酵母利用组换DNA精

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1、酵母总利用。尢組換KDNA実験丰少卜先生用v二7山口大学工学部酵母工房2+内容（10/儿一 用+予備実験1回分付）先生用v二71 冊生徒用v二二7儿1 冊酵母菌予備実験用（0.3 ml）1 本冷凍庫（-20C）保存酵母菌本番用（1.5 ml）1 本冷凍庫（-20C）保存77吃遺伝子導入済酵母菌1 本冷凍庫（-20C）保存DNA液(各 0.05 ml)12 本冷凍庫（-20C）保存遺伝子導入液（各 0.2 ml）12 本冷凍庫（-20C）保存YPD培地”*6 枚冷蔵庫（4C）保存培地*11 枚冷蔵庫（4C）保存最少培地*12 枚冷蔵庫（4C）保存発色液*(3 ml)11 本冷蔵庫（4C）保存*1

2、2 本1 本毎包装儿一7*34 本1 本毎包装滅菌済23 本1 本毎包装入求彳卜（発色液用）11 本個別包装肚L7口一卜1 枚*遺伝子導入済酵母菌总必要肚引才使用。遺伝子導入力诚功 尢場合使用歹召必要总笳去乜人。*予備実験用哲含住。組成总付録参照保存?V口于二一7入二酵母菌，DNA液，遺伝子導入液冷凍 庫V入料疋保存LTO?7U-卜培地類哲冷蔵庫忙指、尢方力長持，室温疋保存LTfe構、仮?多OO器具总殺菌LT、去T。袋总開疗尢場合疋哲保存袋总七匕T5U酵母工房3DNA液BAi?酵母菌液a色発培地1-卜/U酵母工房 4先生Q用意?湯浴(42C)1個肚卞等V湯总入nr42cvr。?温度計1本42C

3、設定Oo?殺菌槽1O容器V漂白剤(丰少于八彳夕一等) 总入n力7数袋力、5器具ro2S袋力7数小。写真OVfe便利。?廿2力数于二一7、壬7卜V記入ro酵母組換元DNA実験卜平成 14 年忙改訂M尢文部科学省組換元DN 実験指針教育目的組換元DNA 実験指針力新設,5，平成16 年組換元 DNA 実験法令化m教育目的組換元 DNA 実験枠組，基本的V平成14 年実験指針V従二疋行刁乙m去歹。乙丰少卜总国規則V合，組換元DNA 遺伝子，夕質，酵素肚乂总学恳乙七力疋吉召丰少卜疋歹。本丰少卜总，高等学校 等疋教材LTO使总特V配慮LTTo，以下特徴力笳去To1)安価o2)教師O準備O手間力训肚“3)

4、特別肚実験機器总全必要Lo4)rro試薬，器具力含nro5)簡単疋失敗庇 S、。6)教師用予備実験哲含nro7)保存o8)身近u酵母利用ro安全疋親Lro9)生物 I 七 IIO教科書七O対応力考元5nTSo10)工夫力盛込高度肚実験展開哲可能o6 皿実験操作疋遺伝子導入壬遺伝子力、5匕卜V有用肚夕、丿)V質力生産 様子总学恳乙七力吉去r。実験总通LT生物V対r理解力.深去A遺伝 子o興味壬人類社会V指疗召八彳才亍夕丿口声一o役割总考元召吉二力、疗七肚 幸TO酵母工房 5本丰少卜実験概要了匸一吐汙、o 吃分解歹召酵素0 吃液中忙入。実験m力 遺伝子总持ODNA酵母菌忙導入Lr。力遺伝子 指酒発

5、酵V用菌(Aspergillus oryzae)由来000,酵素怎消化薬 利用。酵母菌吃遺伝子总本来持弐去吃遺伝 子力導入m尢酵母总遺伝子力転写，翻訳mrzwv吃力合成m,分泌m去r。乙ozwv吃活性虧DO分解能力0検出LroH養亍反応 总使or培地忙含去分解总調卞去r。遺伝子導入OL次強一声o図肚去r。(栄養素o一O)总合成酵母菌总使去r。乙o酵母培地0总生育0吉去pe。乙o酵母合成r遺伝子力.導入培地0哲 生育0吉去rL尢力oT,v儿总合成0酵母菌合成遺伝子 总哲ODNA总混T,条件总設定rDNA力*酵母菌入去r。中遺伝子o入酵母菌哲多去r。乙总rTv儿力肚 培地Tn,DNA入o尢酵母o昉

6、生育L去r。生育L尢酵母=少儿合成遺伝子力入o尢酵母七肚去rv儿合成遺伝子o横vzwv吃遺 伝子总隣接To0,o酵母zwv吃遺伝子哲導入 去r。実験总驚簡単0r。一方，実験忙含n知識内容大変深%o力笳 去r。乙o丰少卜总簡単肚体験学習LTfe構成0吉去rL，大学uo内容 总教元召乙七哲0吉去r。酵母工房 6組換元DNA実験道伝子導入最少培地7?遗咗子導人降忑总毒恳少亍少儿合菠遺伝子那人二比 酵斑立显少培地疋生舍疋吉為 -握少治地左生育組挟丸体七肚石U曇鬆穀力耳少素少儿無桐堆威 （最少堵地）疋生兰血澹居孑7壬7-遣伝子7培地酵母工房 8教育目的組換元DNA実験m実験材料教育目的組換元DNA実験安

