甘薯中薯蓣皂甙元的提取工艺研究硕士学位论文

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1、中图分类号：TS215密级：保密UDC：633.4学校代码：10082硕士学位论文甘薯中薯蓣皂甙元的提取工艺研究Hebei University of Science and TechnologyDissertation for the Master DegreeStudy on Extraction of Diosgenin from theSweet PotatoClassified Index：TS215Secrecy Rate：ConfidentialUDC：633.4University Code：10082Candidate：Li XiaoqianSupervisor：Prof.

2、Mou DehuaAssociate Supervisor：AcademicDegreeAppplied for：Master of EngineeringSpeciality：Food ScienceEmployer：College of Bioscience and BioengineeringDateofOralExamination:May, 2012学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确

3、方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日河北科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体

4、，均已在文中以明确方式标明。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 年 月 日 -河北科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于 不保密。（请在以上方框内打“

5、”）学位论文作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 年 月 日摘 要摘 要我国是世界上最大的甘薯生产国，相对于其他水果甘薯具有低脂、低热量和高纤维等优点，除了含有大量淀粉以外，还含有胡萝卜素、VB1、B2和VC，以及钙、钾、硒、铁等元素。近几年研究发现，甘薯中含有脱氢表雄酮，即DHEA，该物质具有多种保健功能，是循环系统中最为丰富的甾体激素之一，而据报道在植物体内DHEA以其前体物质薯蓣皂甙元的形式存在，而薯蓣皂甙元作为一种重要的甾体中间体广泛的应用于医药工业生产。本课题主要针对河北省农科院甘薯组选育的新品种，进行甘薯中薯蓣皂甙元的提取工业研究；对检测方法进行对比优化；并对甘薯膨大期到成熟期薯

6、蓣皂甙元在甘薯根、茎和叶中的含量进行了检测。为河北省新品种甘薯的推广种植和综合加工利用提供依据，并带动河北产业经济。本课题研究了分光光度法检测甘薯中薯蓣皂甙元的条件极其稳定性研究，通过对比三种显色剂，最终确定5%香草醛冰醋酸溶液+高氯酸溶液作为显色剂效果最佳，显色稳定条件为加入0.2 mL高氯酸，在80下水浴20 min，静置30 min。最终测得的薯蓣皂甙元特征吸收波长在540 nm。本课题考察了膨大期甘薯中基础物质和薯蓣皂甙元的变化关系及相关性。通过试验可知，在膨大期随着淀粉含量逐渐增加，薯蓣皂甙元含量的增加趋势也越明显。块根中的薯蓣皂甙元含量随着生长周期的延长呈现明显的增加趋势，而薯皮中

7、的薯蓣皂甙元在前期增长趋势明显，后期含量增加不明显，并且薯块中的薯蓣皂甙元含量明显高于薯皮。本课题采用了索氏提取法和超声波辅助方法对薯蓣皂甙元进行提取。两种方法比较而言，超声波辅助提取方法，具有提取率高，提取时间短，操作简单等优点，第三次提取率能达到97.54%。通过单因素和正交试验获得了超声波辅助提取的最优条件：酸浓度1 mol/L、酸解温度100、酸解时间3 h、pH值为5、溶剂提取时间1 h。最佳提取条件下的二次提取率达到了92.80%。硅胶纯化甘薯中薯蓣皂甙元的粗提液最佳的洗脱溶剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1，纯化后的样品纯化度能达到82.56%。RP-HPLC法定性定量检测纯化后的薯蓣

8、皂甙元，并确定了最佳检测条件，流动相：乙腈：甲醇：水=8：1：1；流速：0.7 mL/min；进样量：20 L；检测波长：210 nm，检出时间为：15 min左右。关键词 甘薯；薯蓣皂甙元；分光光度法；提取；纯化 IAbstractAbstractChina is the worlds largest producer of sweet potato, relative to other fruits, sweet potato have the advantages of low fat, low heat and high fiber, besides contains a lot of

9、 starch, but also contains beta-carotene, VB1, B2 and VC, and calcium, potassium, selenium, iron and other elements. Study found that in recent years, sweet potato contains DHEA, namely DHEA, the material has a variety of health care function, is the most abundant in the circulation system of one of

10、 steroid hormones, and DHEA in plant body with its precursor diosgenin form existence,as a kind of important intermediates steroid widely used and the pharmaceutical industry production.This subject mainly aimed at the academy in hebei province of sweet potato varieties of breeding, sweet potato in

11、the extraction of diosgenin industrial research; Compared to test method and optimization; And detect the diosgenin of sweet potato at swollen to maturity in each organ levels.For new varieties of sweet potato in hebei province cultivated and comprehensive processing using provides the basis, and dr

12、ive the hebei industry economy.This topic research the spectrophotometry detection conditions and stability study of diosgenin, through comparing three show color agent, and finally determined that 5% vanillin glacial acetic acid solution-high chlorine acid solution as colour-display reagent, show c

13、olor stability conditions for join 0.2 mL high chlorine acid, in 80 water under 20 min, and let rest for 30 min. Finally the measurement of diosgenin features absorption wavelength in the 540 nm.This subject research sweet potato based and diosgenin at the swollen change relations and correlation. S

14、tarch content increase obviously, diosgenin the increase of the content of the more obvious trend. diosgenin content of root with the extension of the growth cycle is obviously increased, and diosgenin of potato skins only expands the period in the beginning and end of the growth trend obvious, and

