薄板层析法鉴定四环素纯实用教案

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1、生物生物(shngw)(shngw)分离工程实验分离工程实验I I 基础基础(jch)实验：实验：第第11/12周周薄板层析法鉴定四环素成品纯度薄板层析法鉴定四环素成品纯度第第14周周PEG400/(NH4)2SO4两水相系统相图的制作两水相系统相图的制作第第15周周两水相系统中蛋白质分配系数的测定两水相系统中蛋白质分配系数的测定第第16周周离子交换树脂总交换容量的测定离子交换树脂总交换容量的测定第1页/共23页第一页，共24页。实验实验(shyn)(shyn)内容及时间内容及时间u薄板层析薄板层析(cn x)法鉴定四环素纯度法鉴定四环素纯度u 实验一班：第实验一班：第11周周 周一，周四周一

2、，周四u 实验二班：第实验二班：第12周周 周一，周四周一，周四u两水相萃取相图制作两水相萃取相图制作u 实验一班：第实验一班：第14周周 周一周一u 实验二班：第实验二班：第14周周 周四周四u两水相萃取蛋白质分配系数测定两水相萃取蛋白质分配系数测定u 实验一班：第实验一班：第15周周 周一周一u 实验二班：第实验二班：第15周周 周四周四u离子交换树脂总交换容量的测定离子交换树脂总交换容量的测定u 实验一班：第实验一班：第16周周 周一周一u 实验二班：第实验二班：第16周周 周四周四第2页/共23页第二页，共24页。实验时间安排表实验时间安排表周次日期星期时间发酵实验5-212分离实验5

3、-112115月6日星期一13:30实验一班5月9日星期四13:30实验一班125月13日星期一13:30实验二班5月16日星期四13:30实验二班135月20日星期一13:30实验二班5月23日星期四13:30实验一班145月27日星期一13:30实验二班实验一班5月30日星期四13:30实验一班实验二班156月3日星期一13:30实验二班实验一班6月6日星期四13:30实验一班实验二班166月8日星期六13:30实验二班实验一班6月13日星期四13:30实验一班实验二班176月17日星期一13:30实验二班6月20日星期四13:30实验一班第3页/共23页第三页，共24页。考核考核(koh

4、)(koh)方式方式 考勤考勤提问和操作提问和操作实验报告：预习报告实验报告：预习报告 实验结果实验结果(ji gu)、讨论、思考题、讨论、思考题第4页/共23页第四页，共24页。第5页/共23页第五页，共24页。加深对薄板层析法基本原理的理解。熟悉薄板层析法的操作过程。采用薄板层析法来考察四环素制品(zhpn)纯度。一、目的一、目的(md)(md)和要求和要求第6页/共23页第六页，共24页。（一）层析：色谱 chromatography chromatography一种分离技术。任何层析都具有两个相，固定相固定不动，流动相对固定相作相对运动。不同物质在两相间分配(fnpi)(fnpi)差异

5、，随流动相以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。固定相：固体或液体( (固定在载体上) )流动相：流过固定相的液体、气体或超临界流体。二、实验二、实验(shyn)(shyn)原理原理第7页/共23页第七页，共24页。（二）层析方法：根据机理可以(ky)(ky)分为：分配层析吸附层析凝胶层析离子交换层析亲和层析二、实验二、实验(shyn)(shyn)原理原理根据层析的方式(fngsh)(fngsh)：纸层析薄层层析柱层析第8页/共23页第八页，共24页。（三）薄板层析（TLC）利用不同溶质组分(zfn)在固定相和流动相的两种液体中分配系数不同，展层时形成以不同速度移动的区带，达到分离。溶

6、质易分配在固定相中 溶质易分配在流动相中 二、实验二、实验(shyn)(shyn)原理原理移动移动(ydng)速度慢。速度慢。移动移动(ydng)速度快。速度快。第9页/共23页第九页，共24页。 利用阻滞(z zh)因子Rf值来表征各组分的差别移动： 0 Rf 1,适宜范围0.20.8二、实验二、实验(shyn)(shyn)原理原理 溶质(rngzh)移动距离 同一时间流动相移动距离Rf=第10页/共23页第十页，共24页。二、实验二、实验(shyn)(shyn)原理原理固定相：一般为水及各种水溶液、甲酰胺、低级(dj)醇等。流动相（展层剂）：与水不溶（或微溶）的有机溶剂。 薄板层析法：支持

7、物:中性、多孔粉末、无吸附(xf)活性、流动相自由通过 硅藻土/纤维素/硅胶/氧化铝等，亲水物质能储留水。第11页/共23页第十一页，共24页。（四）四环素广谱抗生素四环素发酵(f jio)或保管不当时，生成抗菌作用弱，毒性强的差向四环素。四环素易溶于流动相液体，差向四环素易溶于固定相液体。氢化骈四苯环 （含共轭双键，可紫外吸收，荧光） 二、实验二、实验(shyn)(shyn)原理原理第12页/共23页第十二页，共24页。本实验所需仪器(yq) 玻璃板 研钵 天平(tinpng) 移液管 硅藻土 EDTA缓冲液 饱和氯化铵缸+架子u展层剂u展层缸u点样毛细管u小刀和直尺(zh ch)u紫外灯u

