 CDK舌性 的蛋白家族，哺乳动物至少有10种，14个成员(cyclin A 、B1-2、C D1- 3、E、F、G1-2、H、I、K)。cyclins-C

13、DKs-CKIs 系统HIF-1a :几乎参与了对糖酵解每一步的调控；PI3K/Akt途径；Myc； P53等CAilMWtaD19.20.HIF-1a鹑妣沽化PDK押J k线机休仃知用収常罠傭况下：HIF-1aifl过肿楣抑制擴白VHL介S?的泛齋乏氧情况下f H1R帖降桃登損M HlFdttAfik&IIF j p玷& 冊战HIR1*与共滋活转fCBP POOOftHRE越活下浦祀苹園苹號21. Cyclin :周期素/周期蛋白，是CDK（周期素依赖的蛋白激酶）的调节亚基， 分别在细胞周期的不同时期积累，激活 CDK使其具有催化关键底物的磷酸 化修饰并调节其活性。参与细胞周期中不同时相的调

14、节。22. G/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点（restrictionpoint），控制细胞由静止状态的G进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？ 细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？23. cyclin box:各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周 期蛋白盒（cyclin box），是与CDK1互作用的活性区域。24. RNA干扰（RNA interferenee，RNAi ）是将双链RNA导入细胞内引起特异基因的mRN降解的一种细胞反应过程。属于转录后基因沉默的一种。25. 试述CDK活性的调控机制？CDK的催化活性受到激活因素与抑制

15、因素两方面的调节。激活因素中，目前 认为CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种 调节因素。抑制因素中，CDK的 N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋 白的结合是主要的调节因素。磷酸化修饰的激活作用：CDK的激活还必须依 赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr161和CDK2的 Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CA（CDKactivitingkinase ），是另一种蛋白激酶 CDK7-CyclinH复合物。当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。磷 酸化修饰的抑

16、制作用 在人的CDK1和CDK2中 Thr14和Tyr15残基的磷酸化 可抑制CDK的催化活性。催化Thr14和Tyr15磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的为蛋白激酶 Myt1 ，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶 Wee1/Mik1。催化Thr14和Tyr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶 CDC2526. DNA损伤又称基因突变：是DNA复制过程中发生的DNA核苷酸序列的改变， 从分子水平看是DNA分子碱基顺序或数目的改变。突变的形式包括：替换、 插入、缺失、重排27. 突变形式：（一）点突变：指DNA分子上一个碱基对的变异，碱基替换包括：转换（同型）、颠换（异型）典型疾病：镰刀型细胞

17、贫血，碱基颠换AT-TA;（二）插入和缺失-框移突变（frame-shift mutation）:缺失和插入引起的 三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸种类、排列顺序发生改变。（地中海贫血）（三）重排：指DNA分子内发生较大片段的交换，也称重组。移位的DNA片段可在新位点颠倒方向反置（倒位），也可在染色体之间发生交换重组。突变的意义：产生新基因，出现新性状，为生物进化提供了最原始、最根本 的的材料，是进化的分子基础28. DNA损伤的修复：指针对已发生的缺陷而进行的补救机制。直接修复：修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除DNA或切除碱基。包括1. 光修复、2.链断裂的直接重接、3.碱基

18、的直接插入、4.转甲基作用切除修复（excission repair） :在DNA内切酶、外切酶、DNA聚合酶、DNA连接 酶等多种酶的共同作用下，先将DNA受损的单链部位切除，然后以另一条链为模 板，合成一段正确配对的碱基序列来修补缺口。DNA损伤最普遍的修复形式。切除修复的特点：（1）切除修复利用的是化学能 ATP也叫暗修复。（2）修复 发生在复制前。（3）修复的对象是亲代DNA核卄酸拥伤的 OXESt理1 r i i i i ii i i| EM W IV9 I i s I. iI 百1 1 口 I I HI坷幵.I . v_ fI_II_II_nI-* I r ii . i.山 I,

