食品中志贺氏菌检验实用教案

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1、一、实验(shyn)目的 了解(lioji)食品安全与志贺氏菌检验关系1 了解志贺氏菌生理形态(xngti)化学性质2 掌握志贺氏菌检验方法和结果判断3检验食品中是否有志贺氏菌4第1页/共19页第一页，共19页。二.实验(shyn)原理需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.4-7.8。37培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳糖(r tn)，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。第2页/共19页第二页，共19页。

2、三、实验的试剂(shj)和仪器仪器(yq)与设备试剂试剂(shj)和仪器和仪器培养基与试剂第3页/共19页第三页，共19页。仪器(yq)与设备规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶1个制增菌液3、250ml三角瓶4个制培养基4、18180mm试管(shgun)制三糖铁培养基5、13100mm试管(shgun) 制蛋白胨水等6、1ml移液管7、10ml移液管8、直径为90mm平皿 5副 制SS、EMB平板9、250ml量筒1个10、玻璃棒 11.、恒水浴箱 1个12、显微镜 1台 镜检第4页/共19页第四页，共19页。培养基与试剂(shj)GN增菌液225ml/瓶1

3、瓶500ml三角瓶EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶SS琼脂 100ml/瓶 1瓶250ml三角瓶三糖铁斜面 6ml/支 6支 15150mm试管葡萄糖半固体培养费基 4ml/支 5支 13100mm试管蛋白胨水2ml/支5支 13100mm试管5%乳糖(r tn)发酵管 3ml/支5支 13100mm试管甘露醇发酵管 3ml/支5支13100mm试管棉子糖发酵管 3ml/支 5支 13100mm试管甘油发酵管3ml/支 5支13100mm试管 第5页/共19页第五页，共19页。四、实验(shyn)步骤验步骤 实流程图操作步骤第6页/共19页第六页，共19页。流程图流程图 采样 样

4、品处理 选择性增菌 选择性平板划分(hu fn) 生化实验 镜检 结果报告 第7页/共19页第七页，共19页。实验(shyn)前的准备 对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗 注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠 对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行(jnxng)包扎：要将报纸裁成5-10公分，成30卷起，结尾处向上折叠即。包扎(boz)灭菌第8页/共19页第八页，共19页。培养基的制备(zhbi) 1.CN 增菌液 成分:胰蛋白胨20g 柠檬酸钠5g 磷酸二氢钾1.5g 葡萄糖1g 去氧胆碱酸钠0.5g 氯化钠5g 甘露醇2g 磷酸氢二钾4g 蒸

5、馏水1000ml ph7.0 制法：按上述成分配好，加热溶解，校正PH。分装每瓶225ml ， 115 C高温(gown)灭菌15min 2、HE琼脂 成分：蛋白胨12g 水杨素2g 蒸馏水1000ml 乙液20ml 牛肉膏3g 胆盐20g 0.4% 溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼脂20g 甲液20ml HP7.5 制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合并，冷却，倾注平板，第9页/共19页第九页，共19页。培

6、养基的制备(zhbi) 3、SS琼脂液的配制 成分：牛肉膏0.6g 琼脂2.04g 三号胆盐0.42g 蒸馏水120ml，月示胨0.6g 制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入600ml蒸 馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合121高压灭菌15min,保存备用。 4、麦慷慨琼脂液的配制 成分：蛋白胨2.04g 脙胨0.36g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g 氯化钠0.6g 琼脂2.04g 蒸馏水120mL 乳糖1.2g 0.01%结晶紫水溶液1.2mL 0.5%中性红水溶液0.6mL 制法： 将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2， 将琼脂加入于

7、600ML蒸馏水中， 加热溶解。将两液合并，分装于121高压灭菌15min备用。 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至5055时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注(qngzh)平板。第10页/共19页第十页，共19页。培养基的制备(zhbi) 5、伊红美蓝琼脂（EMB） 成分：蛋白胨 10g 2%伊红溶液20ml 乳糖10g 0.65%美兰溶液10ml 磷酸二氢钾28g 蒸馏水1000ml 琼脂17g PH7.1 制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解(rngji)于蒸馏水中，校正ph，分装于烧杯内，121c高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶解(rngji)琼脂，冷却，加入伊红和美

8、蓝溶液，摇匀。倾注平板。 6、三糖铁琼脂的配制 成分：蛋白胨4.8g 牛肉膏0.6g 乳糖1.2g 蔗糖1.2g 葡萄糖0.12g 氯化钠0.6g 硫酸亚铁胺0.024g 硫代硫酸钠0.024g 琼脂0.72g 酚红0.003g 蒸馏水120mL pH7.4 制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解(rngji)于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121高压灭菌15min。放置高层斜面备用。第11页/共19页第十一页，共19页。培养基的制备(zhbi) 7、生理盐水的配制 成分Nacl0.9g,蒸

9、馏水100ml 制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15min 8、氯化钠结晶紫增菌液的配制 成分：蛋白胨2.4g 氯化钠4.8g 0.01%结晶紫溶液0.6mL 蒸馏水120mL pH9.0 制法：胨晶晶紫外，其他(qt)按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸，过滤。再加入结晶紫溶液，混合后分装试管。121高压灭菌15min第12页/共19页第十二页，共19页。操

10、作步骤 1.灭菌 干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌 湿热(sh r)灭菌：均质袋、纱布、各种培养基、生理盐水、增菌液 2.采样 从食堂中取一个鸡蛋 3.样品处理 将鸡蛋打碎放入无菌碗里，然后用杀菌的玻璃棒搅拌，在放入到均质袋中用均质器打匀 4. 增菌 称取检样25g，加入装有225mlGN增菌液的500ml的广口瓶内，于（361）培养6-8h第13页/共19页第十三页，共19页。操作步骤 5.分离 取增菌液一环 ，划线接种于SS琼脂平板一个，伊红美蓝琼脂平板一个，于（361）培养18-24小时。志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。 6.生化试验 挑取平板上的可疑菌落，接种三塘铁琼脂

11、和半固体各一管，一般应多挑取几个以防遗漏，志贺菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面(ximin)产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内，沿穿刺线生长。 7.镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。 8.结果报告 第14页/共19页第十四页，共19页。五五 注意事项注意事项1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后，应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。第15页/共19页第十五

12、页，共19页。注意事项注意事项3、增加(zngji)鉴别培养基的数目，可以增加(zngji)志贺菌的阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个；弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作为弱选择性培养基使用。4、动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。第16页/共19页第十六页，共19页。实验(shyn)结果志贺菌在培养基上呈现(chngxin)无色透明不发酵乳糖的菌落志贺菌在三糖铁琼脂中底沉产酸，不产气，斜面产碱，不产生硫化氢 无动力在，在半固体管内沿穿刺线生长。第17页/共19页第十七页，共19页。第18页/共19页第十八页，共19页。感谢您的观看(gunkn)！第19页/共19页第十九页，共19页。