7、全性高実験材料力規定。遺伝 子总導入歹召宿主大腸菌，枯草菌，培養細胞，酵母,導入遺伝子,GFP,7xv-nrr。本丰少卜总，酵母菌总宿主七。，力遺伝子总用去r。酵母菌酒肚乂食品忙利用最哲安全肚微生物一二疋歹。“ 匚大腸菌忙比卞操作力谪単&教育目的実験忙最適卞微生物r。指導者要件教育目的実験总行刁場合指導roo要件力決。組換元 DNAO取扱X总理解，大学在学中V組換元DNA実験O経験力笳召力、，去 尢总，大学等力.開催参加。尢乙七力笳召経験力必要r。指導者o義務実験总行刁場合怎，実験中o適切肚指導，全体o管理監督学校長o同意 总得召乙七力*必要r。去尢，実験者o名簿，実験場所，日時，使用材料施

8、o記 録七保存力必要nnrs去r。実験室七実験上o注意実験室氐 初等中等教育機関o理科室問題肚j特別肚設備总必要笳 去乜人。本丰少卜m，特殊肚装置壬器具总必要笳去乜人。実験上o注意事項，以下oro?窓壬扉总閉cryy分解酵素r。単糖多糖忙 米壬含去nTx召A7A疋r。A7A肚Twvn分 解素紫色忙染去去rL力、L,分解m尢歹儿一素m染去去乜人。乙n总利用LT,酵素O活 性总鋭敏v簡単v測乙七力吉去r。Tvm疋液vfe含nTru，消化薬vfe入oTx去r。乙O丰少卜OTWV吃遺伝子O産物总三共胃腸薬O中V入oT夕力声TX夕一吃七同CfeOr。疋液中OTv吃O活性簡単V調乙七力疋吉吃活 性測定丰少

9、卜fe用意LTr。本丰少卜七TWV吃活性測定丰少卜七总同時V利用n遺伝子工学七酵素壬夕0質O知識力格段v増元召总于r。去尢，nOb遺伝子操作总行oTTWv吃七自分OTv吃壬医薬 品OTv吃v触n乙七力吉去ro，遺伝子七医薬壬体OTv吃七O関連力.身近肚問題七LT捉元召乙七力吉去r。酵母工房10先生予備実験編（1週間程度）実際生徒実験前先生方疋丰少卜总試験成功总確認 予備実験总紹介Lr。予備実験m結果時間短縮o 沁最低限o時間疋行 去r。 去尢， 得尢結果卜等总保存L,生徒o実験力失敗成 功例LT示r乙七力吉去rDNA总入料肚X場合ovb口一儿実験总先生 用O予備実験QL力入料m、去卜口一儿実験

10、o用意LTfe予備実験总 是非行。恒温培養器等問題肚実験力吉去r力.，培養器 力诲池f時間力短縮疋吉去r。安価创亘温装置总 3 万円程度疋手忙入去r（SANSHOSIB-25 妣）。注意事項空気中忙浮遊微生物壬手忙付着微生物力混入注 意r無菌操作七肚去r。可能疋笳料f力入八一扌一o横壬夕】丿一于疋 操作总行刁方力/、r力.，以下o点总注意r料問題总起乙去乜人。? 培地7U-bo7夕总住壬族V開疗肚、乙七。 空気中o雑菌力混入r（写真）。? 入求彳卜，儿一y,yu、y歹一总袋力、住壬 加乙出总肚、乙七。操作o直前忙出L,出L尢 手壬服，実験台先力总初注意一度出L尢亍一7、儿o上忙置置必要力笳召

11、場合0比先置。? 酵母菌于二一使用直前去疋開疗肚、乙七。? 彳；一声卜u二V/总実際o操作o前忙行。無菌操作肚o求彳卜壬yu、y歹一总袋力、5出r七中止疋吉肚、。実験後 o 片付疗1.7VX器具微生物总丰少于V7丿一于肚乂o塩素系除菌？漂白剤殺菌処理LI捨T310 ml 程度o7U-1Lo水V入料，乞o容器忙使用後o儿一y,yu、7歹一，口于二一7,入求彳卜類总入料。 10 分以上置、尢o,捨T。2.yu卜培地yu卜培地,寒天培地总5yu卜力、5取出L,水ONo尢肚卞V入料，沸騰殺菌r。沸騰rnf，火总止,水分总流LV,寒天肚o固形物总生族七LT捨T。溶疗尢寒天总流LV流r七吉总水疋寒天液 总

12、薄5流r必要力.笳召。溶疗尢寒天力.流Loy固去召七流L力時吉 去召原因o大量o水疋薄召。酵母工房11予備実験予備実験怎生徒用実験m違。予備実験七卜花用 疋実験花始TVo1 日酵母菌前培養总行 9o（ 10 分）用意酵母菌于二一 7（ -20C保存）1 本YPD培地1.凍結。尢予備実験用酵母菌液（0.3mi）总溶力、r。2.溶力、。尢酵母菌07夕总開0九于二直接1枚OYPD培地忙尢5To夕总ro3.酵母液总一总傾疗肚全体忙広厅爲（写真）。4.夕总。疋，室温疋 1 日置。30CQ保温増殖总最 状態o2 日置To参考：酵母菌总冷凍状態疋 1 年以上保存 疋吉召。解凍总繰返LTfe数回总使元5o2