19、JI J, i.* ii i.直 丄I N n .口 iqww(Eim4竄11 T J ! jii ；i ：iTH yn r rr T1 ：i 1 j, A j 1ILEA A FEAttI 1 1 |i 1 t 1i I V ran | 1 Tv R iFfl J 1 L I lx LlAl J 11 1 1 T 9 1 门 fe 1 N il 1 ll 1 i i1T V 1 0 1 11 1 1I t 1i 11 i II 丄虚对*艸皿口衽貝J | | r | IJIS犷卜切 何認y 閃r. ii FE /r 旳Hiuw 询畤创特*! jw e重组修复：当DNA损伤较大、较严重，无法及时

20、修复或缺乏切除修复酶系统， 可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后，在重组基因rec编码的酶（Rec蛋白）、DNA聚合酶、DNA连接酶等的作用下，将无损母链的 DNA片段移 到子链缺口，进行重组修复。发生在复制后，故又称“复制后修复”DNA损伤重组修复的过程及特点:过程：（1）复制：损伤母链复制时，越过损伤部位，子链对应位点留下空缺；无损母链复制成完整双链。（2）重组：空缺诱导产生重组酶（Rec蛋白），RecA与空缺区结合，并催化子链 空缺与无损母链相应片段重组交换（RecBCD蛋白）;有缺子链与无损母链重组， 空缺转移到无损母链，有缺子链完整，损伤母链仍然保留。（3）再合成：转移后的母

21、链空缺以新的互补子链为模板，在DNA聚合酶和连接 酶的催化下，重新修复缺口 ；DNAg的损伤并未除去，随着复制的继续，损伤DNA链将在群体中逐步“稀 释”。修复发生在复制后，对象是子代 DNA.SOS修复：DNA严重损伤难以复制或DNAM制系统受抑制的紧急情况下，为了保 证DNA链的完整性，应急产生校对功能低的修复酶，采用填补任意碱基的修复方 式。这是具有差错的修复，是对极为不利的外界环境的应急反应， 故称SOS修复，也 称差错倾向修复。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物。细胞能存活，但变 异率高，DNA保留错误较多，会引起广泛、长期的突变。自然界也因此而变得生 物种类繁多信号转导通路29

22、. 受体：是细胞膜上或细胞内可以特异地识别与结合化学信号物质（配体）并 能激发靶细胞产生特异生物效应的特殊蛋白质分子。G蛋白：广义的G蛋白是指所有能与GTP或 GDP吉合的蛋白质。细胞信号转导中 扮演重要角色的G蛋白主要有两类：异三聚体G蛋白（与膜受体偶联，位于细胞膜 内侧，由三个亚基组成，一般称为经典G蛋白或大G蛋白。）、单体G蛋白（存在于不同的细胞部位的小分子量 G蛋白，也称为“小 G蛋白”，是单亚基蛋白。 Ras是第一个 被发现的小G蛋白。）SH2结构域：由约100个氨基酸残基组成，中心为反向平行的B片层结构，两侧为 a螺旋。SH2介导信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子的结合，并与磷酸化酪氨

23、酸的磷酸基团结合。这种结合依赖于酪氨酸残基的磷酸化及其周围的氨基酸残基所构成的模体（motif ）。不同的蛋白质分子含有结构相似但并不相同的SH2结构域，因此对于含有磷酸化酪氨酸残基的不同模体具有选择性。SH3结构域：由55-75个氨基酸残基组成,形成一个扭曲卩桶状结构。SH3结构域介导 信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子的结合，其亲和力与脯氨酸残基及邻近氨基酸残基所构成的模体序列相关。30. 1.简述细胞膜受体的类型及其特征：藹于通道受体窈蛋偶联受协内漁性配体神经递届神经递屈.激雾L 趟化因子*外遁剌 味*光生低固子 细胞固子貝肓或不貝育髓比 冊的单体跨膜区段数目彝个了个竹同子通道塑胸应答去扱化

24、与超极化去扱化与超极化 调节哥白质功能 和表达水平凋节蛋白的功能和 衰达水平F调节细 胞分化和增履2.举例说明cAMP-PKA言号传递途径肾上腺素分泌，与膜受体结合，通过 G蛋白偶联激活腺苷酸环化酶催化 ATP 生成cAMPT, cAMP通过激活PKA（依赖cAMP的蛋白激酶）行使功能，PKA*3. 试述RTQ Ras MAPI信号传递途径。该途径的信号分子：生长因子类 EGF PDGF IGF、FGF VGEF等RTK受体酪氨酸激酶（与配体结合及受体二聚化 /寡聚化使酶激活）Ras蛋白：Ras蛋白是细胞内的一种小分子单体 GTPase像其它单体GTPase和G 蛋白三聚体一样，非活化状态时结

