分子生物学实验步骤总结超全

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1、一 目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（一） 仪器1） 台式高速离心机2） 恒温水浴箱3） 枪式移液器4） 灭菌的EP管和Tip头（二） 试剂1） 溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶现用现配 100ug/mlRNase2)溶液：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K3） 酚：氯仿：异戊醇25：24：14） 氯仿：异戊醇24：15） 3mol/L NaAc(pH5.2)6） 异丙醇或无水乙醇7） 70%乙醇8) TE缓冲液： 10mmol/L

2、 Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0(三) 实验步骤1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。2） 将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37C水浴保温过夜。3） 加250uL溶液，55C水浴保温4小时。4） 加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇25：24：1，轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。5） 向转移的水相中参加0,9倍体积的氯仿/异戊醇24：1，轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。6） 向转移的水相中参加0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体

3、积的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇，冰上放置30分钟。7） 14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温枯燥。8） 将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20C保存。9） 进展DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。植物DNA的SDS提取法：一试验试剂：1研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTANa分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0，并定容至1000ml。210 SSC溶液：称取87.66gNaCl 和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。31 SS

4、C溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。40.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。5Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80水浴处理5min以破坏可能存在的Dnase。6氯仿异戊醇：按24ml 氯仿和1ml 异戊醇混合。75mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4H2O70.23g，先参加少量蒸馏水溶解再容至100ml。8) SDS十二烷基硫酸钠化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中到达饱和为止，然后在7080的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9) 1m

5、olLHCl。10) 0.2mol/LNaOH。11) 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml 冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml 乙醛液浓乙醛：H2O1：50VV。12) 1.0mol/L高酸溶液HClO4。13) 0.05mol/LNaOH。14) DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml 至50ml 容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100g/ml 的标准溶液。二实验步骤：1

6、) 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml 预冷研磨缓冲液并参加0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2) 将匀浆无损转入25ml 刻度试管中参加等体积的氯仿异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3) 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4) 将试管置72水浴中保温3min不超过4min，以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液提取液：高氯酸钠溶液4：1VV，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5) 再次参

7、加等体积氯仿异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心4000rpm5min，取上清液置小烧杯中。6) 用滴管吸95的预冷乙醇，慢慢地参加烧杯中上清液的外表上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7) 然后参加0.5ml 左右的10 SSC，使最终浓度为1 SSC。8) 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9) 参加已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为5070g/ml，并在37水浴中保温30min，以除去RNA。10) 参加等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室

8、温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11) 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。二、 PCR扩增目的基因(一) 器材1) 微量移液器2) 灭菌的Tip头、PCR管3) PCR扩增仪4) 目的DNADNA模板5) dNTP混合物6) 引物对7) Tap酶8) PCR扩增试剂盒二试剂110PCR 缓冲液含Tris-HCl 100mmol/L; MgCl2 15mmol/L、KCl 500mmol/L,pH8.3，0.1%明胶 2) 脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成 10mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。 3氯仿-异戊醇：配成2

9、4：1的比例，室温避光保存。 4) 酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 5) 3M NaAc 、ddH2O6) 无水乙醇：70%乙醇 7) TE缓冲液 三实验步骤1在0.2ml薄壁反响管中参加以下成份：混匀 ddH2O: 补至终体积25l 10PCR缓冲液 1/10总体积 2.0mM dNTPs 1l 2U/l Taq DNA聚合酶 0.5l 引物混合液10 pmol /l /引物 1l DNA模板 0.6l混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。 2在设定好的PCR仪上反响 95C，5min；95C，1min；56C，1min；72C，2min。反响30轮。 3反响完毕后，将反响管在72C充分延

10、伸10分钟，再将反响管冷却至4C。 取一局部反响液进展琼脂糖凝胶电泳(实验三)，确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反响液中含有连接反响阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续46。 4转至1.5ml离心管，向管中加25l酚，25l氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。 5吸取上层液，转至另一已加5l 3M NaAc的1.5ml的离心管，加150l无水乙醇，-20C过夜。 6离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml 70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。弃上清，烤箱中干60C，溶于20l TE。 四技术要点 1PCR各组份的配制与加样量要特别注意。 (1

11、) 引物浓度：10 pmol 足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非 特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。 (2) 引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1 OD约含33g。开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2g/l，再取局部稀释至10 pmol /l。 引物浓度计算公式：1pmol=(3.310-4g) n ，n是引物的碱基数 (3) Mg2+：使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团， Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。 (4) 模板DNA：浓度不可过高，质粒DNA 20ng即可，假设需第二次扩增

12、，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。 (5) Taq DNA聚合酶：一般用量5U/100l。酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3端加A。 2扩增轮数与退火温度扩增轮数：一般30轮以就可使模板扩增106倍，超过30轮，错配率升高。 退火温度计算公式：Tm值=GC4+AT24 三、 琼脂糖凝胶电泳的检测(一)仪器1琼脂糖凝胶电泳系统天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪2凝胶成像仪(二)试剂及材料 目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂 盒 1)TAE电泳缓