15、diosgenin of root was obviously higher than potato skins.This topic research the soxhlet method and utrasonic-assisted extraction method. Two methods in comparison, utrasonic-assisted extraction method, have higher extraction yield, extracting time short, simple operation etc, the third time extract

16、ion yield is 97.54%. By single factor and orthogonal test won the ultrasonic extraction auxiliary the optimal conditions: acid concentration 1 mol/L, acid solution temperature of 100, acid solution time 3 h, pH value for 5,solvent extraction time 1 h. Best extraction conditions of secondary extracti

17、on yield to 92.80%.Silica gel purification diosgenin coarse extraction solvent the best elution liquid for petroleum ether:ethyl acetate= 1:1, purification of sample purification and could reach 93.14%. RP-HPLC method to detect the sweet potato diosgenin best detection conditions for: mobile phase:

18、acetonitrile: methanol: water=8:1:1; Flow rate: 0.7 mL/min; Into the sample weight: 20 L; Detected wavelength: 210 nm, detection for time:15 min.Key words Sweet potato；Diosgenin；Spectrophotometry；Extracted；PurificationIII目 录目 录摘 要IAbstractII第1章 绪 论11.1 甘薯简介11.2 甘薯主要营养成分简介11.3 薯蓣皂甙元的简介21.4 薯蓣皂甙元研究现状3

19、1.4.1 薯蓣皂甙元的功能特性31.4.2薯蓣皂甙元的提取现状41.4.3薯蓣皂甙元的纯化和检测方法的研究进展61.5 课题主要研究的内容、意义及创新点81.5.1 课题研究的内容和意义81.5.2 课题的创新点9第2章 甘薯中薯蓣皂甙元分光光度检测法102.1 试验材料与设备102.1.1 试验材料与试剂102.1.2 试验设备102.2 试验内容与方法112.2.1 分光光度法检测甘薯中薯蓣皂甙元方法的确定112.2.2 薯蓣皂甙元标准曲线的绘制112.3 试验结果及分析112.3.1 不同显色方法对甘薯薯蓣皂甙元检测影响的试验结果112.3.2 香草醛冰醋酸-高氯酸显色法稳定性试验结果

20、122.3.3 香草醛冰醋酸-高氯酸作为显色剂的分光光度检测结果142.4 本章小结15第3章 甘薯中薯蓣皂甙元在膨大期变化研究163.1 试验材料与设备163.1.1 试验材料与试剂163.1.2 试验所用仪器设备173.2 试验内容及方法173.2.1 取样173.2.2 样品前处理183.2.3 甘薯各器官中薯蓣皂甙元的提取和检测183.2.4 甘薯基础成分的检测183.3 试验结果与分析213.3.1 薯蓣皂甙元HPLC检测标准曲线的绘制213.3.2 甘薯中薯蓣皂甙元在膨大期含量变化规律213.4 本章小结25第4章 甘薯中薯蓣皂甙元提取、纯化工艺研究264.1 试验材料与设备264

21、.1.1 试验材料与试剂264.1.2试验设备264.2 试验内容与方法274.2.1 原料的预处理274.2.2 23个不同品种甘薯中基础成分和薯蓣皂甙元含量的测定274.2.3 甘薯中薯蓣皂甙元索氏提取法274.2.4 超声波辅助提取甘薯中的薯蓣皂甙元284.2.5 单因素试验294.2.6正交试验294.2.7薯蓣皂甙元的纯化研究304.2.8RP-HPLC检测甘薯中薯蓣皂甙元314.3 试验结果及分析314.3.1 甘薯中基础物质和总薯蓣皂甙元含量的检测314.3.2 索氏提取与超声波辅助提取法提取率比较344.3.3甘薯中薯蓣皂甙元超声波辅助提取工艺优化结果344.3.4甘薯中薯蓣皂

22、甙元的纯化结果394.4 本章小结41结 论43参考文献45攻读硕士学位期间所发表的论文50致 谢51V第1章 绪 论第1章 绪 论1.1 甘薯简介甘薯是旋花科草本植物，又名白薯、红薯、山药和地瓜等，原产于美洲中部和南美洲西北部的热带地区，16世纪末传入我国，具有适应性广、高繁殖、易栽培、高产量、高营养和用途广等特点1，2。在我国甘薯的年产量约为1亿吨以上，是世界上最大的甘薯生产国，占全世界的80%，是仅次于小麦、大米和玉米后的重要农作物之一3。据统计，我国甘薯作为动物饲料的为50%，用于工业加工成产品的占15 %，食用占14%，用作种薯占6%，因保藏不当而霉烂掉占15% 4。甘薯相对于其他水

23、果具有低脂、低热量和高纤维等优点，除了含有大量淀粉以外，还含有胡萝卜素、VB1、B2和VC，以及钙、钾、硒、铁等元素。美国费城大学研究发现，甘薯中含有脱氢表雄酮，即DHEA，该物质具有多种保健功能，是循环系统中最为丰富的甾体激素之一5。另外，由于甘薯呈碱性，因此能够有效维持人体血液的酸碱平衡，曾被世界卫生组织(WHO)评选为“十大最佳蔬菜”的冠军，更被营养学家称为“营养最均衡的保健食品之一”6。根据目前市场对甘薯不同品种的需求，全国各地把培育优质专用多样化甘薯最为目标。目前我国的甘薯主要包括淀粉型、食用型、菜用型、无糖型、高胡萝卜素和高花青素型等7。近年来，通过国内外对甘薯的成分不断进行深入的

