流式细胞术的设门方法

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1、流式细胞术的设门方法流式细胞术数据分析U的就是需要确定所要研究的LJ的细胞器，这就涉及到 设门。设门就是划定某一区域的细胞群体，对其单独加以分析或分选。门的形 状可任意，方法有儿种：（1）阈值设门。FSC （前向散射光）是最常用的阈值 参数。FSC和细胞的大小正相关。用FSC设阈值，可以使低于该阈值的细胞碎 片等其他杂质的信号不被处理。（2）散射光设门。以FSC和SSC （侧向散射 光）联合设门较常用。其最大优点是可以排除碎片或噪声的干扰。可以根据 FSC vs SSC散点图上不同细胞分布不同来设门目的细胞群。另外还有荧光设门、反向设门和组合设门。流式细胞术的数据分析过程实际 上就是选门和设门

2、的过程。应该注意到设门是一个主观行为，是人为做出的决 定，不同的人设门会存在很大差异，它是流式细胞术中最难掌握的技术。因 此，对设门有2点需要把握：首先，设门尽可能客观；其次，应该认识到设门 需要主观决策。为了尽量减少主观判断带来的误差，最好分选一些细胞用显微 镜观察来进一步确认门的客观性和准确性。流式细胞术的设门的注意事项：通过流式细胞术分析细胞样品时，欲获得更加准确的分析结果，应用最优化的 设门策略非常重要。要考虑的因素包括：1）排除细胞碎片2）应用合适的荧光阴性对照3）排除死细胞.4）如果合适，使用一种共享标记物（比如CD45 口细胞标记或与之等效的泛-细 胞群标记）染色5）设置必需的荧

3、光分析点图1）去除细胞碎片:在流式细胞仪上获取数据时，建立一个前向散射（FSC） VS. 侧向散射（SSC）点图，并通过调节各个光电倍增管装置以确定所有要分析的细 胞群都在点图的可视范围内。在必要时，需要通过设置和调节FSC阈值，将大 部分的细胞碎片、气泡和激光背景噪的干扰排除在分析区域之外（都应该设在FSC-low的区域）。接下来，在FSC vs SSC点图中圈出感兴趣的细胞群的周围 区域（R1）,这个区域可以被称为“Rl-FSC vs SSC” o（裂解后的人全血FSC vs SSC的典型设置）2）应用合适的荧光阴性对照：染细胞时，建议您将细胞分在两个试管中，在其 中一个试管中，用荧光标记

4、的抗体染感兴趣的细胞，而另一个试管应用荧光同 型抗体做为相应的阴性对照，这样有助于在分析中更精确地区分阳性信号和阴 性的荧光背景。3）排除死细胞：通过Propidium Iodide （PI）或7-AAD等检测细胞活性的标记 染细胞，以区分活细胞与死细胞。首先建立FSC vs “细胞活性染色”点图，然 后将“Region 1-FSC vs SSC”设置在这个点图上。之后，圈出活细胞群区 域，称为“Region 2-Viable”olspor umpQ.MdfYl E=pfidC*：4*VFSCUnstained Control4）如果合适，使用一种共享标记物染色有时候，可以染一种在感兴趣的细胞

5、与 其他细胞都有表达的标记（例如在所有白细胞上都表达的CD45, ） o虽然这个 步骤不是必须的，但对于分析一些稀少细胞类型时有帮助。首先，建立一个 FSC vs “共享标记物”的点图，将“Region 2-Viable设置于这个点图上。 然后，圈出所有表达这个标记的细胞群，设为“Region 3 - Shared Marker v。FSCFSC FSC5）设置必需的荧光分析点图，现在可以根据需要建立荧光分析点图（例如，FSC vs FITC或FITC vs PE,等 等）o 确保将 “Region 1 - FSC vs SSC” , “Region 2 - Viable” ,和uRegion 3 一 Shared Markern （如果适合的话）等各个门都设置在每个荧光点图上。应用相应的荧光同型阴性对照有助于从背 景荧光信号中区分出阳性信号。C