13、日酵母菌遺伝子導入（二卜口一儿実験哲含迄 1 時間）用意前日準備。尢酵母菌培養7U-b1 枚（写真）DNA液1 本（室温疋溶力、r）遺伝子導入液2 本（室温疋溶力、r）儿一72 本最少培地2 枚仆4 本2 本7口一卜1 枚42CO湯浴写真1.遺伝子導入液总冷凍庫力取出解凍r解凍。切犬態疋数時間置ST哲問題肚So2.遺伝子導入液O于二一7O1本07夕DNA，哲刁1本KDNA入料肚卜口一儿 c記入r 5o酵母工房123.前日用意LYPDyU-b生育酵母菌总 儿一7（丸笳召側）H吉召疋疗多集召。培地总力、 （写真）4.-yo酵母菌全部总遺伝子導入液忙直接入料。米粒程度总必要。乞料艺料 変元疋 2 本

14、窕入料召（写真）。注意：酵母菌O生育。尢 YPD 培地总冷蔵庫保存LTfe。数日肚引f導入効率总落 使元召。去尢，乙O酵母活性検出用OVb口一儿酵 母使用廃棄Lo5.滅菌済入求彳卜总袋力取出L,DNA 液O中忙入 DNA 溶液疋总酵母菌O入二尢遺伝子導入液DNA 忙入no6.入n尢後，同液总吸二尢。出L尢总5回繰返Tin酵母菌 总懸濁（疗人疋）TE（均一忙酵母菌总遺伝子導入液忙混）oO操作 总重要。7.HVb口一儿CDNA溶液总入新LXX求彳卜混它召操作总 全同行刁。以後DNA入七同C操作。8.7口一卜于二一y总差L込族42C（42C以上O温度m酵母力弱H注意）20 分置。（湯浴总冷効率力卷召

15、程度落問題肚“途 中疋熱L疋 42C总維持T5場合疋哲決LTn以上O温度乙O42CO時間总Of也f遺伝子導入効率力上昇To通常 12 時間力*Xo授業時間O都合疋変更可能 20 分总必要。）9.新LXX求彳卜总袋力、5出L,42CQ置STS尢酵母-DNA 混合液总DNA記入L尢最少培地卜O中心V尢5T（写真）。尢5L尢夕总L6o酵母工房13io.?y、丿歹一?疋酵母DNA混合液均一引訓伸才歹。水分力 残引吉伸。乾尢後引吉伸菌 总取除禁物。引吉伸夕总r。11.卜口一儿哲同12.室温疋 37 日，白口二一力現置疋指（写真）。哲 28C30co恒温彳丰二卞一夕一，約 2 日疋現nroL空気中混入。尢

16、酵母菌以外力微生物力発生L尢5早冷蔵庫忙入n。力丄力混入ryu-b力覆nruo酵母工房144 卄42co時間七効率（効率口二一数疋現n）o関係总調発展的肚実験哲可能。去匕42 室温忙静置遺伝子導入力可能場合总 1 日 （約 24 時間）疋高遺伝子導入率力得。 高校実験 時間总考慮LT,OV二720 分总設定，室温 1 日置吉翌日次O操作忙移 422 時間程度力最哲高X効率总示歹。42C力滋遺伝子導入効率总上厅爲O力M比去疋初力肚X。4 0fe:遺伝子導入酵母 7U-bO観察七 77吃活性検出 O準備用意遺伝子導入酵母力生元尢最少培地1枚導入前酵母菌1枚培地1枚儿一73本1本? 観察DNAO最小

17、培地忙白X小总肚哲上力二尢丸X点現料疋于。 個O点总口口二一七呼恳。 冬場m気温力低XZ酵母菌O成長力遅XO,feL 口二一力小 1, 2 日待現料召总于。1003口二一，哲七哲七1個O酵母菌力生育吉疋X。口 口二一O中 口比 loo 万個以上o酵母菌力増殖。疋X1口口二一总遺伝子導入酵母菌 力 1OX尢乙七总示ro,口 口二一o数力遺伝子導入o効率总示r乙七忙肚。口二一o数力侈X七効率（遺伝子力取込去n尢乙七总示r。酵母工房15口二一数元方,yu-b裏返LT,yu-bo底力、乙口 口二一总観察歹 养口二一点总打数元召七数元間違（写真）多場合总 4 分割一分割分总数元 4 倍ro一方c最少培地

18、0口何哲生；trTooyu-bfe生徒用忙示r冷蔵庫保存ro最少培地忙増殖。尢酵母遺伝子哲同時忙導入nro本実験宿主酵母持尢肚，新持弐hyy总分解r能力力M寸与m尢酵母菌力作製次遺伝子導入酵母菌力本当QTWV吃总持二尢力、力、总調? TWV吃活性検出準備（10 分）TWV吃活性検出o,r,yy含有培地疋酵母菌总増殖乜。1.yyy培地ov側忙廿彳点总20書（写真）。丁，feiorc七記入ro2.遺伝子導入m尢酵母菌口二一o数個-y,nyyy培地OT点忙合培地上 5 mm、5SO円形忙塗召（人肚形状） 塗夕总r。3.冷蔵庫保存生育LT導入前酵母菌总C点上忙同様5 mm5O円七肚塗。塗o5r7夕总r