24、研究发现其所富含的多种营养和生物活性物质，不但具有一定的保健功能，并且还有很高的药用价值。这些的营养和活性物质，能有效解决各国普遍存在的营养和食品安全等问题8。1.2 甘薯主要营养成分简介甘薯中的营养成分比较丰富，徐州甘薯研究中心通过对790份甘薯块根的分析，粗淀粉含量37.6%77.8%，粗蛋白2.24%12.21%，可溶性糖1.68%36.02%，以上均以干物质计算，而每100 g鲜薯胡萝卜素含量最高者达20.81 mg9。甘薯茎叶的营养也比价丰富，粗蛋白质含量与猪、牛肉相当。粗纤维含量11.4%，总糖含量20%25%，VB1、VB2、VB6、VC等含量超过一般叶类蔬菜10。甘薯中的主要功

25、能性营养成分包括膳食纤维、多糖、糖蛋白、多酚类物质、DHEA等。可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维是膳食纤维的主要组成成分，被营养学家称为“人体第七类营养素”。可溶性膳食纤维占甘薯渣约2.66%，不溶性的占26.63%11，调查发现不溶性的膳食纤维能够维持机体健康，在降血脂和预防心脑血管疾病和便秘等方面具有重要作用。曹媛媛等12通过筛分法从甘薯渣中提取出的膳食纤维达到81.25%。而利用我国甘薯渣资源进行膳食纤维产品的开发具有广阔的应用前景。多糖是一种单糖聚合度大于10 的高分子化合物，而植物中的多糖是由许多相同或不同的单糖以-或-糖苷键组成的化合物13。多糖是甘薯主要能量的来源也是其主要成分之一

26、，甘薯多糖的活性近些年也逐渐被研究学者所重视，包括其抗肿瘤、抗突变、增强免疫力等功能14。目前对甘薯多糖的提取和纯化研究较多，付宏媛15等利用酶结合热水提取甘薯中的多糖，使提取率达到5.55%。林茹16 等人采用超声波辅助法提取甘薯多糖，得到最佳料也比、提取温度和提取时间分别为1:6、70和45 min，3次提取后的最高提取率达到23.68%。糖蛋白顾名思义，由多糖和蛋白质共同组成的一种复合产物，作为甘薯中的一种功能性成分，它对呼吸道、消化道、浆膜腔和关节腔具有一定的的润滑作用，保护心血管和肾脏器官结缔组织，从而防止动脉硬化、肾脏萎缩并减缓人体器官的老化速度17。关于甘薯中糖蛋白的相关提取和纯

27、化研究，国内外近几年都进行的比较深入。刘主18等通过水提、醇沉，用Sevage法去除蛋白，提取出的甘薯粗多糖经过DEAE-52纤维柱洗脱纯化等步骤后获得甘薯糖蛋白纯品。程何伟19等采用无机陶瓷膜超滤设备得出甘薯生产淀粉废水中糖蛋白的最佳提取工艺下的提取率为73%。Shuichi Kusano20等采用水提醇沉法，经过TCA透析、柱层析和超滤的处理，在甘薯中获得了一种新的酸性糖蛋白。甘薯酚酸、花色苷和类黄酮是甘薯中酚类化合物的主要三类组成成分。紫甘薯中含有丰富的花色苷，长期食用紫甘薯具有润肺、养颜益气补血、降血压等功效。经过研究表明，紫甘薯还具有抗突变、预防高血压和抗氧化等作用21，22。黄酮类

28、化合物同样具有清除体内自由基抗氧化、防癌的作用2325。研究表明薯皮的抗氧化性高于块根，清除率随着抗氧化剂浓度的降低而上升，抗氧化剂浓度与清除率之间呈线性关系并为反比。脱氢表雄甾酮(dehydmepiandrostemne，DHEA)，是在人体肾上腺网状区皮层中大量合成的类固醇激素，是雄激素和雌激素的中间产物。国外近些年对其生理和病理作用进行了大量研究，包括抗衰老、抗肥胖26，27、糖尿病、抗癌、肿瘤2830等， 研究进展显著。工业上通过合成的方法来生产的DHEA与天然的DHEA结构和性质很难保证完全一样，因此在天然植物中提取DHEA逐渐被人们所重视。姚菊英等31通过预发酵和酸水解的方法从甘薯

29、的废渣中提取出了DHEA。杨红花32等利用超声波辅助法，对脱氢表雄酮的提纯工艺进行了研究，获得了最佳的提取条件，并通过液相检测得到纯度较高的DHEA。1.3 薯蓣皂甙元的简介薯蓣皂甙元(diosgenin)又称皂素，为淡黄色、白色结晶状粉末物质，化学名称为5-异螺旋甾烯-3-醇，分子式为C27H42O3，相对分子质量(以下简称分子量)为414.61，熔点为204207，25D为-129(C=1.4，氯仿)33，可溶于丙酮、三氯甲烷、石油醚等有机溶剂。植物体内的薯蓣皂甙元是以薯蓣皂甙配基的形式存在的，即糖链通过糖苷键（包括D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖）与薯蓣皂甙元相

30、连接34如图1-1，其结构特征是甾核上有单个双键5和具有3-OH，与C25相连的C27-甲基为定向，即C25为R构型，双键和-OH的存在决定了其化学反应特性和应用价值。图1-1 薯蓣皂甙与薯蓣皂甙元分子结构式薯蓣皂甙元在医药工业生产中是一种重要的甾体中间体35，36。它以薯蓣皂甙的形式广泛存在于薯蓣属、鞘姜属和葫芦巴属植物中。其中盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元的含量最高，其次为黄山药和穿山龙等37。近些年研究发现，甘薯中含有DHEA，而薯蓣皂甙元作为其前体物质也备受关注32。1.4 薯蓣皂甙元研究现状1.4.1 薯蓣皂甙元的功能特性近些年来，薯蓣皂甙元抗肿瘤作用被国内外学者所重视并进行研究3840。由于

