动物基因工程课程论文

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1、青岛农业大学动物基因工程课程论文题 目： 核酸分子杂交技术 姓 名： 学 院： 动物科技学院 专 业： 班 级： 学 号： 任课教师： 闵令江 二一二年四月二十日核酸分子杂交技术闵令江 闵令江摘要：核酸分子杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术，其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(RNA)片段按碱基互补关系形成杂交双链分子。杂交双链可以在DNA链和DNA链之间，也可以在RNA链和DNA链之间形成。杂交的实质就是在一定条件下使互补的核酸链实现复性，使双螺旋解开成为单链。变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链的无规则线团，使核酸的某些光学性质和流体力学性质发生改变，有时

2、部分或全部生物活性丧失，并不涉及共价键的断裂。复性指变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构的过程。核酸分子杂交具有灵敏度高、特异性强等优点，主要用于DNA或RAN的定性、定量检测。该技术已取得巨大突破，在医学诊断中应用广泛，而且DNA芯片技术已取得显著成就。关键词：核酸分子 杂交 变性 复性 应用+Nucleic acid member hybrid technology majoring in Animal Medicine Name GaoZhiCan MiLingJiang MiLingJiangAbstract: Nucleic acid hybridizati

3、on in nucleic acids research is one of the most basic experimental technique, its basic principle is the application of nucleic acid denaturation and refolding of the nature, sources of DNA (RNA) fragment bases complementary relationship forming hybrid double-stranded molecules. Hybrids between doub

4、le-stranded DNA DNA chain and chain, can also be formed between the DNA and RNA chains chains. Nature of the hybrid is the complementary nucleic acid chain under certain conditions of realization of complex, make double helix solved a single chain. Modified double helix of nucleic acids hydrogen bon

5、ds break, into a single chain of random coil so changed for some optical properties and fluid mechanics properties of nucleic acid, sometimes partial or total loss of biological activity, does not involve the breaking of covalent bond. Refolding of denatured DNA under appropriate conditions, two sep

6、arate chains of association become the double-helix structure of process again. Nucleic acid hybridization with high sensitivity, specificity, and other advantages, mainly for qualitative and quantitative detection of DNA or RAN. The technology have made great breakthrough, widely used in medical di

7、agnosis and DNA Microarray Technology has made remarkable achievements.Key words: Nucleic acid molecules Hybrid Degeneration Renaturation Application 引言1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆技术的出现、质粒和噬菌体DNA的构建成功、核酸自动合成仪的诞生，大大核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两

8、种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体支持物的支持物上，另一条参加反应的核酸链则游离在溶液中。常用的固相杂交类型有菌落原位杂交、斑点杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和组织原位杂交。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。液相杂交是一种研究最早且技术较复杂的杂交类型，不如固相杂交那样应用普遍，主要是因为杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。因此在此主要介绍固相分子杂交类型及其应用。一、斑点杂交1、概述斑点杂交首先由Kafatos等发展起来，用于在同一固相支持

9、物上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出的信号的强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，确定待测样品中靶序列的量。斑点杂交的原理是将DNA或RNA变性后直接点样吸附于固相支持滤膜上，即印迹之后，膜作变性和中和处理，用UV照射尼龙膜或用烘烤法处理纤维素膜，将DNA固定。然后用标记探针与之杂交，洗涤去除未反应的探针，采用放射自显影或显色反应检测显示杂交信号，分析结果。将核酸样品点种于固相支持滤膜上，可采用手工直接点样或采用真空抽滤加样器。后者点样准确方便。2、杂交方法【1】（1）、材料20SSC,甲醛，去离子甲酰胺。10%SDS,20

10、Denhardt液，1mol/L磷酸一氢钠（PH7.0）,底物缓冲液，亲和素-碱性磷酸酶，5-溴-4-氢-3-吲哚乙酸，淡蓝四唑等。其他还有恒温水浴锅、同位素探测仪、自动光密度扫描仪、真空抽滤加样器、恒温摇床、移液器、印迹等。（2）、操作步骤和方法 样膜的制备a.核酸样品的预变性 所取DNA及RNA样品的量视情况而定，一般可加1020ug. b.尼龙膜的预处理 c.点样 d.固定 预杂交 杂交 a.配制杂交液 b.探针变性 c.杂交 洗膜 放射自显影 结果观察 根据曝光点的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及用量的多少。利用自动灰度扫描仪扫描曝光点，计算光密度值，可以进行半定量分析。对光敏生物