25、合 GDP在外源信号的作用下释放 GDP结合 GTP本身即被激活，Ras蛋白亦具有GTPase舌性，将GTP水解成GDP Ras蛋 白本身又回到非活化状态。但 Ras蛋白水解GTP的速度比Ga至少慢100倍。MAPK有丝分裂原活化蛋白激酶或微管相关蛋白激酶， 属Ser/Thr激酶，是接受 膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子， 在多种受体信号 传递途径中具有关键性作用。*凶予酪氨醴激酗岌体RTK)據头蛋门(筲 SI12/SH3JCGRB2)Sos (Gbh 満性)GTP Rus GTP (17汗性GMz-LRas GDF f*(无活性)*GAEJU f(线/弗氨諛澈#PMEK

26、(MAPKK)按转朋凶f-梵它胞衆蛋门其它澈鲜31. 抑癌基因 （tumor suppressor gene ）: 又称为抗癌基因（antioncogene ）是一类在正常情况下对细胞增殖有 负调控作用，而在两个等位基因都缺失 或失活时可促进肿瘤形成的基因。常见的有p53、Rb VHL APC32. p53的功能：（1）抑制cyclin A 的表达；（2）抑制DNA聚合酶与DNA复制 起始复合物的结合；（3）激活抑制细胞分裂的基因；（4）抑制癌基因对细 胞的转化。33. 基因诊断：采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构 （DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应

27、的疾病进行诊断。是 病因的诊断。分子生物学相关实验34. PCR-RFLP多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析，靶基因PCR扩增、 扩增的DNA片段限制性酶切图谱（长度多态性）。主要用于核酸变异性分析 与比较。35. PCR-SSCFP诊断有无突变）：聚合酶链反应-单链构象多态性分析（single strand con formation polymorphism）的简称，原理是将经扩增的 DNA片段 经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异在中性聚丙烯 酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无突变。 广泛应用于检测各种病原体基因的 点突变及缺失突变，基

28、因的多态性分析等 并不能鉴别所有的突变。36. PCR-southern blot或Dot blot技术:是将PCF扩增产物转移到硝酸纤维膜 或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，然后放射自显影，来检测有 无特定的扩增片段及相对含量，现已广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病原体特异基因等方面的研究及检测。37. 核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA RNA/RNA互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。38. 原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行（in situhybridization） 杂交,叫原位杂交。可用于 DNA R

29、NA定位研究。39. DNA印迹技术（Southern blotting） : Southern印迹杂交常用于探测 DNA的限制性内切酶图谱。通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱的变化，可判断是否发生了明显的DNA突变。丄台已如呈因的董组&社厨桃基园细DMA限制囘龍舞圧电法分高回收含己吨棊因的DN査匕段转移爭用啟纤旬科尼亦膜标记的搽针预杂交畋射自區影曲 用Southern印进讀空方法扌苹因诊斷的華皐步蝶PCR过程及原理：又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩 增DNA莫板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。组成体系：template DNA.a

30、t least a couple of primer（长度：20bp 左右;碱基分布：均匀随机，G+C含量:40-60%;引物自身不存在发卡结构；两个引物间 不能互补；引物与非特异靶区段同源性不能超过70% 5 端可修饰（酶切位点）-方便基因隆）；Taq酶；四种底物dNTPs buffer （包括Mg2+。过程： 变性：将双链DNA加热（95 C）使之变性，DNA双链变成单链 退火：降低温度至56C使引物与模板DNA单链结合 延伸：将温度升至72C,在DNAR合酶作用下，在引物3端进行延伸， 使原模板DNA勺一条链变成两条链。Taq酶的特性：a）耐热b）缺乏校正活性（3 -5外切酶活性），相对