8、氨水三、主要实验器材与试剂三、主要实验器材与试剂第13页/共23页第十三页，共24页。（一）溶液配制（已配置(pizh)）硅藻土处理： 取薄板层析用硅藻土50g，加25ml浓盐酸和250ml水，搅拌煮沸10min，冷却，过滤，用蒸馏水洗，直至洗液对刚果红指示剂不显颜色，然后用流动相液体洗涤，过滤，105烘箱干燥。EDTA缓冲液（固定相）：在40ml甘油中，加入10ml聚乙二醇400，摇匀即得20%（V/V）聚乙二醇400的甘油溶液（保湿），再加入950ml pH7 0.1M EDTA（鳌合）溶液，混匀即得EDTA缓冲液。展层剂（流动相）：取pH7 EDTA溶液5ml，缓慢加在200ml（丙酮:

9、氯仿:乙酸乙酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展层缸中。样品配制：称取100mg成品四环素，溶于5ml甲醇中得2%（W/V）溶液。四、实验四、实验(shyn)(shyn)方法方法第14页/共23页第十四页，共24页。硅藻土硅藻土 1g 研钵研钵(yn b)EDTA缓冲液缓冲液2ml蒸馏水蒸馏水0.75ml研匀（颗粒研匀（颗粒(kl)适中、无适中、无气泡）气泡）置饱和(boh)NH4Cl缸室温放置室温放置无明显水渍无明显水渍厚度涂均匀，厚度涂均匀，特别下边缘涂满平整特别下边缘涂满平整（二）层析操作四、实验方法四、实验方法第15页/共23页第十五页，共24页。第16页/共23页第十六页，共24页。0

10、.5cm15cm1.5cm均匀均匀(jnyn)无气泡无气泡无裂纹无裂纹毛细管点样毛细管点样点 样 点 甲 醇 挥 发点 样 点 甲 醇 挥 发(huf)干后，将板干后，将板放入展层缸内，密放入展层缸内，密封封晾干晾干(lin n)，氨，氨气熏，气熏，紫外灯下观察紫外灯下观察分别求两种组分别求两种组分的分的Rf值值量距离量距离展层剂展层剂0.5cm 溶质移动距离 同一时间流动相移动距离Rf=第17页/共23页第十七页，共24页。第18页/共23页第十八页，共24页。操作操作(cozu)(cozu)注意点注意点 制板： 在研钵中研磨时应缓慢，注意不能产生气泡。 薄板移入饱和(boh)氯化铵的缸中时

11、，不宜太干或太湿，以无明显水渍为宜。太干展层太快，引起拖尾；太湿展层太慢。 点样： 点样时，尽量使点样斑点直径小。 点样后，待溶剂挥发后再移入展层缸内，不要用电吹风。 展层： 注意展层剂浸没薄层的一端约0.5cm，不能浸没样品斑点。 层析缸盖子应盖密，减少溶剂挥发。第19页/共23页第十九页，共24页。实验实验(shyn)(shyn)结果和讨论结果和讨论（一）预习四环素的硅藻土薄板层析属于哪一种层析机制。固定相和流动相分别是什么(shn me)？为了使层析效果好（不拖尾，分离好），操作中注意事项。（二）实验结果和讨论在纸上描绘出薄板上斑点的图形，量出各斑点组分的距离，计算Rf值。分析实验结果。

12、总结本实验成功或失败的经验教训。五、思考题五、思考题第20页/共23页第二十页，共24页。时间时间(shjin)(shjin)安排安排星期一：制板 室温(sh wn)晾干 饱和氯化铵缸星期四：点样 展层 显示斑点第21页/共23页第二十一页，共24页。值日生值日生 第一组 第二组 第三组擦干净实验桌面擦干净实验桌面整理整理(zhngl)好试剂好试剂药品药品扫地、拖地扫地、拖地第22页/共23页第二十二页，共24页。感谢您的观看(gunkn)！第23页/共23页第二十三页，共24页。NoImage内容(nirng)总结生物分离(fnl)工程实验I。第1页/共23页。6月6日。实验结果、讨论、思考题。第6页/共23页。固定相：固体或液体(固定在载体上)。流动相：流过固定相的液体、气体或超临界流体。固定相：一般为水及各种水溶液、甲酰胺、低级醇等。支持物:中性、多孔粉末、无吸附活性、流动相自由通过。硅藻土/纤维素/硅胶/氧化铝等，亲水物质能储留水。薄板移入饱和氯化铵的缸中时，不宜太干或太湿，以无明显水渍为宜。点样时，尽量使点样斑点直径小第二十四页，共24页。