19、o4.7夕 总LT室 温（3 oc）静 置ro翌 日 力 、5 y7y検 出 可 能 疋 笳 召力.1 週間酵母工房165 0fe:7-活性検出（10 分）用意酵母菌总塗培地1 枚入求彳卜（個別包装 1 本発色液1 本 （3 ml）2TO酵母菌O2.養亍、o反応力始,yu-b紫色总示rToL,7導入酵母O周加比透明Or（写真）。乙O透明帯总八口七呼oL力l,CO酵母株O周透明帯八口力吃活性总示r（写真）。遺伝子導入酵母菌力、乙分泌分解酵母菌o周養、 丿反応疋紫色七L疋検出no,yy培地上疋培養L尢7v吃总持酵母七乞o周素液（発色液）总：力、疗召七酵母菌o周囲透明忙肚 注意：紫色总時間力.経七消

20、元召力，乞o場合一度発色液色力 POL，酵母菌力発色液疋流状態总維持夕儿 力yv写真总撮結果力保存o生徒用実験本番日程案2週分七3週分日程案总示一週間単位疋授業力行考元疋日程案疋歹。適宜進展壬時間忙合計画o最短总予備実験日 程七肚去To生徒用九一実験予備実験疋行二尢DNA 总入場合遺伝子導入実1.酵母总塗二尢培地07夕总笳。九2 ml 程度o発色液总入求彳卜疋周乞二七落七。去r（写真）一卜一面忙発色液总入no酵母工房 17験总含去乜人。乞実験总生徒忙行場合 5九 T分七LT使 用LTo3週分実験日程案1 週間後第二回的実験遺伝子導入酵母観察実験概要説明5 分形質転換培地観察 m 口二一数測定1

21、0 分酵母菌培地塗布10 分講義35 分1 日力 1 週間後第三回的実験活性検出実験概要説明5 分分解検出20 分講義35 分（去尢吃活性測定丰少卜利用)実験直前準備42C湯浴準備第一回的実験酵母菌从遺伝子導入実験概要説明5 分酵母菌70J遺伝子導入操作20 分DNA-酵母菌混合液42C保温（講義）20 分混合液最少培地操作10 分後片付疗5 分実験前日実験準備：前培養20 分酵母工房 182週分実験日程案6 日後第二回的実験前日酵母菌培地塗布io 分実験概要説明5 分形質転換培地観察m口二一数測定10 分実験概要説明5 分TWV吃活性検出15 分講義七考察20 分後片付疗5 分実験总講義总含

22、的説明总行5,3 回力、2 回疋完結計画歹。2 回疋完結，第二回目実験前日V酵母菌培地 塗布总生徒力、先生力行刁必要，酵母菌总培養時間力.最低一 日必要肚尢To最小限時間行刁場合哲，34 日（温度力* 30C肚引才 2 日）0酵母菌遺伝子導入体力.口二一七LT観察培養時間力必要IT。授業O進展具合V合計画口二一总冷蔵庫疋保存疋吉去T。TWV吃活性検出丰少卜总疋液O酵素活性总検出歹実験丰少卜IT。 本実験 丰少卜七併用第一回目実験直前42C湯浴O準備第一-回的実験酵母菌遺伝子導入 実験概要説明5 分酵母菌遺伝子導入操作20 分DNA-酵母菌混合液O42C保温（講義）20 分混合液O最少培地操作1

23、0 分後片付疗5 分実験前日実験準備：前培養20 分1 週間後第二回的実験遺伝酵母工房 19T遺伝子力、5夕質，酵素总身近肚内容七LT学習T乙七力吉去T。予備実験总行二尢場合总，容易V実験力理解思去T。生徒人数壬夕儿W合初乜尢実験準備总行。 実験V失敗出T召乙 七力普通IT力.， 失敗利用T同時V,失敗总力八一疋吉V予備実験IO結果壬写真总保存LT,本番実験疋利用生徒用本番実験第一回的実験前日（求尢处 2 日前左哲可）所要時間 10 分先生本番実験用準備疋歹。予備実験前培養七同 2九一 xYPD培地 i 枚分总用意用意rO（10八一分：力一7数Q/0YPD培地枚数总調整）酵母菌本番用（-20C

24、保存）1 本YPD培地5 枚1 本1.凍結。尢酵母菌于二一7、总溶力、r。2.YPD培地总 5 枚用意夕LT並卞疋置。3.滅菌済X求彳卜总用意X求彳卜目盛酵母菌总約0.3 ml 分总1枚YPD培地050，計 5 枚忙入no5b5r7夕总ro4.尢5 0尢酵母液总一总傾疗肚力$5広厅送。5.室温疋実験去 1-2 日置吉去r。30C前後忙保温増殖总最状態r。 寒場合总 2 日o方o注意事項微生物o混入总防開疗召時間总最小限 少O混入总問題5，決0疋混入0尢菌O方总遺伝子導入操作力X八一扌一o横疋操作r落下r微生物混入，酵母菌先力手壬服，実験台等忙笳尢5肚 注意roYPD培地总培養後忙他O微生物O混

25、入力観察汁尢場合,上O残007卜总使X回乜瓜実験总充分疋吉养fe0冷凍酵母菌場合， 予備実験等OYPD培地上忙増殖0尢酵母 菌总乞O去去儿一新0XYPD培地V塗二疋用意rXo酵母工房 20第一回酵母菌遺伝子導入実験当日準備生徒椚）以分疗疋指。歹儿一数忙合初乜疋丰少卜内容总分割LTfeo用意ro（i 夕儿一7分数）前日準備LC酵母菌培養7U-b1 枚/2 夕儿一7（写真）DNA液1 本（室温疋解力、T）遺伝子導入液1 本（室温疋解力、T）丿“一71 本最少培地1 枚滅菌済2 本1 本用意ro（実験室一o）42CO湯浴（写真）7口一卜1 枚実験直前 O準備42CO湯浴恒温水槽水总温42保温To冷元