31、容易错误掺入c）合成速度：1200bp/mind）在新链3-端额外加上一个Ae）有5- 3外切酶活性，可以real time PCR40. DNA芯片技术：是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地 紧密排列固定于单位面积的支持物上。41. 基因转移的方法：1.逆转录病毒载体（生物学）;2.脂质体；3.直接注射；4. 受体介导基因转移技术；5.磷酸钙共沉淀法；6.电穿孔法；7.基因枪法；8. 显微注射法。42. RNAi（ RNA interferenee ）:是指在生物体细胞内， 短双链RNA（ dsRNA引 起同源mRNA勺特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。一种转录后

32、水 平的同源靶基因沉默，RNAi能达到基因敲除的效果。43. SiRNA制备方法比较希成方法特点适川不适用化学合成已找到址效 slRNA.大量AiFif 1郦延体外箱锻琲性小.稳宜X &需要特定 的.长期RNaseTIIvnittfcififtf经济的研FiJ不HE期，特迢 的siRSA桶冗及刮RNA表达载体价格较高，常用待丄“RNA,览siRNA表达稳定.魁序1怵|雄：长期研究44. 基因工程一般步骤：1.分离目的基因（化学合成、制备 DNA文库、制备基因 组文库、PCR； 2.DNA切割（限制性内切酶vector和目的基因片段）；3.连 接；4.转化：b） E.Coli细胞转化：CaCI2

33、法制备感受态细菌a）真核细胞转化：b）micro-injection （ 微注射）（细胞核大）c）磷酸钙共沉淀法（贴壁细胞）d）electroporation （电穿孔,电激,电击）（悬浮细胞）e）基因枪（贴壁细胞/组织块）f）liposome （脂质体）5.筛选重组体：蓝白筛选（a -互补法）；营养缺陷互补法；抗生素抗性互补。gene manipulation45.46.47.48.Expression vector :就是在克隆载体的骨 架的基础上增加表达原件，如启动子、目的 基因、终止子、标记基因，使目的基因能够 表达的载体。Plasmid :质粒，指一种小环状 DNA分子， 存在与细胞

34、染色体外，能够自主复制产生 特定的功能。LncRNA长链非编码RNA由基因组编码产 生，长度大于200个核苷酸，没有编码蛋 白的能力。Palindrome :回文序列，也叫作反向重复序 列，指核酸序列的5-3方向与其另一条链 相同。Bacterial promoter （P） and operator （O l1Trancjriptjc-nlemuntiUonCkw eneed in f repressor that bi nets O Hnd reguljatpfl PPolylinker with unique for several restric?tioii（iBe1B cIqui口酉

35、 Tt科）Selectable genetic mjirkvr untibiolic49.CRISPR是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA勺免疫机制,Cas9蛋白有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNA的两条单链。Cas9先与crRNA 及tracrRNA结合成复合物，然后通过 PAN序列结合并侵入 DNA形成RNA-DNAt 合结构，进而对目的 DNA双链的切割，使 DNA双链断裂。50.51.基因工程常用的酶：限制性内切酶、反转录酶、Taq DNA polymerase请设计一个QRT-PC或验，简述其原理，过程。（可以结合文献，举例说明）。 qRT-PCR （荧光定量PCR

36、在PCF反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实 时监测整个PCR进程中每一轮循环产物的累积数量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法逆转录-聚合酶链反应，提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA.2WSYBEt/wir Er /inj 12X ）12.5 jJFarwind 卩rinicfhNG-L L（）inMwRjcvtrsc pnncr2 ! AcL-R （】OmM *2ROX 趾圧代ncc Ijc（ 50X ）0.5 jj9 pl2期反应体系：SYBR Premix Ex Taq :含有 TaKaRa

37、 Ex Taq, dNTP mixture, Mg2+, SYBR Green I 等。52. 请设计一个载体，在大肠杆菌细胞中表达一个目的基因（举例说明） 。Recomb inant DNA Tech no logy-Process of cloning :1. Isolation of target gene（分离目的基因）2. Selection and construction of vectors（载体的选择和构建）3. Ligation of target DNA and vector（载体与目的基因结合）提取质粒，限制酶切割质粒，用限制酶从其他组织切割目的基因暴露粘性末端。载 体

