基因芯片实验原理与方法

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1、word基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样 品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进展标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。详细实验方法 基因芯片实验原理与方法实验材料 组织或细胞样本试剂、试剂盒 Oligo-dT (T15) - Roche dNTPs RNasin Superscript II Cot-1 DNA EDTA NaOH Tris仪器、耗材 扫描仪：ScanArray 30

2、00 Cartesian 7500点样仪 硅烷化玻片 PCR仪器 Scan Microarray一、目的本实验的目的是学会cDNA芯片的使用方法。了解各种基因芯片的根本原理和优缺点。基因芯片这一技术方法在1991年的Science杂志上被首次提出，其高通量、并行检测的特点适应了分析人类基因组计划所提供的海量的基因序列信息的需要，可以说，人类基因组计划是基因芯片技术开展的原因，而对深人研究基因突变和基因表达的有效方法的需求又是促进基因芯片技术开展的动力。由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低本钱的特点，基诞生以来就受到科学界的广泛关注，正如晶体管电路向集成电路开展的经历一样，分子生物学技术的集成

3、化正在使生命科学的研究和应用发生一场革命。根据固定在芯片载体上的核酸分子的不同，基因芯片可以分为cDNA芯片和寡核昔酸芯片等。寡核昔酸芯片主要基于光引导聚合技术，该技术是Affymetrix公司开发的专利技术，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。二、原理基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进展标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。基因芯片技术主要包

4、括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反响和信号检测和结果分析。1、芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反响，有时样品的量很小。所以，必须将样品进展提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。3、杂交反响-杂交反响是荧光标记的样品与芯片上的探针进展的反响产生一系列信

5、息的过程。选择适宜的反响条件能使生物分子间反响处于最优状况中，减少生物分子之间的错配率。4、信号检测和结果分析-杂交反响后的芯片上各个反响点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片两大类组成。以下分别介绍这两类芯片的根本原理和特点：寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip)概念：是指做在固相载体上的寡核苷酸微阵列。其制备方法以直接在基片上进展原位合成为主、有时也可以预先合成，再按照制备cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(In situ synthesis)是目前制造高

6、密度寡核苷酸芯片最为成功的方法，有几种不同的工艺，其中最著名的是美国Affymetrix公司(.affymetrix.)的专利技术光引导化学合成法(Light-directed chemical synthesis process)。产品名为GeneChip。Affymetrix公司已公开的光引导化学合成主要过程如下：首先根据杂交目确实定寡核昔酸探针的长度和序列。再由计算机设计出合成寡核苷酸时用到的所有光掩膜(Masks)。最后做探针合成。光导原位合成技术的优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列，探针阵列密度可高达到每平方厘米一百万个。而这种方法的主要缺点：一是需要预先设计、制造一系列掩

7、模，造价较高：二是每步产宰较低因此合成探针的长度受到了限制。此外，原值合成的方法还有Incyte Phamaceuticals5公司(/.incyte.)和Rosetta Biosystem Inc公司等使用的基于喷墨打印原理的原价合成法(IN situ synthesis with reagents delivered by ink-jet printer devices)。喷印装置与普通的彩色喷墨打印机类似，用四种碱基液体取代墨盒中的彩色墨汁，通过计算机控制喷印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等过程与传统的DNA固相原值合成技术一样。喷印法可以合成长度为4050 n

8、t的寡核昔酸链，每步产率可以达到99，合成30nt的寡核昔酸产率可达70以上。日本佳能公司利用其独创的“气泡喷墨技术，仅用24 pl溶液就可以在基片上制作出近百微米的小探针点每平方厘米可排布近20000个探针，克制了喷墨打印技术制备探针阵列密度较小的缺点。寡核昔酸芯片的杂交和检测分析：样品处理和杂交检测方法与cDNA芯片是一致的。由于寡核昔酸阵列多需要区分单碱基突变因此严格控制杂交液盐离子浓度、杂交温度和冲洗时间是杂交实验成败的关键。cDNA芯片cDNA Chip概念：在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上固定的成千上万个cDNA分子组成cD4A微阵列。制作cDNA芯片最常

9、用的固相载体是显微镜载玻片，载玻片在使用前需要进展外表处理，目的是抑制玻璃片外表对核酸分子的非特异性吸附作用。常用的外表处理方法有氨基化法、醛基化法和多聚赖氨酸包被法。cDNA芯片的制备：制备cDNA芯片多用合成后点样法(Spotting after synthesis)，简称点样法。合成后点样法使用的专用设备称为点样仪(Arrayer)，目前有多家国外公司(如Bopdiscovery,Biorobotics,Vartesian Technologies,Genetic Microsystems,Genomicssolutions等)生产点样仪。点样仪的主要部件是由计算机系统控制的电脑机械手。