26、疋温度力下 42C35C程度（但 42C以上口比肚5齐门 湯力多保温 2】丿少卜儿以上总欲Lo第一回的実験流 n5 分概要説明T20 分O操作T20 分O湯浴静置（空吉時間疋講義）T分片付疗1.実験概要O説明O後，遺伝子導入実験用七少卜总生徒忙確認。袋力、乙出 总肚X乙七总注意。滅菌操作哲理解o2.前日用意LYPD7U-b生育酵母菌总2九一 W 1枚/cTo酵母菌O説明。3.実験操作開始前日用意LYPD7U-b生育LG必酵母菌总力、吉七0棒O儿一7側H吉召疋疗多集召。寒天培地总力、吉七二尢場合気必要总肚八4.儿一7O酵母菌全部总遺伝子導入液直接入no米粒程度总必要。10 分O操作T5酵母工房2

27、15.滅菌済入求彳卜总用疋？DNA?V口于二一中忙入oTDNA溶液酵母菌入o尢遺伝子導入液忙入no6. 入料尢後，入求彳卜疋液总吸出。尢总繰返r乙n酵母菌总懸濁r5（均一忙酵母菌总遺伝子導入液忙混懸濁操作总重要O,5 回力、510 回行7.付属OT7口一卜于二一7总差。込族42C（42C以上O温度m酵母力死忙始皿 d注意） 20 分間置 。 湯浴总冷効率力卷召程度落 力問題m肚5肚。途中疋熱JT42C总維持r場合疋哲決LTn以上O温度 注意ro（乙O42CO時間总Of也f遺伝子導入効率力上昇ro去尢，室温忙静置LTXT遺伝子導入力可能乞 乞O場合总1 日（約 24 時間）疋高遺伝子導入率力得5

28、no高校O実験時間总考慮LT,乙OP二二了儿m20 分总設定LT,室温疋 1 日置吉翌日次O操作忙移oTo,422 時間程度力最哲高効率总示r。 42C力滋遺伝子導入効率总上厅送O力M比去疋初力、oTU、肚X。）8.乙O20 分間忙説明总行头9.42静置L尢酵母-DNA 混合液总最少培地o新LX滅菌済入求彳卜总袋力、5出L,酵母-DNA 混合液总 23 回入求彳卜疋吸o尢出LLT混合後， 乞O全部总最少培地QO中心V液总尢5r。 尢5L尢5 r7夕总Lo10.?xyu-?疋液总卜上V均一V引吉伸fr。/一卜总回L肚力*5X7U一前後V動力、Pf均一V広力爲。水分力残oTX引吉伸fL乾X尢後引吉

29、伸fLr菌总取除注意 力必要。壬r老社禁物r。弓建伸frr7夕总r。酵母工房227夕总長X間空疗肚X乙七哲重要。空気中微生物力混入歹10.対皿名前总書。11. 室温疋 3- 7 日，白XH口二一力現置X疋指。Z, 28C力 30CO恒温庫，約 2 日T現n。混入。尢酵母以外微生物力現冷蔵 庫忙入必要力卷召。力丄力混入力IT覆nruoT注意。生徒毎日力、，2 日遺伝子力入二尢酵母力現nTo観察总考 !匕卜七酵母菌n5x似疋x七思X去r力、？匕卜ODNAZ酵母菌ODNAn5X違X力笳召TO/力、? 匕卜o遺伝子总酵母菌思X去r力、？肚遺伝子总肚生物忙入n役忙立OTL?発展実験? 酵母菌o顕微鏡観察

30、?DNA总取出r実験?DNAO暗号解読演習? 彳A夕一遺伝子情報o収集酵母工房23第二回遺伝子導入酵母観察第二回的実験流料5 分概要説明T最小培地観察m口二一数計測活性検出準備T講義用意 i九 r分） 遺伝子導入酵母口口二一 生育。尢最少培地 培地儿一用意実験室v）導入前酵母菌? 観察D。最小培地忙白Z小总肚哲上力二尢丸点現料于。個6点总口口二一七呼恳。冬場m気温力低吃酵母菌成長力.遅 口二一力小一日二日待現料亠一003口二一七一個O酵母菌力生育LH吉疋、。口 口二一O中 口比 100 万以上O酵母菌力増殖LTol口二一总遺伝子導入汁尢酵母菌力* 一尢乙七总示歹OI,口 口二一O数力遺伝子導入

31、O効率总示 尢力oT,口 口二一O数力侈、吃効率（遺伝子力取込去料尢乙七总示T。口二一O数元方,7U-b裏返LT,7U-bO底力、5 3口二一总観察L Toyy口二一点总打5数元召七数元間違写 真）。多、場合总 4 分割LT一分割分总数元 4 倍ro乙料50最小培地O増殖L尢酵母吃遺伝子同時忙導入总料TWV吃总酵母菌总持亍曲、叽，新尢吃总持弐总分解T5能力力M寸与酵母菌力作製料尢乙七忙肚。次遺伝子導入酵母菌力本当吃总持o尢力、力、总調7-活性検出準備（10 分）活性検出含有培地疋酵母菌总増殖35 分1枚（写真）1枚2本1本酵母工房241.培地側忙廿彳点总2。書吉去歹（写真）。乞D，残vc七記入

