优化逆转录病毒载体转导T细胞受体基因

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1、II9IJ-Jn 上Lr M优化逆转录病毒载体转导T细胞受体基因牟艳芳，张巨峰，张文峰，邵红伟，黄树林广东药学院广东药学院生命科学与生物制药学院，广州（510006）E-mail: myf831208摘 要：逆转录病毒载体转导 T细胞受体（TCR ）基因进T淋巴细胞，可以潜在的影响T细胞识别抗原的能力为有效的特异性免疫治疗开辟新的途径。提高转录病毒载体转导TCR基因的转染效率和表达水平为以后临床应用有深远影响。本文从TCR基因和逆转录病毒载体两个方面，不同的方法进行综述。关键词：T细胞受体；逆转录病毒载体；基因转导抗原特异性T细胞的过继性转导在治疗肿瘤和病毒性疾病方面很有前景。1-2T细胞受体

2、（TCR）基因转导进 T淋巴细胞可以潜在的影响T细胞识别抗原的能力，转导高活性的TCR基因可以成功地将肿瘤的特异性转导到非肿瘤活性的淋巴细胞。T细胞的特异性主要由TCR决定的，TCR基因转导可以为肿瘤特异性 T细胞的转导提供另一条途径。目前在 TCR基因转导过程中最常用的是逆转录病毒作为载体。逆转录病毒介导基因的高表达对于基因治疗来说是非常关键的特别是当生物效能的发挥主要依赖于转导基因的表达量，因此提高转导T细胞受体基因的转然效率和表达水平对于疾病的治疗及以后临床上的应用都是非 常重要的。1 TCR基因TCR是T细胞表面识别抗原的分子，现已知道参与TCR组成的共有4条肽链即a伙讦口&人类外周血

3、95%T细胞表达a盯CR, 3%5%T 细胞表达Y莎CR 4 。TCR的V区同免疫球 蛋白V区有类似的结构特点：a 3链的可变区各有3个高变区，又称互补决定区（complementary determining region ,CDR）,即 CDR1、CDR2 和 CDR3。TCR 与 MHC-多肽分子结合形成 TCR-MHC 多肽复合物，其中CDR1、CDR2主要与MHC 分子相结合,CDR3直接与抗原肽 结合5 。由于CDR3在T细胞成熟过程中基因重排，从而产生了 TCR的多样性，为T细胞三 分子复合物识别不同的特异性抗原奠定了分子基础6 。逆转录病毒是第一个被允许用于用于临床的载体，也是

4、广泛用于实验室研究和临床试验的载体。8将特异性TCR基因与其重组，经包装细胞包装后，形成具备感染能力的新 病毒颗粒，理论上它能转染几乎100 %的靶细胞，且能整合到基因组中获得稳定而长期的表达 但实际的转染效率远低于此 ，转染人外周血分离的 CD4+和CD8+ T的效率只有6%-9%9。要提高TCR基因的转染效率和表达水平可以从三方面进行，改善TCR基因水平修饰及逆转录病毒载体方面和转染方法。2 TCR基因方面2.1密码修饰基因近年来，有些国外学者通过优化修饰基因密码来加强抗原基因在特定细胞中的表达。此类研究在HIV、HPV等病毒DNA疫苗的研究中取得可喜进展10,11,在鼠体内试验，通过 密

5、码修饰病毒蛋白的 DNA疫苗，CTL应答和抗肿瘤活性也显著提高12。Scholten等通过密码修饰人TCR的a 3基因，然后通过逆转录病毒 LZRS转导进CD8 + T细胞。通过密码修饰的 TCR的a，3基因与野生型的T CR的a，3基因在CD8 + T细胞中的表达比较，发现前者比后者的膜表达水平显著提高，前者为54%，后者为6%。此外转染的T淋巴细胞稳定的表达引入的 TCR近4个月的时间且保持较高的活性，可以为以后以 TCR转染为主 的免疫治疗的临床应用提供更好的基础 .132.2改变竞争关系TCR基因转导进T细胞后再膜上表达较少，主要是由于引入的 TCR基因必须与内源的 TCR以及引入与内