10、点样时电脑机械手利用点样针头(Pin)从96或384檄孔板上蘸取cDNA样品，按照设计好的位置点在载玻片外表。针头的数目、机械手的移动时间、针头清洗和枯燥时间、样品总数和载破片数目共同决定了点样所需时间；针头的直径和形状、样品溶液的粘滞程度以与固相载体的外表特性决定了芯片上液滴的量和扩散面积。除点样法以外，cDNA芯片也可以用电子定位法(Electronic addressing)制备。美国Nanogen公司(.nanogen.)最早使用这项技术，他们对空白片上的持定位点进展电活化，使相应活化点的外表带有电荷，成为“微电极，能够吸附cDNA分子。带有微电极的片子与样品溶液共同孵育，溶液中的cD

11、NA分子被吸附的微电极上，并与片子外表发生化学结合从而固定。用这种工艺制备的芯片的优点是：微电极的电吸附作用可以提高与靶核酸的杂交效率。缺点是制备复杂本钱较高。这种带有微电极的芯片也称为主动式芯片。许多公司出售商品化的cDNA芯片，可以根据需要从公司定制。美国Incyte公司是显著名的cDNA芯片提供商之，其产名为GEMTM芯片，每X片子上最多可以含有10000点，对样品中mRNA的检出限达到2pg，对两种来源样品中的基因差异表达的检出限为2倍。cDNA芯片的使用方法样品制备和杂交样品制备包括别离和标记两个方面，有些样品还婴经过核酸扩增放大这一步骤。样品制备的一般过程是：提取待检样品中的mRN

12、A，反转录成cDNA，同时标记上荧光(荧光标记为最常用的方法优点是无放射性且有多种颜色可供使用；研究者可以根据需要选用其它标记方法，例如同位素标记法、化学发光法或酶标法；如果目的是研究两种来源的组织细胞基因的差异表达，如此分别提取两种组织细胞的mRNA，反转录成cDNA，分别标记两种不同颜色的荧光(如Cy3和Cy5)，等量混合后与芯片进展杂交反响。杂交反响可以在专用的杂交仪(Hybridization station)或杂交盒(Hybridization chamber)内进展。杂交仪能够容纳多X芯片，有利于杂交过程的自动化和杂交条件的标准化。单个反响可以在杂交盒里进展，斯坦福大学Patric

13、k O.Brown教授领导的实验室将制作杂交盒的详细说明提供在互联网，同时还提供了cDNA芯片设备、样品处理与杂交的完整的实验手册和有关软件的下载，网址是：。杂交信号检测和分析通常检测芯片上的杂交信号需要高灵敏度的检测系统阅读仪(Reader)，阅读仪的成像原理分为激光共焦扫描和CCD成像两种。前者分辨率和灵敏度较高，但是扫描速度较慢且价格昂贵。后者的持点与之相反。十祈一次标准的cDNA芯片杂交实验产生的成干上万个点的杂交信息，需要生物信息学手段的支持。已经有多种读取和分析杂交信号的应用软件以与能够与网络公共数据库连接进展数据分析的应用软件、在NHGRI的问站可以下载用于图像分析的软件，还可以

14、找到能够与Genbank、Unigene等数据库联机工作的软件包。基因芯片根本技术流程图表1 基因芯片的主要类型与其简要特点三、主要器材扫描仪：ScanArray 3000，General Scanning公司图像处理软件：Genepix 3.0， Axon公司；Scan Microarray Analysis System ，GSI Lumonics公司Cartesian 7500点样仪 Cartesian公司硅烷化玻片 TeleChem公司PCR仪器四、试剂组织或细胞样本Oligo-dT (T15) - Roche dNTPs (in buffer 50 mM Tris pH 8) RNa

15、sin - Promega Superscript II - Life Technologies Qiaquick PCR purification system - QIAGEN 22 x 50 mm cover slips Cot-1 DNA - Life Technologies Poly dA - Roche Cy3 and Cy5-dUTP 0.5M EDTA 2M NaOH 1M HCl 1M Tris pH 8 100mM sodium acetate 20x SSC 20% SDS Deionized Formamide MilliQ Water Array chip (5k

16、gene-chip from QIMR) Hybridisation chamber Dnase-, RNase-free 0.5 and 1.5 ml eppendorf tubes Plastic slide holders 2 litre beakers 五、操作一总RNA制备1、组织(或细胞)碾磨粉碎11、将超低温保存的组织(或细胞)材料迅速转移至盛有液氮的碾钵中，用杵子不断碾磨至粉状。12、称取1.5g粉状样品，放入盛有液氮的碾钵中,并参加50ml溶液D，用杵子不断碾磨至细粉状。2、组织匀浆2.1、将碾好的细粉末倒入匀浆管中,在组织匀浆粉碎机上匀浆。2.2、将匀浆液分装在离心管中，冰浴20min。 11000g离心5min，将上清转移入另一离心管。3、别离和沉淀3.1、分别参加1/10体积3mol/l NaAcpH4.5和等体积5:1酸性酚氯仿溶液，冰浴20min 4，11000*g，20min离心。6 / 6