32、ro2.遺伝子導入M 尢酵母菌口二一O数個总儿一7疋七0,乞料总培地OD点忙合培地上V5 mnK5O円形V塗召（人肚形状疋哲問題夕总ro3.導入前酵母菌总C点上忙同様忙 5 mm、m、O円形忙塗T7夕总r。4.室温（28C30C）静置ro翌日力活性検出可能疋笳召1 週間指考代刃空気中壬口O中已微生物思去rm?殺菌乙七？口口二一v肚召七酵母菌哲目疋見元去rn口二一酵母菌力、召七思 遺伝子力導入Severn何？疋液中oee分解酵素TWV吃消化七吸収細胞七酵素反応肚乂発展実験? 空気中微生物O検出実験? 遺伝子導入効率忙与元召温度，時間O影響酵母工房25第三回活性検出第三回的実験流料用意ro（i尢分

33、）酵母塗oee培地i 枚仆i 本発色液1 本（3 ml ）培地忙塗布。尢酵母菌力卜忙白増殖LTTTO07素总反応总検出LTO1.酵母总塗二尢培地7夕总笳。九2 ml 程度発色液总入求彳卜疋2 酵母菌OO周V乞二七落七LT（写真）。7U卜总振乙肚S/QO素 u 沁反応力始去卜力紫色总示rToL,7wv吃導入酵母周加比透明or（写真）乙透明帯总八口七呼恳。L力、L,c 導入前酵母株周透明帯八口力ywv吃活性总 示TO酵母菌力、 分泌总料尢ywv吃力*分解酵母菌o周素反応疋紫色検出总no,ee培地上疋培養L尢ywv吃总持酵母七乞o周QH素液（発色液）总力、疗召七酵母菌o周囲eeo透明Q肚召力yywv

34、吃总持尢肚S酵母菌o周总紫色（写真）。注意：紫色总時間力.経七消元召力，乞o場合一度発色液色力wOL，酵母菌力発色液疋流状態总維持疋吉肚SO声夕儿 力yv写真总撮OT/SO5 分概要説明吃活性検出（10 分）T35 分講義（発展実験哲可能）酵母工房 26考元胃腸薬了一肚生物発展実験? 疋液OTWV吃検出実験? 胃腸薬OTWV吃検出実験?TWV吃总使二尢酵素反応実験生物学处日進化LTT。生物科学O進歩处私/cO生活哲大吉変元m、 吉去歹。高校学恳生物学哲，化学哲，分子的肚生命科学t関内容总大幅t増 壬LT、去T。特t,遺伝子壬夕質七、巧化学的分子力、5細胞壬個体总理解 分子生物学O知識O習得力乙

35、料力、50生物学m必須O科目七肚去T。一方,生物学总覚元召乙七力*多、匕思生徒力多力、。理科总，考元召乙七力*大切IT。実験总通LT,考元召喜厂总知召乙七力*理科O醍醐味思、去T。科学?七疑問总発T5七乙勺力、5始去去T。小总肚子供O頃toC好奇心力，中学，高校oTton TLL去二T、肚、L/T力、。子供dt学恳喜厂壬，去疋初力、5肚、疑 問总解喜厂总体験実験IT。乙O丰少卜总山口大学工学部応用化学工学科O学生七一緒t作oCOTo c,研究室oyy-fe卒業研究壬修士論文研究疋忙L、肚力、，丰少卜作製总手伝oTnLC。皆wet感謝致L去T。先生方Of意見壬、感想力新L、生命科 学O教育壬発展

36、t必要IT。是非，庄意見庄感想总寄乜疋、。最適温度，最適pH酵母工房27参考書酵母究極細胞柳田充弘編木才生物学S/U-X共立出版 2200 円暮。中酵素太田隆久著科学 19 東京化学同人 1200 円遺伝子組換元食品新食材科学日本農芸化学会編発見物語山嶋哲盛著 岩波二7生化学夜明疗醱酵謎总追。疋 丸山工作著 中公新書 700 円丿口卜少一儿儿木?X著学会出版七A夕一人忙役立微生物日本農芸化学会編5LO中化学七生物 8 学会出版七A夕一 1800 円会出版七A夕一1600 円DNA農業岡田吉美著共立出版1600 円彳A夕一木卜廿彳卜http:/www.yeastgenome.org/http:/

37、 微生物 改訂版 円生物工学実験書 改訂版日本科学先駆者高峰譲吉新書 780 円日本農芸化学会編二AL）0.5 % 硫酸7A壬二少厶2%力 572%寒天才一卜夕一7120C,15 分。乙培地忙肚栄養入二TX肚So発色液0.1%素，1%化力UA発色液液总似尢成分Toyy液总10 倍希釈LTfe同様結果力得5nTopH 6.0 （20 mM 夕工A酸七 40 mM】丿酸总pH6）忙上記成分总溶力、To才一卜夕一7酵母工房30酵母菌電子顕微鏡像酵母菌光学顕微鏡像7-遺伝子cDNA 配列atgatggtcgcgtggtggtctctatttctgtacggccttcaggtcgcggcacctgctt