38、与目的基因结合得到重组质粒，重组质粒导入E.coli中4. Transformation of target gene into receptor cell（目的基因导入受体细胞） Introduction:transformation（E.coli）transfection（Tumorcells）i nfection （Virus）。5. Screening for recomb inant plasmids（重组质粒的筛选）6. Expressing a cloned gene（克隆基因的表达）53. 内含子：真核生物细胞DNA中的间插序列。含调控序列，参与基因表达。54. 外显子：为蛋白

39、质氨基酸编码的 DNA序列。55. 基因组：一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间 隔序列。56. 真核细胞基因组的特征?DNA量大、断裂基因/含有内含子和外显子、重复序列（出现原因：基因的多拷贝、与染色质的构象着丝点的形成有关、参与表达调控，染色质DNA的 “区间性”）、不存在操纵子结构、57. 微卫星（microsatellite）:遍布于人类基因组的短小重复序列，每一重复序列为1bp6bp,重复次数不超过 60次，片段长度小于 350 bp。58. 操纵子（operon）:由功能相关的一组结构基因（structural genes）串联在一起，包括上游的调控区共

40、同构成。59. 试述转录前水平的表达调控的方式：基因丢失（体细胞分化过程中，必须将某些基因永久性关闭。最简单有效的方式是将这些基因丢失。将要分化为生殖细胞的细胞 则一直保留着整套基因组）、扩增（发育分化、环境条件的改变，对某些基因产物的 需要量急剧增加一一增加该基因的拷贝数）、重排（某些基因片段改变原来存在的顺序重新排列组合。）、甲基化修饰（脊椎动物中，DNA上特定的CpG序列处C可发生甲基化修饰（5mC）、染色体结构。60. CpG island :具有CpG二核苷酸簇的500碱基的区域（至少55% G+C含量，0.65或更大比率的观察和预期o/e CpG二核苷酸频率），定义为CpG岛。61

41、. 顺式调控元件（cis-acting element,CAE）:基因周围能与特异转录因子结合而影响 转录的DNA序列。包括启动子（与RNA聚合酶结合并起动转录的DNA序列）、增强子、沉默子。62. 增强子（enhancer）:增强启动子功能，促进基因转录活性。必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。作用方式：具有组织特异性。无基因特异性。无方向性。可位于上下游远距离作用。（ 3000bp）具有相位性。具有一定空间相位。63. 反式作用因子（trans-actingfactor）:由位于不同染色体或同一染色体上相距较远的基因编码的蛋白质因子。结构：一个完整的反式作用因子含有2个必不

42、可少的结构域，即DNA结合结构域（DNA bindingdomain）和转录活化结构域 （trans-activat ing domai n）。反式作用因子通过前者与DNA特定序列结合，通过后者发挥转录活化功能。反式作用因子的作用机制：（1）转录因子相互作用、（2）竞争性排除组蛋白、（3） 与核基质蛋白作用（空间网络状结构）、（4） DNA解旋作用。64. RNA剪接：将hnRNA核不均一 RNA中的内含子序列切除，外显子部分连接起来， 称为RNA剪接。65. 表观遗传学(epigenetics ):表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰。66. 反义RNA (ant

43、i-sense): 一段含有与被调控基因所产生mRNA补碱基序列的小分子RNA67. RNAi:作用是生物体内的一种通过双链RNA分子在mRNAK平上诱导特异性序列基因沉默的过程。由于RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默(posttran scripti onal gene sile ncing, PTGS)mRNA勺研究方法Northern Blot :定性、半定量; RT-PCR定性、定量 原位杂交：定性、 cDNA芯片：反义定位、半定量RNA RNA干扰、MicroRNA、转录组从组织或细RT-PCR咒标记的U*定性、半定量蛋白质的研究方法Wester n BlotALw-2OTinrtSl trivia tty.闌和I脚幄嵌门孤免疫组织化学：定性、定位、半定量 抗体芯片：蛋白质组学：2D-PAGE/2 Dimensional-PAGE:二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 技术结合了等电聚焦技术 (根据蛋白质 等电点进行分离)以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(根据 蛋白质的大 小进行分离)。