11、素标记DNA探针的斑点杂交，出现蓝紫色斑点者为阳性，未着色者为隐性。根据着色的深浅可以判定目的基因的多少。（3）、注意事项DNA的变性 斑点印迹的关键是DNA在转录后要完全变性，至少所有样品的变性程度要一致。DNA样品的纯度 用Southern转移时，电泳步骤有利于把杂质分出去，剩下要转移的DNA就比较干净。固相支持膜的选择 理想的膜应符合以下要求：a.具有较强的结合核酸分子的能力；b.与核酸分子的结合稳定牢固；c.与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；d.非特异性吸附少；d.具有良好的机械性能。（4）、斑点杂交的应用 【2】现在已有众多学者应用该方法进行分支杆菌及其他病原菌的检测

12、和种属鉴定，均取得了较敏感的检测结果。同时应用该方法检测序列变异时，若靶序列内存在突变，则其扩增产物在严格的条件下无法与探针杂交，无杂交信号就表示目的基因存在突变。近年来研究应用于单个碱基突变基因的诊断方法，其最大的特点就是简便、快速而分辨率高。其最突出的优点是进行一个标本的基因分型只需1次杂交即可完成配合快速的DNA提取方法及电脑分析软件得出，可以在一个工作日内完成所需的分型工作。二、Southern印迹杂交1、Southern印迹杂交的基本原理【3】Southern印迹杂交指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上，再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。其基

13、本过程包括：样品DNA的限制性内切酶水解，水解片段的琼脂糖凝胶电泳分离，分离后水解片段的转移，特异性的DNA片段的分子杂交，探针在杂交前用放射性标记或酶学标记，最后采用放射自显影或化学发光法进行检测。2、Southern印迹法的基本过程【4】（1）、DNA样品的酶切和电泳a.用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品；b.琼脂糖凝胶电泳（2）、准备用于转移的凝胶（3）、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 a.缓冲液的配制；b.准备转移用膜；c.固定DNA于膜上 （4）、探针标记（5）、杂交 a.缓冲液及溶液 磷酸-SDS洗液 SDS洗液 预杂交/杂交液；b.预杂交；c.杂交（6）、洗膜 取出NC

14、膜，在2SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜： 2SSC/0.1%SDS,42摄氏度，10min 1SSC/0.1%SDS,42摄氏度，10min 0.5SSC/0.1%SDS,42摄氏度，10min 0.2SSC/0.1%SDS,56摄氏度，10min 0.1SSC/0.1%SDS,56摄氏度，10min实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高12倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程中无论哪一步到达终点。都必须停止洗膜。（7）、杂交结果的检测 a.放射性核酸标记探针的检测 洗膜结束后，将洗完的膜浸入2SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。将膜正面向上，放入

15、暗箱中，经磷钨酸钙增感屏前屏置于滤膜下，光面向上。在暗室的红光下，将两张X射线胶片压在杂交膜上，再压上增感屏后屏，光面向X射线胶片。合上暗盒，置-70摄氏度低温冰箱中曝光。根据放射性的强度曝光一定时间后，在暗箱中去除X射线胶片，显影、定影，一般用13天时间。洗片时，先洗一张X射线胶片，若感光偏弱，则多加两天曝光时间，再洗第二张片子。b. 非放射性核酸标记探针的检测（8）、杂交膜的重复使用将结合有探针的杂交膜浸入大量的洗脱液中，75摄氏度下温育2h或在含有50%的甲酰胺与2SSPE的溶液中于65摄氏度下保温1h.然后取出杂交膜，在室温下用0.1%SSPE短暂漂洗，再将杂交膜置于纸巾上。除去大部分