38、tggctgcaacgcctgcggactggcgatcgcaatccatttatttccttctcacggatcgatttgcaaggacggatgggtcgacgactgcgacttgtaatactgcggatcagaaatactgtggtggaacatggcagggcatcatcgacaagttggactatatccagggaatgggcttcacagccatctggatcacccccgttacagcccagctgccccagaccaccgcatatggagatgcctaccatggctactggcagcaggatatatactctctgaacgaaaactacggcactgcagatg

39、acttgaaggcgctctcttcggcccttcatgagagggggatgtatcttatggtcgatgtggttgctaaccatatgggctatgatggagcgggtagctcagtcgattacagtgtgtttaaaccgttcagttcccaagactacttccacccgttctgtctcattcaaaactatgaagatcagactcaggttgaggattgctggctaggagataacactgtctccttgcctgatctcgataccaccaaggatgtggtcaagaatgaatggtacgactgggtgggatcattggtatcgaactact

40、ccattgacggcctccgtatcgacacagtaaaacacgtccagaaggacttctggcccgggtacaacaaagccgcaggcgtgtactgtatcggcgaggtgctcgacggtgatccggcctacacttgtccctaccagaacgtcatggacggcgtactgaactatcccatttactatccactcctcaacgccttcaagtcaacctccggcagcatgcacgacctctacaacatgatcaacaccgtcaaatccgactgtccagactcaacactcctgggcacattcgtcgagaaccacgacaacc

41、cacggttcgcttcttacaccaacgacatagccctcgccaagaacgtcgcagcattcatcatcctcaacgacggaatccccatcatctacgccggccaagaacagcactacgccggcggaaacgaccccgcgaaccgcgaagcaacctgggcttcgggctacccgaccgacagcgagctgtacaagttaattgcctccgcgaacgcaatccggaactatgccattagcaaagatacaggattcgtgacctacaagaactggcccatctacaaagacgacacaacgatcgccatgcgcaagg

42、gcacagatgggtcgcagatcgtgactatcttgtccaacaagggtgcttcgggtgattcgtataccctctccttgagtggtgcgggttacacagccggccagcaattgacggaggtcattggctgcacgaccgtgacggttggttcggatggaaatgtgcctgttcctatggcaggtgggctacctagggtattgtatccgactgagaagttggcaggtagcaagatctgtagtagctcgtga酵母工房31遺伝暗号表TTTFTCTSTATYTGTCTTCFTCCSTAC :YTGCCTTALTCASTAAST

43、OPTGASTOPTTGLTCGSTAGSTOPTGGWCTTLCCTPCAT1HCGTRCTCLCCCPCACHCGCRCTALCCAPCAAQCGARCTGLCCGPCAG1QCGGRATTIACTTAATNAGTSATCIACCTAAC1NAGCSATAIACATAAAKAGARATGMACGTAAGKAGGRGTT可GCTAGATDGGTGGTCVGCCAGACDGGCGGTAVGCAAGAA；EGGAGGTGVGCGAGAGEGGGG酵母工房 327-遺伝子配列七翻訳SCTW 丿酸配列（数字：塩基番号/77 酸番号）1/1 31/11atg atg gtc gcg tgg tgg t

44、ct cta ttt ctg tac ggc ctt cag gtc gcg gca cct gct ttgM M V A W W S L F L Y G L Q V A A P A L 61/2191/31gct gca acg cct gcg gac tgg cga tcg caa tcc att tat ttc ctt ctc acg gat cga tttA A T P A D W R S Q S I Y F L L T D R F121/41151/51gca agg acg gat ggg tcg acg act gcg act tgt aat act gcg gat cag aa

45、a tac tgt ggtA R T D G S T T A T C N T A D Q K Y C G181/61211/71gga aca tgg cag ggc atc atc gac aag ttg gac tat atc cag gga atg ggc ttc aca gcc GT W Q G I I D K L D Y I Q G M G F T A 241/81271/91atc tgg atc acc ccc gtt aca gcc cag ctg ccc cag acc acc gca tat gga gat gcc tac I WI T P V T A Q L P Q T

46、T A Y G D A Y 301/101 331/111cat ggc tac tgg cag cag gat ata tac tct ctg aac gaa aac tac ggc act gca gat gac HG Y W Q Q D I Y S L N E N Y G T A D D 361/121391/131ttg aag gcg ctc tct tcg gcc ctt cat gag agg ggg atg tat ctt atg gtc gat gtg gttL K A L S S A L H E R G M Y L M V D V V421/141451/151gct aa

47、c cat atg ggc tat gat gga gcg ggt agc tca gtc gat tac agt gtg ttt aaa ccgA N H M G Y D G A G S S V D Y S V F K P481/161511/171ttc agt tcc caa gac tac ttc cac ccg ttc tgt ctc att caa aac tat gaa gat cag actF S S Q D Y F H P F C L I Q N Y E D Q T541/181571/191cag gtt gag gat tgc tgg cta gga gat aac ac

48、t gtc tcc ttg cct gat ctc gat acc accQ V E D C W L G D N T V S L P D L D T T601/201631/211aag gat gtg gtc aag aat gaa tgg tac gac tgg gtg gga tca ttg gta tcg aac tac tcc K DV V K N E W Y D W V G S L V S N Y S 661/221691/231att gac ggc ctc cgt atc gac aca gta aaa cac gtc cag aag gac ttc tgg ccc ggg t