31、饮食和生活习惯的不同，癌症，如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等疾病在西方国家比较常见，而薯蓣皂甙元对这些疾病都有一定的抵抗作用41。薯蓣皂甙元能抑制多种肿瘤细胞的侵入和繁殖以达到抗肿瘤的目的。Wang Zhao42等报道薯蓣皂甙元能有效遏制HL60的生长，进而防止白血病的病变。Li43等研究发现薯蓣皂甙元浓度大于40 mol/L时对MCF-7乳腺癌细胞有明显的抑制作用并呈正相关，而大于100 mol/L变化不明显。Yen44等研究了8种植物薯蓣皂甙元天然产物对骨肉瘤细胞的活性的抑制效果，得出C5、C6位的双键、糖元的异构和C5、C25是起作用的重要因素。此外，薯蓣皂甙元在降低血糖方面效果也比较明显。

32、通过小鼠实验，McAnuff45等证明薯蓣皂甙元可以有效提高链唑霉素，从而降低患糖尿病小鼠的血糖。薯蓣皂甙元还具有维持胆固醇正常水平和延缓衰老的功效4648。盾叶薯蓣中的水溶性皂甙能提高冠脉血流量和改善末梢循环，进而防止心肌缺血，还能使总胆固醇、甘油酸三脂胆固醇含量降低，使高密度脂蛋白-胆固醇水平升高，不仅对对脂质代谢紊乱有一定的调节作用，并能有效防止动脉粥样硬化，同时研究发现发现其对抗血栓有一定的效果49。1.4.2 薯蓣皂甙元的提取现状1.4.2.1 水解工艺的研究薯蓣皂甙元的生产工艺主要是将原料水解，脱掉糖分子链，提取薯蓣皂甙元粗品后进行重结晶，由于糖苷键的断裂是提取过程中的工艺难点，所

33、以水解工艺的优化是非常必要的。袁丽红50等研究了盾叶薯蓣中水解原位提取薯蓣皂甙元的方法，实验采用响应面中心组合设计优化了影响薯蓣皂甙元提取主要因素。结果显示优化后的最佳条件为：取1.50 g盾叶薯蓣块茎干粉，加入25 mL、1.25 mol/L硫酸-70%异丙醇溶液，然后水解7.5 h，最终薯蓣皂甙元产率达到0.7034%。此法比传统提取方法产率提高68%。于武江和俞斌51通过二次酸水解法从黄姜中提取了薯蓣皂甙元，通过正交试验经过二次水解来提取薯蓣皂甙元，结果表明该方法提取的薯蓣皂甙元提取率达到了2.41%，比传统方法提高了9.55%。李敏52等采用正交试验优化了从穿山龙中提取薯蓣皂甙元的工艺

34、条件，结果显示使用H2SO4溶液作为介质水解穿山龙根茎能得到较高的产率，但硫酸的质量分数要大于10%，否则不能有效破坏根茎中的纤维素，以致不能使包裹在纤维素中的薯蓣皂甙元充分分离出来；硫酸的浓度也不能太高，否则会破坏薯蓣皂甙元的结构，使产率降低，最佳条件为酸的质量分数为15%，回流时间为18 h。1.4.2.2 发酵法和酶解法的研究 Linli Qiu53等研究了预发酵条件对盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元提取率的影响，最终确定发酵条件为：温度30、发酵3天、100 g原材料中加入0.8 g的酵母。作者分析预发酵之所以能提高薯蓣皂甙元的产量，主要归因于盾叶薯蓣中的糖苷酶促进甾体皂甙发生酶解作用，从而提高薯

35、蓣皂甙元的积累；而较长的发酵时间会使甾体皂甙水解成菝葜皂甙元酮和表菝葜皂甙元酮。乔振杰54等分别通过单因素试验和正交试验确定了影响盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元提取的主次因素，并通过预发酵提高了产率，优化的工艺条件为原料粒径1 mm，预发酵温度为40，发酵24 h，3 mol/L盐酸水解4 h。常用来提取薯蓣皂甙元的植物，大部分都含有较多的淀粉和纤维素，它们将薯蓣皂甙元紧紧地包裹在细胞当中，很难提取出来。在水解前对原材料进行酶解是一种提高提取率的有效手段。张黎明55等研究了酶解结合水浸提法从脱脂胡芦巴种子中提取薯蓣皂苷元的工艺。以薯蓣皂苷元的提取率为指标，优化了该法制备薯蓣皂苷元的工艺条件，得到以下结论

36、：酶解法比水浸提法更有利于提高皂甙元的提取率；确定料液比为1:14，纤维素酶(每克原料10 U，pH值4.6，45)酶解6 h为最佳工艺条件。在此基础上考察了酶解结合水浸提法对皂苷元提取率的影响，发现酶解后升温至90100，保温水浸提70 min，可使薯蓣皂苷元的提取率由83.8%提高到92.9%。Yuqing Zhang56等使用聚乙二醇将纤维素酶进行改性来提高其热稳定性和盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元的提取率。原材料分别使用改性的纤维素酶、淀粉酶和糖苷酶进行水解，结果显示，使用改性的纤维素酶由于自然状态下的纤维素酶，最佳的pH值和温度范围也有所增加，薯蓣皂甙元的纯度达到96%，产率和提取率分别达到2