16、液体。用保鲜膜包裹。置暗箱中进行放射自显影，以检查是否所有探针已被除去，如果没有杂交信号，说明探针已被洗脱干净，可以用于第二轮杂交或干燥后保存备用。（9）、注意事项a.杂交膜只能用干净的平头镊子接触，不可接触手指，否则将造成背景问题。b.电泳结束后，应该确定酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、DNA样品有无降解等。c.硝酸纤维素膜只能通过彻底干燥来进行固定，干燥后核酸与硝酸纤维素膜通过疏水相互作用力结合在一起，相互之间的结合力较弱。d.杂交体系的体积越小，效果越好。e.杂交膜上出现斑点可能是由于封闭液中封闭剂浓度过低或封闭缓冲液配制时间过长，不能封闭杂交膜上的非特异性位点。f.采用毛细管转移法

17、进行核酸转移时，用prarfilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，依次作为屏障，阻止液体自流池直接流至凝胶上方的纸巾层中，纸巾对方不整齐容易从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中核酸转移效率下降的主要原因。3、Southern杂交的应用进展【5】不同个体在DNA结构上存在着差异，在不编码蛋白质的区域及没有重要调节功能的区域，DNA结构的个体差异更为明显。基因组中一个特定的基因座位若存在两种或两种以上的状态，而且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于10%，这一现象称为多态性。DNA多态性本质上是染色体DNA中核苷酸数目或排列顺序的个体差异。（1）、限制性片段长度多态性（RE

18、LP）这种在同种生物不同个体间出现不同长度限制性片段的类型，称为限制性片段长度多态性（RELP）。RELP具有极广泛的用途，利用广泛分布的RELP作为遗传标记可以称为对人类基因组制图的基础。当多态性顺序与人类遗传病基因位点相连锁时，可以作为遗传缺陷的产前诊断或鉴别杂合子携带者的标记，以及用于亲子鉴定和群体研究等。主要方面包括：生物体基因分型、分亚型；癌基因分析；遗传病的诊断HLA分型及遗传结构分析。（2）、可变串联重复多态性（VNTR）人类基因组含有一些DNA重复序列家族，有些重复序列分散在基因组中，有些是以一系列短的串联重复序列组成高变区，其串联；串联重复序列拷贝数可以相差很多，即出现可变数

19、的串联重复，因而高变区的长度变化很大，使高变区两侧限制性内切酶识别位点的固定位置随高变区的大小变化而发生相对位移，造成RELP,称为VNTR多态性。迄今为止，VNTR的研究方法主要有四种：DNA指纹图谱法、VNTR-RELP分析法、模板PCR扩增后的RELP或寡核苷酸探针（ASO）检测法以及PCR扩增片段长度多态性分析法。（3）、扩增片段长度多态性(AELP)该法的分辨率、灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳、放射性自显影的方法，并且操作时间短，一般2h即可完成。他几乎克服了Southern印迹杂交技术中的所有缺点，使VNTR在琼脂糖电泳中连续分布的等为基因片段变成单独分离的片段，使原来无法用Hard

20、y-weinberg公式进行计算的基因频率估计称为可能。因此，该技术在遗传病诊断、基因定位，尤其是法医学上的应用日益广泛。三、Northern印迹杂交1、Northern印迹杂交的基本原理【6】 与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物上，再用放射性标记的DNA探针或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影。以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的含量。2、杂交方法【7】Northern杂交方法是单一基因表达分析的首先方法。经过二十多年的发展，No

21、rthern杂交方法比以前有了较大改进，其操作方法变得更加简单，时间也比以前缩短了，其基本操作过程分以下几大步骤：RNA的变性和分离RNA转移至固相支持物中固相RNA与探针分子杂交对特异结合的探针分子进行检测和分析。3、northern杂交的应用与进展【8】RNA凝胶印迹分析即Northern杂交分析，是分子生物学最常用的研究基因表达的方法。它可以将恒定的mRNA水平量化，同时给出相关的RNA是否存在、分子大小以及离散的RNA种类间的整体性等信息。近年又出现了一些可以定量检测RNA的更灵敏的技术，如核酸酶保护分析、RT-PCR等方法，但这些技术只是Northern杂交方法的补充而并非取代。No