13、冲液浓储存液 50：242g Tris；57.1ml冰乙酸；100ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0) 定容至一升。使用液 1：4.84g Tris；1.15ml冰乙酸；2ml 0.5 mol/L EDTA(PH8.0) 定容至一升。2样本液10缓冲液: 60%蔗糖；0.4%溴酚蓝三实验步骤1将有机玻璃槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。20.8%琼脂凝胶板的配制：取0.6g琼脂糖加80ml TAE1，20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55C-65C，参加EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。根据目的基因的大小选择琼脂

14、糖凝胶浓度。 3充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，参加TAE1，使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。 4DNA样品按照10：1的比例参加样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进展电泳。 5接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm按照两极之间距离计算，电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停顿电泳。 6剥胶并在凝胶成像仪观察结果。四 技术要点 1选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的

15、泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。 不同浓度琼脂糖凝胶及其可别离的线性DNA大小围见下表1。 表1 不同浓度琼脂糖凝胶及其别离线性DNA分子的有效围凝胶浓度% 别离DNA的有效围kb 0.3 605 0.6 201 0.8 100.8 1.0 70.5 1.2 60.4 1.5 30.2 2.0 20.1 2电泳中注意防止凝胶发热。 3将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm电极间的最小路径。随着电压的增加，琼脂 糖凝胶的有效别离围缩小。 4溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。四、目的DNA的回收纯化(一)仪器1琼脂糖凝胶电泳系统2凝胶成像仪3离心机4单面刀片5恒温水浴锅(二试剂

16、1 DNA回收试剂盒250TAE3） ddH2O(三)实验步骤1在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖放入1.5ml离心管中。2 按每100mg琼脂糖参加300600l 溶胶液的比例参加溶胶液本实验加500ul，置55水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体再将吸附柱放入同一个收集管中。4在吸附杜中参加500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。5再在吸附柱中参加500uI漂洗液， 12000r

17、pm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6 12000rpm 室温空离心1分钟。7将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央参加30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟为提高回收效率可再洗脱一次，将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20。五、限制性切酶消化、产物回收及连接重组(一)仪器及材料1回收得到的目的DNA2BamHI、 HindIII、 T4 DNA连接酶、DNA回收试剂盒3pUC18CAT 质粒、双蒸水、10酶切通用缓冲液K4EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机 表1 常用酶切缓冲液配方 缓冲液名称 配

18、 方 贮存温度 10L 100mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT -20 10M 100mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT 500mM NaCl -20 10H 500mM Tris-HCl,pH7.5100mM MgCl210 mM DTT 1000mM NaCl -20 10K 200 mM Tris-HCl,pH8.5100 mM MgCl210 mM DTT 1000mM KCl -20 10TBSAFree330mM Tris-Ac,pH7.9 100mM MgAc 5 mM DTT 660mM KAc

19、-20 0.1% BSA -20 0.1% Trition *-100 -20 (二实验步骤1在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反响体系：酶切反响体系20ul体系管号 核酸 10酶切通用缓冲液K ddH2O BamHI HindIII 1 15ul目的DNA 2ul 0ul 2ul 1ul 2 10ulpUC18CAT质粒 2ul 5ul 2ul 1ul2)37保温三小时。3) 酶切产物的纯化回收，每100ul溶液参加700ul溶胶液，其余的操作步骤详见实验四4) 载体与目的DNA的连接。在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反响体系20ul：目的DNApUC18CAT质粒 10连接缓冲液 T

20、4 DNA连接酶 ddH2O * ul Y ul 2ul 1ul Zul目的DNA和pUC18CAT质粒的相对浓度约为1:31:10514水浴保温过夜。六、 大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化 (一) 仪器1 小型高速离心机2 恒温摇床3 恒温培养箱4 20冰箱5 恒温水浴器 6 超净工作台7 高压灭菌锅(二)材料1氨苄青霉素2大肠杆菌DH5a3连接产物4离心管5 枪头、微量移液器6试管、培养皿、三角瓶(三)试剂LB培养基根据需要确定配制的量： 10g/L 胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。 氨苄青霉素： 用去离子水配成100

21、mg/ml的储存液，过滤除菌，20分装保存。 卡那霉素： 用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20分装保存 无抗生素LB琼脂糖平板培养基根据需要确定配制的量： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37培养24小时，保存在室温。 含有抗生素LB琼脂糖平板培养基根据需要确定配制的量： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50左右，参加终浓度为100g/ml 的氨苄青霉素或50g/ml卡那霉素，并铺平板