37、.80%和96.6%。1.4.2.3 超声波法 近年来超声波以其高效，、节能等特点在植物功能成分提取的领域得到了广泛的应用。超声波产生的空化作用能够破坏植物细胞壁，从而使目标物质快速充分的溶解到提取溶剂当中。韩枫57等以黄姜为原料，采用相应面设计，对超声波提取薯蓣皂甙元的影响因素进行了优化，最终确定磨浆时间5 min，超声提取时间48 min，料液比1:18(g/mL)，薯蓣皂甙元回收率达到3.19%，该方法与传统方法相比提取率增加了19%。陈圆华58等采用超声波对黄姜中的薯蓣皂甙元进行提取优化。其操作流程为称取黄姜粉末100 mg，加入1.0 mol/L浓硫酸水解4 h，然后用去离子水冲洗残

38、渣至中性后抽滤，滤渣干燥，加入100 mL氯仿在超声波中提取30 min，之后用Liebemann-Barcharad试剂进行显色反应，最后测吸光度，计算薯蓣皂甙元含量。结果显示该法比传统方法提取量高，作者说可能是由于超声波的高能辐射将薯蓣皂甙元的糖苷键断裂，从而导致其提取率增加，更重要的是因为超声波的空化作用是溶剂快速的渗透到细胞中，使薯蓣皂甙元溶解出来。杨转萍59等将超声波与表面活性剂进行协同作用，通过单因素试验和正交试验考察超声频率、时间、料液比、表面活性剂浓度对薯蓣皂甙元提取率的影响。结果得到优化后的萃取条件为常温，1:14料液比 (g/mL，黄姜粉末：表面活性剂水溶液) 、8.610

39、-3 mol/L十二烷基硫酸钠、25.8 kHz超声频率、萃取时间40 min，黄姜中薯蓣皂甙元提取率达到6.50%。1.4.2.4 超临界流体萃取法 Xiao-shun Shu60等通过超临界CO2流体萃取技术从酸解后的抜葜中提取皂甙元，分别对改性剂、压力、温度和提取时间进行了研究。结果显示超临界CO2流体萃取技术的提取效果明显高于传统的提取方法，提取出的皂甙元的主要成分为薯蓣皂甙元，当提取率达到最大值时，提取条件为压力35 MPa、60、95%的乙醇作为改性剂反应180 min。魏福祥61等采用超临界CO2流体萃取技术从穿山龙中提取薯蓣皂甙元，对提取工艺、条件进行了研究。选择穿山龙水解物粒

40、度为40目，夹带剂为体积分数95%的乙醇，通过正交实验确定了最佳提取工艺为萃取压力35 MPa、萃取温度55、CO2流量4045 kg/h和提取时间3.0 h，粗品薯蓣皂甙元的提取率为4.44%，粗品中薯蓣皂甙元的质量分数为w(薯蓣皂甙元)=54.65%。李辉62等通过单因素和正交试验确定了超临界CO2提取黄姜中薯蓣皂甙元的最佳工艺条件：夹带剂为95%的乙醇，萃取时间、压力、萃取温度和解析温度分别为3 h、20 MPa、60、50；各因素对提取率影响大小为：提取时间萃取温度萃取压力解析温度。得到的最佳条件的的提取率为19.35%。1.4.2.5 其他提取方法崔燕娟63等以云南重楼为原材料采用正

41、交实验设计方法，分别对四种提取薯蓣皂甙元的方法直接提取法、改进酸水解法、加酶水解法、微波加热水解法进行了工艺条件优化，实验结果表明：在直接提取法中，以无水甲醇为提取溶剂，薯蓣皂甙元提取率最高时的实验条件为：样品粒度采用2040目、提取温度80、提取时间6 h时，微波提取效果其次。董悦生64等将盾叶薯蓣进行直接转化制备了薯蓣皂甙元，并优化了培养条件。其中对转化效果影响最大的因素为pH、微生物接种量、培养温度，最终确定了最佳的转化条件：缓冲溶液为pH 6.0的66.7mmol/LNa2HPO4 KH2PO4缓冲液中，米曲霉接种量8%，在37培养84 h后，升温至50继续转化8 h。1.4.3 薯蓣

42、皂甙元的纯化和检测方法的研究进展1.4.3.1 薯蓣皂甙元纯化方法的研究进展刘光东65等利用D-101型大孔吸附树脂，富集与纯化薯蓣水溶性皂甙，试验说明纯化前样品液的预处理非常重要，当吸附时间为2 h，洗过乙醇浓度为70%时具有较好的分离富集效果。试验结果显示纯化前黄姜中的水溶性薯蓣皂甙含量为13.1%，纯化后的含量为27.3%，精制度达到208%，洗脱率达到80%以上。舒明勇66通过正交实验设计，得到薯蓣皂甙元最佳的提取条件：以粉碎粒度60目、萃取时间10 min、萃取温度100、固液比1/20，之后采用酸性氧化铝柱对薯蓣皂甙元进行梯度洗脱纯化，用洗脱溶剂为苯、石油醚、乙酸乙酯，之后采用HP