22、rthern杂交仍被看作是mRNA研究的标准操作，以为它相对简单并且可获得关于mRNA的多种信息。（1）、反向Northern杂交和Northern杂交筛选mRNA表达（2）、高通量反向Northern印迹杂交和Northern杂交四、原味杂交1、基本原理【9】原位核酸分子杂交技术简称原味杂交（ISH）,是应用序列已知并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基互补配对原则特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜下进行观察，从而对组织细胞中的待测核酸进行定性、定位和相对性定量的一种研究方法

23、。原味杂交属于固相核酸分子杂交的范涛，但它区别于固相核酸分子杂交中其他任何一种核酸分子杂交技术。原味杂交可检测形态保存完整的染色体、细胞或组织切片中的特异核酸序列，与免疫细胞化学结合时，原位杂交还可将显微拓扑学信息与DNA、mRNA及蛋白质水平的基因活动联系起来，为从分子水平研究细胞内基因表达及基因调控提供了有效的工具，是组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。2、原味杂交技术的基本方法【10】原位杂交技术主要涉及四个方面：杂交前准备，包括玻片准备、组织的固定及预处理、预杂交；杂交；杂交后处理，涉及杂交后的清洗；显示及结果观察，显示包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。（1）

24、、破片准备和组织固定玻片包括盖玻片和载玻片，应用热肥皂水清洗，用自来水清洗干净后，置于清洁液浸泡24H，清水洗净烘干，95%乙醇中浸泡24H后用蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150摄氏度或以上，过夜以除去任何RNA酶。为保持细胞形态结构的完整及其DNA或RNA含量及位置尽可能的稳定，被测的生物样品必须固定。DNA比较稳定而RNA很容易降解，对于DNA的固定来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。（2）、样品的预处理 内源性酶的灭活；RNA酶的处理；盐酸处理；去污剂处理；蛋白酶处理（3）、预杂交为防止背景污染，有时要进行预杂交。预杂交液和杂交液比较起来只是不含探针和硫酸葡萄糖，其他成分相同。如果

25、检测染色体DNA，预杂交及杂交中的DNA必须先变性，但变性处理可能破坏染色体的形态，实际操作时，必须找到适当的方法在杂交信号与形态间取得平衡。（4）、杂交杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片以防止孵育过程中杂交液的蒸发，然后将玻片放在湿盒中进行孵育。（5）、杂交后的清洗杂交后的清洗是为了除去非特异性的杂交，即探针与部分同源序列的结合、这种非特性杂交会干扰特异的杂交信号。由于这种杂交体的稳定性不及完全互补配对的杂交体，控制杂交后洗脱液的严谨度就可以除去非特异的杂交，即采用系列不同浓度、不同温度的盐溶液逐步漂洗。（6）、免疫学检测根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统

26、进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。3、原位杂交的应用方向 原位杂交区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。其他杂交方法正能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；

27、对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排列；与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。五、菌落原位杂交【11】菌落原味杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释放出的DNA。将DNA烘干固定于膜上与磷32标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。实验步骤如下：将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平血琼脂培养基上，用无菌牙签挑去单菌落种于滤膜和主琼脂平板上 ，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。培养细菌至产生12mm大小的菌落。

28、在一块平血中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面朝上，注意防止在滤膜底面存有气泡。5min后，将滤膜转至用变性溶液，（0.5mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-NaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。将滤膜转至中和溶（0.5mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-HCL，Ph8.0）浸湿的滤纸上，放置10min。重复中和一次。将滤膜移至用2SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE配成20贮备液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(Ph7.4),20mmol/L EDTA(Ph7.4

29、)。将滤膜将滤纸吸干，80摄氏度真空烘干2h。致谢:化学工业出版社及生物-医药出版社联合出版的核酸分子杂交技术参考文献：1 疯作化，皇甫永穆主编，医学分子生物学。第2版，武汉：武汉出版社，20002 黄培堂等译，分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，20023 Kroczek R A. Southern and northern analysis. J Chromatogra phy,1993,618(12):1331454 Kido C, Murano S,Tsuruoka M. Rapid and simple detection of PCR product DNA: a comp

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