6、源的基因形成的嵌合体 TCR复合物竞争与CD3分子结合，所以通常引入的 TCR基因比内源的TCR在膜上表达较低。近年来，许多学者通过实验解决了此类问题。通过用SiRNA可以抑制内源的TCR的碱 厲因的表达。如前面所述密码修饰的 TCR与内 源性TCR序列不同，SiRNA可以设计以去除内源性 TCR的特异性。McManus 14等通过用 CD4/CD8 EiRNA电转到鼠初始T淋巴细胞，持续3天观察，流氏分析转染48h大约70%的细胞 出现沉默，CD4/CD8 a表达明显下降。初始T淋巴细胞对RNA干扰敏感，为以后进一步研究 T 淋巴细胞的生物学功能和以后的基因治疗提供基础。TCR a异源二聚体

7、形成特异性信号引入 TCR a链以加强表达和形成为唯一配对。细胞膜上CD3蛋白的表达可以促进T细胞的活化15, Willemsen16等通过将HLA-A1特异性，MAGE-A1抑制性CTL克隆MZ2-82/30的询厲因 构建含CD3 Z勺嵌合体双链TCR V仏C a和V 2 BZtcTCR aZB Z将tcTCR a用逆转录病毒载体转导进人初始 T淋巴细胞结果其在膜上不 表达，证明嵌合体TCR a或TCR B与内源性的TCR醸或TCR 0链不能结合，对转导tcTCR aZBZ 的T细胞用荧光标记的TCRV a和 V阱寺异性单克隆抗体作用，发现细胞内TCR a和B表达一致，指出引入的TCR/链唯

8、一配对，同时流氏分析嵌合体双链TCR稳定的表达。3逆转录病毒载体3.1构建新载体pBullet载体包括莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)包装信号，供体和受体RNA剪接位点，最佳蛋白翻译起始方向新基因引入得多克隆位点17。pBullet载体的构建在LXSN的5 LT的 U3区被CMV-IE启动子取代已增加 RNA的表达，SV40区可以产生大量含 SV40 T蛋白 的病毒颗粒，将pBullet载体引入293T细胞，可产生高滴度的病毒。PStitch载体含有供体和受体剪接位点，5逆转录病毒gag序列为转基因更好的转录和包装，如MGF逆转录病毒载体一样，还含有CMV-IE启动子和SV40起始区。此载体需

9、要 pHIT60和pCOLT-GALV辅助转导 进活化T细胞后有高转染效率和转基因的高表达。但这两种载体只能产生短暂的高转染和高 表达。的Engels等19将TCR的a 阵因通过逆转录病毒转导进人初始T细胞，发现在相同的病毒滴度下，以MPSV为基础载体转导基因在 T淋巴细胞比以MLV为基础的载体有高转染效 率和高TCR表达。MP71载体也是很好的工具，转导TCR基因在T淋巴细胞内产生稳定和高水平的表达。通过比较MP71载体与Mo-MLV载体转导基因在T淋巴细胞的表达，所有的载体都 带有GFP以检测转基因的表达水平，发现MP71载体有高达75倍高GFP的表达，同时Mo-MLV载体最高的MOI值比

10、MP71载体最低的MOI值还要低20。此外一些构建的其他载体例如 pCMMP-IRES-GFP,当TCR基因嵌合体插入载体中，与传统的载体相比，病毒滴度由vs6.43x109 VP/L 上升到 2.15X1011 VP/L,转染效率由 5%-10%上升到 50%-60% 21。3.2转染方法改善通常逆转录病毒转染效率较低是由于是逆转录病毒只能转染正在分裂的细胞22 所获得的逆转录病毒滴度较低 ，逆转录病毒半衰期短,37 C时只有58 h ,而且移动距离有限 在一个半衰期内距靶细胞 480610卩m以上的大多数病毒不能到达靶细胞 23。3.2.1改善病毒颗粒产生条件通过药物作用细胞以改善病毒颗粒

11、产生的条件。通常用丁酸钠和曲古抑菌素A均是去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，前者是人类结肠中细菌发酵碳水化合物产生的一短链脂肪酸；后者是抗真菌药物。二者可抑制 HDAC的活性，导致组蛋白乙酰化程度升高。升高的乙酰化组蛋 白可以增强相关基因的转录。Chris等用曲古抑菌素A和丁酸钠分别处理包装细胞 y2/LIG/NGF24h后，产生的病毒上清 感染NIH3T3细胞，结果发现曲古抑菌素 A与阴性对照相比病毒滴度增加 34倍，而与丁酸钠 相比病毒增加了 3.4倍。24 3.2.2加强病毒与巴细胞之间的相互作用1通过离心及改变温度提高病毒半衰期的方法Kotani等23 在逆转录病毒转导的最佳方法的研究中发

