植物DNA和RNA提取方法

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1、word实验一植物基因组DNA的提取一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和根本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需参加抗氧化剂或强复原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl

2、sulfate，简称SDS)等离子型外表活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再参加苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大局部蛋白质。上清液中参加无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯

3、基乙醇400ul氯仿-异戊醇24：1：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1. DNA的提取12%CTAB抽提缓冲液在65水浴中预热。2取少量叶片约1g置于研钵中，用液氮磨至粉状；3参加700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；4将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；5置于65的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；6冷却2 min后，参加氯仿-异戊醇24：1至满管，剧烈振荡23 min，使两者混合均匀；7放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 l的异丙醇参加另一新的灭菌离心管中

4、；8 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；910000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；1060 sec后，直立离心管，参加720 l的75%乙醇与80 l 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；11放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；1210000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再参加800 l 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；131000

5、0 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，枯燥DNA自然风干或用风筒吹干；14参加50 l 0.5 TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37恒温箱约15 h，使RNA消解；15置于-20保存、备用。2. DNA质量检测琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、须知事项1叶片磨得越细越好。2移液器的使用。3由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中参加EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙

6、醇, 75%乙醇, EDTA2提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？实验二多聚酶链式反响( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的通过本实验学习PCR反响的根本原理，掌握PCR的根本操作技术以与琼脂糖凝胶电泳技术。二、实验原理PCR用于扩增位于两端序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进展的重复双向DNA合成。根本原理与过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：1模板变性；2引物退火；3热稳定DNA聚合酶进展DNA合成。1变性：加热使模板DNA在高温下94-95变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2退火

7、：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原如此互补结合，使引物与模板链3端结合，形成局部双链DNA，即退火阶段。3 延伸：体系反响温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反响混合物中的4种脱氧核苷三磷酸dNTP，按5到3方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反响体系由如下组分组成：DNA模板、反响缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成

8、的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小与构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法别离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭EB为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧

9、光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。三、实验材料与相关试剂基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验步骤1模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。2PCR操作 (在冰上操作)：1PCR反响混合液的配制：反响体系25 L, 在无菌的0.2 mL离心管中按如下操作程序加样：反响物加样顺序体积/L终浓度ddH2O1n10 x Buffer 2n1 x25 mmol/L MgCl23n1.5 mmol/L10 mmol/L dNTP4n200 mol/L10 M上游引物51n0.4 mol/L10 M下游引物61n0.4 mol/L DNA

10、Taq聚合酶7n1 U2将反响混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 L反响混合液，再加1 L模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。3将PCR管放到PCR热循环仪中，按如下程序开始循环：94 4 min (预变性) 94 30 sec, 60 30 sec, 72 2 min 72 7 min35个循环4须知事项由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反响混合物受痕量DNA的污染。a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c. 每加一种反响物，应换新的枪头。3PCR产物的检测：琼脂糖浓度1

11、.2%；EB浓度5 l / 100 ml TBE1制胶以150 mL为例 a. 称取1.8 g琼脂糖，参加150 ml 的TBE缓冲液，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。 b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量; c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖约50，倒入其中，直至厚度为46 mm如有气泡要把气泡赶出，在室温下冷却凝固(约30 45 min)； d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。2点样 a. 将2.0 l 溴酚蓝参加到PCR产物中，然后稍微离心； b. 每孔点样10.0 l，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。

12、3电泳打开电源开关，调节电压至35 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。4染色将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。5观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有分子量的标准DNA进展电泳，如此可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。6须知事项a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否如此易溢出。 b. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。c. 倒胶注意厚度4-6 mm，充分凝固后再拔

13、出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题：1 PCR反响液中主要成分是哪些？在PCR反响过程中各起什么作用？2 为什么在PCR反响过程中，使用三个不同的温度变化？3 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？实验三植物总RNA的提取一、实验目的通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法二、实验原理 RNA是

14、一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中源性与外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸别离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。三、仪器、药品与试剂配方(一) 仪器1 低温离心机2 分光光度计3 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。4 高压灭菌锅5 研钵、剪刀、一次性手套等(二) 药品1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)2. 吗啉代丙烷磺酸(MO

15、PS)3. 异硫氰酸胍4. 醋酸钠(NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙二胺四乙酸(EDTA)10. 琼脂糖11. 异丙醇(三) 试剂配方1 0.1% DEPC水0.1 ml DEPC 参加100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水配制。3. 5MOPS 电泳缓冲液(pH 7.0)MOPS 0.1 mol/LNaAc 40 mmol/LEDTA 5 mmol/L四、实验步骤（一） 总RNA的提取方案一1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4

16、叶期，剪取1.2 g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10 mL离心管。参加4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL苯酚 3 mL 2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL 氯仿 0.6 mL混匀，冰浴放置30 min。 2. 4，8000 r/min，离心13 min。 3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。 4. 参加2倍体积无水乙醇，-70，0.5 h。 5. 4，8000 r/min，离心13 min。 6. 弃上清，在沉淀中参加1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解。 7. 移入1.5 mL离心管中，冰浴2 h。 8. 4，13000 r/min，离心1