22、，冷却后在37培养24小时，保存在室温。 0.1 M CaCl2根据需要确定配制的量：11.099克溶解在1000ml灭菌水中，0.22m滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：110.99。 50甘油： 50ml甘油参加50ml水，混匀，高压灭菌。 其他： DH5大肠杆菌，灭菌玻璃平皿假设干，接菌环，加250ml LB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml和500 mL离心管假设干，灭菌刻度吸管假设干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。四实验步骤 1以接菌环从70保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时； 2挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB

23、培养基中，37振荡培养过夜； 3按照1:100接种菌液至250 mL LB培养基中，37剧烈振荡培养1.5-2 小时左右，至OD600达0.4-0.6； 4将菌液冰浴10 分钟，转移至预冷的500 mL离心管中，4，4000 rpm离心10 分钟； 5弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50 mL预冷的0.1 M CaCl2中，冰浴20 分钟，4，4000 rpm离心10 分钟； 6弃尽上清。以12.5 mL菌液体积的5预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时参加等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50L在冰上分装，80保存； 注：以上操作全部在无菌条件下进展。 7取连接产物2l在实际

24、操作中，经常需要取全部连接产物置于冰上； 8从80冰箱取3管感受态细菌每管50l，在冰上融化； 9将连接产物参加感受态细菌中，混匀，放置冰上2030分钟；同时做两个对照管 受体菌对照：50l感受态细胞+2l无菌水 质粒对照：50l0.1 M CaCl2溶液+2l连接产物1042加热90秒，迅速置于冰上12分钟； 11每管参加4001000l的无抗生素液体LB培养基，在37摇床缓慢摇荡2060分钟； 12用10000rpm离心10秒，弃去大局部上清，留下约50l并用移液器吹吸重悬细菌； 13取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性根据质粒所携带抗生素抗性基因而定的LB琼脂糖平板上，倒置于37培养箱

25、培养12小时以上，出现菌落。五技术要点1参加的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5； 242热激时，必须要保证温度的准确性； 3涂布LB平板的菌液量应该根据经历确定。如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LB平板上生长密度适宜的单菌落； 4涂布平板之后，在37培养的时间不超过1216小时，否则可能产生卫星菌落； 5防止其它质粒污染； 6防止其它细菌污染。 七、 质粒DNA的提取及重组子的鉴定(一) 仪器1 恒温培养箱2 恒温摇床3 小型高速离心机4 高压灭菌锅 5 分光光度计（二） 试剂及材料1.转化重组子

26、2.缓冲液A：50mM葡萄糖；10mM EDTA；25mM Tris-HCl，pH8.0。3.碱溶液：0.2M NaOH; 1%SDS, PH12.5。 4.乙酸缓冲液：3M NaAC；2M乙酸，pH4.8盐酸调pH。 5.TE缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA.。 6.RNA酶A溶液：10mg/ml RNA酶 A，用TE配制，100C煮10分钟，灭活DNA酶。缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20C保存。 7.LB培养基: 10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl加水至1000ml，用1M NaOH调pH至7.5，高压灭菌。 8.氨苄青

27、霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20分装保存。 9.LA培养基: 在LB培养基中参加终浓度100g/ml的氨苄青霉素。 10.异丙醇 11.酚-氯仿-异戊醇：25：24：1 12.70%乙醇 13.3M NaAc（三） 实验步骤1 从转化平皿上挑一克隆接种到LA液体培养基中，37震荡培养，待细菌浓度增至OD600=11.2时，收获细菌。菌液转到1.5mlEppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。 2加100l缓冲液A，充分混悬细菌。 3加200l碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。 4加150l乙酸缓冲液，反复倒转管5

28、次，混匀，冰浴10分钟。 5离心10000rpm，5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。 6加等体积的酚-l氯仿-异戊醇25：24：1混匀，离心10000rpm，1分钟。 7吸上层水相至另一Eppendorf管中，加等体积的氯仿混匀，离心10000rpm，1分钟。 8吸上层水相至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温或-20C，10分钟。 9离心10000rpm，10分钟，弃上清，参加1ml 70%乙醇。勿混匀，离心10000rpm，5分钟，重复参加1ml 70%乙醇一次，弃上清，枯燥箱中枯燥。 10枯燥后，参加30l TE含RNA酶A 10ul，20g/ml

29、，使质粒溶解，-20C保存备用。11) 取一个灭菌的EP管，依次参加以下试剂 10限制酶缓冲液2.0ul、重组质粒5.0ul、ddH2O 11.0ul、限制性切酶2.0ul总体积为20.0ul。12） 将上述试剂轻轻混匀，稍加离心，集中溶液，37C水浴保温34小时。酶切完毕时，参加0.5mmol/L EDTA(PH8.0)使终浓度达10mmol/L，以终止反响。13） 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。四技术要点1每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。 2参加碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解液体变清亮必须马上加乙酸缓冲液中和。 370%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。