43、LC检测，纯度达到84.31%，得率为1.21%。刘咏67等用硅胶层析加重结晶的方法对黄姜中薯蓣皂甙元粗品进行了提纯，并对纯品的结构进行了初步鉴定，方法如下：取一定量薯蓣皂甙元粗品，以10% H2O-CH3OH作溶剂溶解，将滤液加到硅胶柱上，然后用CHCl3-MeOH（体积比为65:30）做冲洗剂洗柱，以TCL法带标样鉴别，合并相同组分，浓缩，析出晶体，离心干燥得薯蓣皂甙纯品。1.4.3.2 薯蓣皂甙元检测方法的研究进展重量法、分光光度法和色谱法是薯蓣皂甙元常用的检测方法。重量法：此法将薯蓣皂甙元的粗品烘至恒重后称重，然后将干燥后的粗品与样品的绝对干重的比值即为皂素含量。石艳霞68等将薯蓣皂甙

44、元皂甙元粗提液浓缩至一定体积，重结晶后过滤，105干燥，冷却，称重，并计算其含量。重量法由于其原理和设备简单，只根据薯蓣皂甙元重量即可计算其含量，因此工业生产常用重量法做粗略计算，但是此法误差大逐渐被实验室的精确检测分析所淘汰。分光光度法：分光光度法是一种操作简单，能定性和定量检测分析被测物质的方法。此法不需要将薯蓣皂甙元进行重结晶操作。陈战国69等第一次以香兰醛冰醋酸一高氯酸作为皂甙元显色剂，用分光光度法检测波长为530 nm，此法特点为测定薯蓣皂甙元时不需分离。马敬中70等用乙酸酐一浓硫酸作显色剂对甾体化合物在460 nm进行分光光度法测定，显色温度为50，显色剂占总体积2/5，少则色度变

45、浅或难以显色，多则杂质发生干扰虽然此显色剂对甾体皂甙元显色具有专一性， 但由于色素的干扰，往往导致测定结果偏高。张玲71等首次采用浓硫酸反应使薯蓣皂苷元显色，对影响显色反应的主要因素进行了试验，用分光光度法在波长为410 nm处对黄山药中薯蓣皂苷元的含量进行测定。试验结果表明：方法的线形范围为230 g/mL(r=0.9996)，平均回收率为97.8%；最佳显色条件为：水浴温度50、反应时间30 min、浓硫酸用量10 mL。薄层色谱法（TLC）：谢如刚2等采用薄层光密度法对薯蓣皂甙元进行检测，以石油醚(6090)-乙酸乙酯为(4:1)作为展开剂，以浓硫酸喷雾作为显色剂，所得结果显示误差较小，

46、比较适合于薯蓣皂苷元含量较高时的测定。刘玉珍73等通过薄层扫描对蒺藜中薯蓣皂苷进行测定，以氯仿-乙酸乙酯(9:1)为展开剂，茴香醛：冰醋酸：硫酸(1:100:2)为显色剂，S=433 nm，R=480 nm，结果呈良好的线性关系。康阿龙74等用氯仿-甲醇-水(65:35:10) 作展开剂，通过分光光度法在510 nm下进行检测，以10%的硫酸乙醇溶液进行喷雾显色，得出的结果表明方法精密度较好。TLC法的优点虽然比较简单，但需要使用薄板涂层作为固定相，因此不易保存和稳定性较差等缺点比较突出。气相色谱法：此法以气体作为流动相，其特点是分利率高速度快，样品用量较少和检测限低等。陶莉75等分别用气相色

47、谱法和红外光谱法对薯蓣皂苷元进行了定性和定量。确定最佳的检测条件为：柱温270，汽化温度330，氮气流速设定为50 mL/min，试验结果显示薯蓣皂甙元与其他杂质分离较好。都述虎76等通过毛细管气相色谱法对盾叶薯蓣中的薯蓣皂甙元含量进行检测，样品的峰面积在3521758 g范围内与其浓度呈良好线性关系。高效液相色谱法(HPLC)：本法适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的检测，因此被较多应用于甾体化合物的检测分析。韦建荣77等采用高效液相色谱法测定了重楼中薯蓣皂甙元的质量分数。试验过程包括甲醇提取、酸水解，得到薯蓣皂甙元后，进行HPCL检测，色谱柱为Symmetry C8，流动相为

48、V(乙腈):V(水)= 75:25，检测波长203 nm，结果显示重复性较好。韩菊78等采用的提取薯蓣皂甙元的技术为超临界CO2萃取法，原料为盾叶薯蓣，提取之后采用高效液相法进行检测。色谱柱采用Shim-packCLC-ODS(150 mm416 mm，5 m)，流动相为V(甲醇):V(水) =99:1，流速为1.0 mL/min，UV检测波长为206 nm。在0.2210 mg/mL范围内，薯蓣皂甙元峰面积与其质量浓度呈良好的线性关系，r=0.9997。彭红霞79等采用超声提取结合酸水解对黄姜进行预处理，通过RP-HPLC测定薯蓣皂甙元含量。色谱条件为：色谱柱AglilengtHC-C18，

49、流动相为甲醇:水= 95:5(V:V)，流速为1.0 mL/min，UV检测波长为203 nm。结果表明，薯蓣皂甙元峰面积在401000 g/mL范围内与其质量浓度呈良好的线性关系(r=0.9996)，样品平均加标回收率为99.8%，RSD为1.1%。与传统方法比较提取量提高了32%。1.5 课题主要研究的内容、意义及创新点1.5.1 课题研究的内容和意义薯蓣皂甙元作为重要的医药中间体，主要存在于薯蓣属植物当中，因此国内外研究薯蓣皂甙元的提取和检测等研究基本都以盾叶薯蓣为原材料。研究的内容主要包括盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元的提取，纯化以及检测等。而到目前为止，没有研究报道关于甘薯中薯蓣皂甙元的提取和