17、5 min。 9. 弃上清，在沉淀中参加400 uL DEPC水，再参加400 uL氯仿，混匀。 10. 4，13000 r/min，离心6 min。 11. 取上清,并参加1/10体积3 mol/L NaAc，2倍体积无水乙醇，-20放置30 min。 12. 4，13000 r/min，离心20 min。 13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。 14. 将沉淀RNA室温下稍枯燥。15. 加30 uL DEPC水溶解，-70保存。（二） 总RNA的提取方案二利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：1. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管；2. 参

18、加1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；3. 室温放置5 min后，参加0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min；4. 在8条件下，12000 rpm离心15 min；5. 溶液分为两层，下层为酚氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，参加0.5 ml异丙醇在1530条件下，沉淀10 min；6. 然后在, 28条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部；7. 去掉液体局部，参加1 ml 75%酒精洗2次；8. 风干后，参加25 l DEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80冰箱备用。三甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA 1配制1.2%变性琼脂糖凝胶(40 mL)

19、称取0.48 g,参加DEPC水25.2 mL,5X电泳缓冲液4 mL, 加热使溶解，稍冷却参加甲醛3.4 mL, 混匀，室温凝固0.5-1 h.2. RNA电泳检测样品制备 RNA2 l甲醛2.5 l甲酰胺7.5 l10MOPS2 lRNA Loading Buffer2 l灭菌的DEPC 水4 l混合液轻轻混匀并离心，放于65下温育 5 min后，置于冰上。3. 电泳检测将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm条件下电泳30 min，然后在EB中染色15-20 min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量

20、。五、须知事项1在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。2RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。思考题：1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么?焦碳酸二乙酯(DEPC), 吗啉代丙烷磺酸(MOPS), 异硫氰酸胍, 醋酸钠(NaAc), 氯仿, 苯酚, 甲醛, 乙醇, 乙二胺四乙酸(EDTA), 异丙醇动植物组织mRNA提取实验方法一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。 二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空枯燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂 1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻

21、璃瓶180 2小时装蒸馏水，然后参加0.01%的DEPC体积/体积，处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，用高温灭菌器皿配制，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、1层析柱加样缓冲液；20mmol/L TrisCl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。4、洗脱缓冲液：10mmol/L TrisCl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。四、操作步骤 一动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，

22、样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+别离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织参加1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液参加0.2ml的比例参加氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例参加异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。 4、弃去上

23、清液，按每ml Trizol液参加至少1ml的比例参加75%乙醇，涡旋混匀，4下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真空枯燥5-10分钟，注意不要枯燥过分，否如此会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进展mRNA别离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意 1、整个操作要带口罩与一次性手套，并尽可能在低温下操作。 2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。二mRNA提取 oligo(dT)纤维素。 2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的

24、玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、将一中提取的RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温，参加等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，参加1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，参加2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。 7、参加1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀，

25、 -2030分钟。 8、4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4下12000g离心5分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气枯燥10分钟，或真空枯燥10分钟。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成或保存在70%乙醇中并贮存于-70。 注意 1、mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。 2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并参加0.02%叠氮钠NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。RNA提取流程RNAtotal RNA和信使RNA(mRNA)的抽提R

26、NA的提取 RNA和无RNA酶的环境原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA, 信使RNA(mRNA),核糖体RNA (rRNA),转运RNA(tRNA).而真核生物如此能产生四种,还有一种为真核生物所持有的小RNA.mRNA是由基因转录而来的,它运送编码蛋白所需的信息. 由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的别离,定量和检测极为重要. 应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进展研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中.由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA,因此,RNA的别离通常是决定实验结果质量的第一步,也是关键的一步.提取RNA 过程中防止

27、RNA酶的污染所采取的步骤RNA别离的实用方法既有简单直接的方法(如别离rRNA和tRNA),也有困难和涉与复杂步骤的方法(如别离mRNA).在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量,或用于RNA的生化研究,处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.方案:工作区域应与进展普通微生物实验的区域别离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那

28、些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进展DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.如有可能,使用标有无RNA酶的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶,3)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进展处理:每100mL溶液或水中参加0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.5)别离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理. 从组织中

29、提取RNA如此要注意:动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿组织器官的冲洗液人汗含有RNA酶,故在所有步骤中均应戴手套并经常更换. 一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.别离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA(18s和28s) 条带模糊可能明确由RNA酶引起的RNA的降解.一步法别离RNA应用从组织或细胞中别离细胞的总RNA 从液体样品中别离RNA TRI REAGENT (Tripure) 是一种用于RNA 别离的商品溶液.该法源于