12、现37C的非活化的逆转录病毒载体比32C时要多，32C与37C相比滴度增加5-15倍，34 C位于中间。在逆转录病毒载体转 导的研究中，病毒上清和靶细胞低温离心，转染效率明显增加。Bunn ell等25将逆转录病毒载体转导基因进入人外周血淋巴细胞，通过三种不同的转染方法，发现病毒上清与靶细胞在32C, 1000g离心60min，而后再32C培养12h，转染效率明显升高，PG13包装细胞产生的病 毒转染效率45%80% , PA317包装细胞产生的病毒转染效率20%40%。2增加粘附近年来，很多研究人员通过用polybre ne来增加病毒与靶细胞之间的粘附来提高转染效率，但是结果并不理想。重组人

13、纤维连接蛋白fibronectin的应用，也提高了病毒与靶细胞之间的粘附作用。Morgan等26 用逆转录病毒载体转导 TCR基因进入人初始淋巴细胞，用 25.5ug/ml重组人纤维连接蛋白fibronectin辅助作用，转染效率超过50%。Lamcers和Wille等27 通过用fibronectin片断CH-296与polybrene进行比较，运用相同的载体转导基因到 T淋巴细胞， 前者的转染效率为40%而后者仅为8%，转染效率明显升高。3磷酸盐耗竭法磷酸盐耗竭法也可用于提高转染效率，此方法可以增加RNA的产生。Bunnell等25在转染靶细胞之前，对淋巴细胞进行处理，用不含磷酸盐的164

14、0培养基代替原培养基，在37 C培养312h，然后用病毒感染，这种磷酸盐饥饿方法，基因的转染效率超过25%而正常方法仅为2%。此外，Chuck和Palson等28 则采用流动转染法(Flow through transduction),使病毒上 清以恒定速度流过一半透膜 ，将转染效率提高到90 % ,并且对病毒滴度的要求大大降低 ，也不 必再用polybrene来辅助转染。3.2.3浓缩病毒VSV-G提高转染效率，病毒上清的浓缩也是不可缺少的。减少病毒上清的体积而同时又要 保留病毒的感染力可以通过高速离心的方法，同时还可以避免感染抑制剂的浓缩，-5 -J-Jn 上Lr MLJJ lIB载体可以

15、50000g/90min,病毒滴度高达2000倍，70%左右的回收率。29磷酸钙共沉淀法也可以浓缩病毒上清，MLV的包装糖蛋白，表面单位和跨膜区不是共价结合的，高速的离心极易分离，引起含有MLV包装糖蛋白的MLV逆转录病毒感染力的缺失，Pham等30用60Mm氯化钙，2000g离心，少量的EDTA盐重悬，通过透析除去EDTA，使病毒上清体积由300ml浓缩到10ml，病毒的回收率50-100%，滴度达到1000倍。病毒感染靶细胞静止培养时，大约90%的病毒不能感染靶细胞，为了充分利用病毒进行感染，可以用高密度的粒子低物。病毒上清与低物混合形成复合物，因密度大，在培养基中 沉积，使病毒保持在半衰

16、期内，病毒与低物结合，但仍有感染力，不需特别处理使其释放， 而且对细胞没有毒副作用，使其有足够的时间满足病毒与靶细胞作用。Darling等【31用甲醛固定的金色葡萄球菌 Pansorbin加入PG13包装病毒上清中，离心使病毒浓缩，病毒滴度上升 到7500倍，而因体积减少损失的只有200倍。Pansorbin与病毒的结和使其浓缩，而且忽略其编码的基因。4展望TCR基因转导在肿瘤的免疫治疗，自身免疫性疾病以及病毒感染性疾病的治疗上显示出 很大的前景。逆转录病毒转导TCR基因转染效率的提高，表达水平的提高对以后其在临床上的应用有深远的影响。当然随着逆转录病毒载体技术的成熟和对T淋巴细胞生物学活性的

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