50、检测的内容，有试验研究报道，甘薯中发现存在DHEA，而薯蓣皂甙元则是DHEA的前体物质，因此对甘薯中薯蓣皂甙元的试验研究，在有利于综合开发利用甘薯的同时，为甘薯中DHEA的提取也提供了一定的理论依据。本课题采用超声波辅助法提取甘薯中的薯蓣皂甙元，选用盐酸进行酸解预处理，目前工业上生产薯蓣皂甙元也多采用酸解预处理操作，此方法操作简便，易实现规模化生产，且酸解溶液中存在的大量单糖可以进行发酵，进而回收乙醇，增加企业收益。本课题采用分光光度法和高效液相色谱法来检测甘薯中的薯蓣皂甙元，并进行定性定量分析。本课题主要针对河北省农林科学研究院粮油所选育的新品种，进行甘薯中薯蓣皂甙元的提取工艺研究；对分光光

51、度检测方法中的显色剂进行对比；并对提取方法进行优化。为河北省甘薯的综合利用和功能成分的开发提供了参考，带动地方产业经济，提高综合利用价值。1.5.2 课题的创新点经反复试验筛选出薯蓣皂甙元含量较高的甘薯品种，并对分光光度检测法中薯蓣皂甙元的最佳显色剂进行了对比分析试验，最终确定适合甘薯检测的显色剂和显色条件。以传统的提取方法为参考，改用超声波辅助提取甘薯中的薯蓣皂甙元，从提取率和提取时间上提高薯蓣皂甙元的提取效果。采用硅胶柱层析对甘薯薯蓣皂甙元的粗提液进行了纯化，并用HPLC法进行了定性分析。研究了从甘薯膨大期到成熟期薯蓣皂甙元含量的变化情况，分别对甘薯的根、茎和叶等部位考察了薯蓣皂甙元的变化

52、趋势，对河北省农科院甘薯的综合利用提供依据。53第2章 甘薯中薯蓣皂甙元分光光度检测法第2章 甘薯中薯蓣皂甙元分光光度检测法2.1 试验材料与设备2.1.1 试验材料与试剂甘薯（冀98、冀71、冀65） 河北省农科院粮油所薯蓣皂甙元标准品（97%） 中国药品生物制品检定所盐酸，分析纯天津市大茂化学试剂厂高氯酸，分析纯天津市大茂化学试剂厂香草醛，分析纯天津市大陆化学试剂厂氢氧化钠，分析纯天津市大陆化学试剂厂浓硫酸，分析纯新光化工试剂厂氯化钾，分析纯天津市大陆化学试剂厂冰醋酸，分析纯天津市大茂化学试剂厂石油醚，分析纯天津大茂化学试剂厂乙腈，色谱纯天津康科德科技有限公司甲醇，色谱纯天津康科德科技有限

53、公司2.1.2 试验设备101-1型电热鼓风干燥箱 天津华北试验电炉厂玻璃仪器气流烘干器河南豫华仪器有限公司JA 1003型电子天平(感量0.001 g)上海精科天平JJ 1000型电子天平(感量0.01 g)美国双杰兄弟(集团)有限公司DK-98-1型电热恒温水浴锅河南省巩义市英峪予华仪器厂SP-756 p紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司DELTA 320型pH计梅特勒-托利多仪器有限公司LG10-2.4A型离心机北京医用离心机厂SHZ-D()循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂Re-201旋转蒸发器河南省巩义市英峪予华仪器厂201升降恒温水浴锅河南省巩义市英峪予华仪器厂SHZ-D()

54、型予华牌循环水式真空泵河南省巩义市英峪予华仪器厂超声波昆山市超声波仪器有限公司高效液相色谱仪上海岛津仪器有限公司2.2 试验内容与方法2.2.1 分光光度法检测甘薯中薯蓣皂甙元方法的确定2.2.1.1 甘薯中薯蓣皂甙元样品的制备将甘薯清水洗净后切片，40鼓风干燥24 h，冷却后粉碎过40目筛。准确称取5 g甘薯粉末，加入50 mL、2 mol/L的盐酸，用超声波处理30 min，取出后在沸水中水浴3 h，用2 mol/L NaOH将pH调至中性；真空抽滤，滤渣在60下干燥3 h；滤渣中加入50 mL石油醚和1 g活性炭在超声波中提取1.5 h；过滤残渣，将滤液用石油醚定容到50 mL。2.2.

55、1.2 不同的显色剂对分光光度检测方法的影响本文采用硫酸、高氯酸和香草醛冰醋酸高氯酸（以下简称香草醛显色剂）三种显色剂来检测薯蓣皂甙元的含量。以甘薯中薯蓣皂甙元提取液为检测样品，以薯蓣皂甙元标准品作为对照，显色后分别用分光光度计在400700 nm波长下进行扫描检测，确定甘薯中薯蓣皂甙元的最大吸收波长。2.2.1.3 香草醛显色剂与甘薯中薯蓣皂甙元显色稳定性试验由于香草醛和甘薯中薯蓣皂甙元在显色过程中需要进行水浴加热和静置等过程，而这些因素会影响显色效果，因此分别对高氯酸用量、水浴时间、水浴温度和样品静置时间进行了单因素试验，每个试验进行三次，取平均值，过程如下：取5 mL甘薯薯蓣皂甙元提取液