30、chomc- zynski 的RNA别离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样品,我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时别离RNA, DNA,蛋白质. 方案 .用l mL Tripure/50-100mg (组织)匀浆组织样品.对于细胞,每10cm2面积(贴壁的单层细胞)或每106个细胞(细胞沉淀)使用1mL.将样品转至1.5mLEP管中.(-70 可保存1月)室温下放置样品5min.每1mL Tripure中参加0.2mL氯仿并摇动15s,置于室温下 215min.4 下12000g离心15min.将水相(上部)转至一个新EP管.每1mL Tripure参加0.5m

31、L异丙醇沉淀RNA.将样品置于室温下510min.4 ,12000g离心10min.凝胶样沉淀物为RNA.吸出上清并用1mL 75%乙醇在涡旋振荡器上洗涤RNA沉淀一次, 4 , 7500g 离心5min.晾干RNA沉淀.然后用无RNA酶的水,甲酰胺或0.5X 的 SDS溶液溶解沉淀. RNA的检测:将样品稀释液于三处波长处读取OD值.记录OD值,通过计算确定RNA浓度或纯度.公式如下对于ssDNA:ssDNA=33(OD260一OD310) 稀释倍数对于dsDNA:dsDNA=50(OD260OD 310) 稀释倍数对于ssRNA:ssRNA=40(OD260一OD310)稀释倍数以上浓度单

32、位为ug/mL.须知事项1)OD310值是背景,假如盐浓度较高,OD310值也高.2)OD260/OD280 对DNA而言其值大约为1.8,高于1.8有RNA污染.低于1.8如此有蛋白质污染.3)OD260/OD280.对RNA而言其值大约为2.0.小结所有可能与RNA接触的器材均得用DEPC处理.操作过程中应带口罩,手套.DEPC有致癌之可能,尽量防止接触皮肤提取的RNA应尽早逆转录成 cDNA.逆转录聚合酶链式反响(RTPCR)RTPCR间接用来扩增从RNA分子今得到的一段特异序列.RNA首先被逆转录为cDNA.用位于一段特异序列或者一个基因两侧的引物生成以cDNA为摸板的PCR产物成为一

33、个标准的PCR反响.得到阳性产物说明存在着特异的RNA序列. 对于个成功的PCR反响来说,寡聚核苷酸引物是最重要的组分.引物的长度围通常在18至25个核苷酸之间.用常规条件扩增的PCR产物的长度围为100一1000bp.为了扩增从mRNA逆转录得到的cDNA,引物中应含有一段目的基因的含子区,以便从带有基因组DNA的PCR产物中区分出cDNA的PCR产物. 许多计算机程序,诸如Primer Primer5.0,使得最适引物的选择十分便利.评判标准包括GC含量,解链温度,引物引物二聚体和特异性. 应用1. 利用有限的总RNA量测定一段持异的RNA信息;2. 进展PCR克隆.逆转录1) 用分光光度

34、计测定A260以确定RNA浓度. 2)RT反响混合物包括以下组分(20ul):0.5至 l ug RNA .1.25mmol/L dNTPs(dATP,dTTP, dCTP, dGTP).1.6 ug的随机六聚物(pdN 6).2uL 10xRT buffer200 u 逆转录酶加DEPC处理过的双蒸水至总体积为20ul,于37反响lh.然后于94度加热5min以终止反响.PCR扩增将以下组分混合(50ul)以进展PCR扩增:a.从上面反响中逆转录得到的10ul cDNA.b.1U的Taq聚合酶.c. 引物(0.2umol/L).d.5ul 10PCR缓冲液(o.5mmol/L MgCl2,

35、50mmol/L KCl, 10mmol/L TrisHCl,0.001%明胶)e.加双蒸水使总体积为50ul.f. 编程,开始PCR 一步法RTPCR 优点:一步法RT-PCR排除了在将cDNA转至PCR反响混合体系过程中可能出现的污染和吸量的变化.防止了在逆转录反响完毕阶段的变性过程中可能发生的cDNA蒸发. 缺点:对于新手来说,一次不成功须从第一步重新开始.方案0.1-1ug 总RNA 200一500 umol/L的dNTP(每种)2 umol/L随机六聚物pd(N)200 U AMV逆转录酶1Taq聚合酶缓冲液1 mmo1/L DTT1.5U Taq聚台酶0.5umol/L的引物(每种)终体积为50ul.小结:半定量时必需设计参照.参的长度与目的片段相差100bp以上,否如此电泳时不能很好分开参的退火温度应与目的片段相当,最好控制在1-2 左右,且退火温度不要太高.有时参与目的基因引物之间可以形成二聚体,导致条带暗,可以分开PCR, 然后加在一起电泳.进展基因克隆时应在引物上加酶切位点,尽量选用常用酶,如BamH I,EcoR I, Hind III 等便于连接到表达载体上.产量低时可通过增加模版量,增加循环数量来解决.10 / 10