49、ac I DG L R I D T V K H V Q K D F W P G Y 721/241751/251aac aaa gcc gca ggc gtg tac tgt atc ggc gag gtg ctc gac ggt gat ccg gcc tac act NK A A G V Y C I G E V L D G D P A Y T 781/261811/271tgt ccc tac cag aac gtc atg gac ggc gta ctg aac tat ccc att tac tat cca ctc ctcC P Y Q N V M D G V L N Y P I Y

50、Y P L L 841/281 871/291酵母工房 33aac gcc ttc aag tca acc tcc ggc agc atg cac gac ctc tac aac atg atc aac acc gtcN A F K S T S G S M H D L Y N M I N T V 901/301 931/311aaa tcc gac tgt cca gac tca aca ctc ctg ggc aca ttc gtc gag aac cac gac aac ccaK S D C P D S T L L G T F V E N H D N P 961/321 991/331cg

51、g ttc gct tct tac acc aac gac ata gcc ctc gcc aag aac gtc gca gca ttc atc atcR F A S Y T N D I A L A K N V A A F I I1021/3411051/351ctc aac gac gga atc ccc atc atc tac gcc ggc caa gaa cag cac tac gcc ggc gga aac L N D G I P I I Y A GQ E Q H Y A G G N 1081/3611111/371gac ccc gcg aac cgc gaa gca acc t

52、gg gct tcg ggc tac ccg acc gac agc gag ctg tac D P A N R E A T W AS G Y P T D S E L Y 1141/3811171/391aag tta att gcc tcc gcg aac gca atc cgg aac tat gcc att agc aaa gat aca gga ttcK L I A S A N A I R N Y A I S K D T G F1201/4011231/411gtg acc tac aag aac tgg ccc atc tac aaa gac gac aca acg atc gcc

53、atg cgc aag ggc V T Y K N W P I Y KD D T T I A M R K G 1261/4211291/431aca gat ggg tcg cag atc gtg act atc ttg tcc aac aag ggt gct tcg ggt gat tcg tatT D G S Q I V T I L S N K G A S G D S Y1321/4411351/451acc ctc tcc ttg agt ggt gcg ggt tac aca gcc ggc cag caa ttg acg gag gtc att ggcT L S L S G A G

54、Y T A G Q Q L T E V I G 1381/461 1411/471tgc acg acc gtg acg gtt ggt tcg gat gga aat gtg cct gtt cct atg gca ggt ggg ctaC T T V T V G S D G N V P V P M A G G L1441/4811471/491cct agg gta ttg tat ccg act gag aag ttg gca ggt agc aag atc tgt agt agc tcg tga P R V L Y P T E K L A GS K I C S S S *ODNA配列总

55、正確 mRNA&基尢 cDNA 配列疋歹。染色体上遺伝子配列口力笳召乙翻訳示歹乙吉去家 DNA&S実験遺伝子生命設計図歹。遺伝子 DNAZ呼瓜料S物質 人t植物t微生物t,TTO生物总，同匕DNA設計図忙用TTo乙実験m,DNA 总魚白子力、乙取出。去TolT,肚t肚刁力、。取出。尢 DNA 刀中,魚总作上厅送情報力詰oTT 同匕DNATTO生物忙含nTT，生物总作上厅爲設計図忙肚oTSS乙七总理解JT下”。酵母工房 34O用意TStO?鱈（/c5）O魚O白子50-100 g-魚屋忙注文Tnf手忙入去To指鍋C最適。冷凍庫疋保存可能。io g充分。?台所用洗剤？-S/3（P&G 总使oTT。他

56、O洗剤It可能T?工夕丿一儿-薬屋疋買元SZ思“去T。 98-99%OtO。特級t一級It可。 ?水-脱彳才A水。水道水It可。?混StO-箸txb口一tA七少卜It肚乂肚et/S。容器。透明疋観察。壬Tsto。?二一儿袋-白子。手廿彳兔力N/S。声少八一力NOSTSSZ便利。O方法1）白子总 1g程度，小指O先怎,总丄二一儿袋忙入nT指壬手 30 秒力 1 分、5SO恳。去T。後，水总 20mI 迄S入nS（容器半分量）。2）O恳n尢液总少移L去T。乙O時笳去，粒总入ns気总o去T。3）新LSyOn液总入求彳卜2ml移L,乞乙V水总20 mlsn去T。4）乙O中忙声m彳总 4,5 滴5L,力

57、佬混它去T。乙O時肚変化力笳S力、总観察L去T。 乙乙,声m彳力.油总溶力、TOI少L透明忙肚S乙七力観察 疋吉SZ思S去T。5）入oTSS液O2倍量（20 ml540 mlO工夕丿一儿容器全量）总液O上V載SV入n去T。6）乞n总箸肚左，o力、吉混PT族T下FS。疋人疋人箸O周f9VQt状OtO力* 巻吉付STSOS思S去T。乙n力*DNAT。7）DNA観察LT族T下S。大変長SQt状O物質TS力、力T力、。8）SS3）O量总増PT力、減5LT族T疋FS。通常減5L尢力刁去S吉去T。酵母工房 34連絡先山口大学工学部応用化学工学科 生物機能応用化学研究室755-8611宇部市常盤台 2-16-1赤田倫治星田尚司TEL:0836-85-9292FAX:0836-85-9201e-mail:rinjiyamaguchi-u.ac.jpWeb: http:/ge netic.e ng.yamaguchi-u.ac.jp改訂 2007 年 6 月 18 日