56、于具塞试管中，水浴挥干溶剂，依次加入0.2 mL新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液和一定量高氯酸，然后进行水浴加热，再用冰水冷却，最后用冰醋酸将其定容至10 mL，静置。2.2.2 薯蓣皂甙元标准曲线的绘制精确称取10 mg薯蓣皂甙元标准品，溶于50 mL石油醚中，吸取以上标准溶液0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL，挥干石油醚，按香草醛冰醋酸高氯酸显色方法处理后，分别定容到10 mL，在540 nm下测定其吸光度值（A）。以吸光度(A)与浓度(C)求得回归方程，绘制薯蓣皂甙元的标准曲线。2.3 试验结果及分析2.3.1 不同显色方法对甘薯薯蓣皂甙元检测影响的试验结果通过2.2.1.2试验

57、结果表明，用浓硫酸显色，干扰大，且不稳定；用高氯酸作为显色剂虽然显色效果较稳定，但由于甘薯中薯蓣皂甙元的含量相对较低，而当薯蓣皂甙元含量较低时，用高氯酸检测效果不明显；香草醛-高氯酸作为显色剂，灵敏度较高，显色稳定性较好，而且香草醛-高氯酸是薯蓣皂甙元常用的显色剂，因为薯蓣皂甙元在C-3位有羟基，5(6)有双键，当提取样品与其反应后，C-3位羟基脱水，形成共轭体系，因而吸收位置红移程度很大，在540 nm处有最大吸收峰。因此，本实验选用香草醛冰醋酸-高氯酸显色法。2.3.2 香草醛冰醋酸-高氯酸显色法稳定性试验结果2.3.2.1 高氯酸用量对显色稳定性的影响按2.2.1.3试验方法操作，分别将

58、香草醛显色剂中的高氯酸用量变换为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，在80水浴加热20 min，然后取出在冷水中冷却，用冰醋酸定容到10 mL，在常温常压下静置30 min，然后在540 nm下进行分光光度检测。检测结果如图2-1。图2-1 高氯酸用量对分光光度检测稳定性的影响 从图2-1中可以看出高氯酸用量对显色体系的稳定性影响不大，当显色剂和薯蓣皂甙元结合后，显色结构相对稳定，所以加入较多的高氯酸也不会影响显色效果，因此，以下试验选用0.2 mL的高氯酸进行添加，以减少药品的消耗。2.3.2.2 水浴时间对显色稳定性的影响在80水浴甘薯中薯蓣皂甙元和香草醛显色剂的反应体系

59、5、10、15、20、30、40 min，然后取出在冷水中冷却，用冰醋酸定容到10 mL，在常温常压下静置30 min，然后在540 nm下进行紫外检测。检测结果如图2-2。图2-2 水浴时间对分光光度检测稳定性影响由图2-2可以看出，当水浴时间为20 min时，测得的样品溶液中薯蓣皂甙元的含量最高。水浴时间较短，其显色体系与提取样液不能达到反应温度，不能充分的结合，而较长的时间又会产生副产物，破坏显色效果，因此，选用20 min作为最佳的水浴时间。2.3.2.3 水浴温度对显色稳定性的影响反应体系水浴时间分别为50、60、70、80、95，水浴20 min，其他反应条件如上。检测结果如图2-

60、3。图2-3 水浴温度对分光光度检测稳定性的影响综合2.3.2.2的分析结果，得出当水浴温度较低，显色体系与样品的显色结构位点不能有效结合，而温度过高会产生附加产物，使显色加重，影响显色体系的稳定性。因此选用80作为最佳的水浴温度。2.3.2.4 静置时间对显色稳定性的影响显色反应体系在80水浴加热20 min，然后取出在冷水中冷却，用冰醋酸定容到10 mL，在常温常压下静置0、0.5、2.0、4.0、6.0、18 h，然后在540 nm下进行紫外检测。检测结果如图2-4。图2-4 静置时间对分光光度检测稳定性的影响结果显示，短时间内静置对检测样品的稳定性基本上没有影响，30 min内的RSD

61、值为1.6%。2.3.3 香草醛冰醋酸-高氯酸作为显色剂的分光光度检测结果2.3.3.1 标准曲线的绘制结果其回归方程为：y=16.36x+0.2531，线性相关系数R2=0.9975。皂甙元标准品浓度在0.0080.060 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性相关关系，如图2-5。 图2-5薯蓣皂甙元标准曲线2.3.3.2 分光光度检测结果分光光度法全波长扫描薯蓣皂甙元标准品结果如图2-6。薯蓣皂甙元的最大吸收波长为540 nm。图2-6 分光光度法全波长扫描薯蓣皂甙元标准品结果2.3.3.3 重复性试验取同一批甘薯薯蓣皂甙元样品溶液6份。按“2.2.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法显色，于540 nm波长处测定A值，并计算含量，结果平均含量为0.874 mg/100g干粉，RSD为1.9%(n=6)。2.3.3.4 精密度试验 精密量取2 mg/mL薯蓣皂苷标准品溶液0.2 mL，共5份，依2.2.1.3方法显色后，测定吸光度。计算RSD为1.7%。结果表明方法精密度良好。2.3.3.5 加样回收率试验取已知薯蓣皂甙元含量的甘薯样品粉末20 g，共6份，精密称取，按2.2.1.1方法提取薯蓣皂甙元，加入一定量薯蓣皂甙元标准品，测其吸光度，计算其含量。结果见表2-l，平均回收率为95.34%，RSD为1.4%